Régulation transcriptionnelle du gène SMN1 dans les cellules embryonnaires P19 de souris

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Régulation transcriptionnelle du gène SMN1 dans les cellules embryonnaires P19 de souris

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le diabète maternel influence la morphogenèse rénale et la programmation périnatale

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel.

Rôles des interactions entre loci dans l'organisation spatiale fonctionnelle et l'évolution des génomes de mammifères

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôles des interactions entre loci dans l'organisation spatiale fonctionnelle et l'évolution des génomes de mammifères

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'utilisation des cellules souches embryonnaires à des fins thérapeutiques

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maîtrise en droit (L.L.M.) Option recherche"

La dérivation de cellules souches embryonnaires chez le cheval

Les cellules souches embryonnaires (ES) sont porteuses de grands espoirs en recherche biomédicale dans le but d’apporter un traitement définitif à l’ostéoarthrose. Parce que certaines articulations des chevaux sont similaires à celles des humains, cet animal représente un modèle important dans l’évaluation de stratégies de régénération du cartilage. Cependant, pour expérimenter un traitement par les cellules ES chez le cheval, des cellules ES équines (eES) n’ont toujours pas pu être dérivées. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette étude est de dériver des lignées de cellules eES. Le premier objectif de notre étude consiste à optimiser la technique de dérivation des cellules eES. Nous démontrons que la lignée de cellules nourricières et le stade de développement des embryons influencent l’efficacité de la technique de dérivation tandis que l’inhibition de voies de signalisation menant à la différenciation des cellules ES ne l’influence pas sous nos conditions. Le deuxième objectif de notre étude est de caractériser de façon plus approfondie les lignées de cellules eES obtenues. Nous démontrons que les cellules eES dérivées expriment autant des marqueurs associés aux cellules pluripotentes qu’aux cellules différenciées et que l’inhibition de voies de signalisation menant à la différenciation n’influence pas l’expression de ces marqueurs. Pour conclure, nous confirmons avoir dérivé des lignées de cellules semblables au cellules eES (eES-like) ne correspondant pas complètement aux critères des cellules ES.

La dérivation de cellules souches embryonnaires chez le rat, Rattus norvegicus

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le peptide natriurétique auriculaire induit la différenciation cardiaque dans les cellules souches embryonnaires carcinomateuses de souris P19

Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP. Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western. Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels. Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire.

Identification de déterminants impliqués dans la différenciation des cellules souches embryonnaires

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC.

Activité des cellules souches : identification de nouveaux effecteurs dans le système hématopoïétique

Les cellules souches somatiques présentent habituellement un comportement très différent des cellules souches pluripotentes. Les bases moléculaires de l’auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires ont été récemment déchiffrées grâce à la facilité avec laquelle nous pouvons maintenant les purifier et les maintenir en culture durant de longues périodes de temps. Par contre, il en va tout autrement pour les cellules souches hématopoïétiques. Dans le but d’en apprendre davantage sur le fonctionnement moléculaire de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, j’ai d’abord conçu une nouvelle méthode de criblage gain-de-fonction qui répond aux caprices particuliers de ces cellules. Partant d’une liste de plus de 700 facteurs nucléaires et facteurs de division asymétrique candidats, j’ai identifié 24 nouveaux facteurs qui augmentent l’activité des cellules souches hématopoïétiques lorsqu’ils sont surexprimés. J’ai par la suite démontré que neuf de ces facteurs agissent de manière extrinsèque aux cellules souches hématopoïétiques, c’est-à-dire que l’effet provient des cellules nourricières modifiées en co-culture. J’ai également mis à jour un nouveau réseau de régulation de transcription qui implique cinq des facteurs identifiés, c’est-à-dire PRDM16, SPI1, KLF10, FOS et TFEC. Ce réseau ressemble étrangement à celui soutenant l’ostéoclastogénèse. Ces résultats soulèvent l’hypothèse selon laquelle les ostéoclastes pourraient aussi faire partie de la niche fonctionnelle des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. De plus, j’ai identifié un second réseau de régulation impliquant SOX4, SMARCC1 et plusieurs facteurs identifiés précédemment dans le laboratoire, c’est-à-dire BMI1, MSI2 et KDM5B. D’autre part, plusieurs indices accumulés tendent à démontrer qu’il existe des différences fondamentales entre le fonctionnement des cellules souches hématopoïétiques murines et humaines.

Dérivation de cellules souches pluripotentes induites autologues à partir du clonage somatique équin

Le recours aux cellules souches pour améliorer la réparation et guérison des blessures et maladies musculosquelettiques chez le cheval est de plus en plus fréquent. Les développements récents dans la reprogrammation cellulaire ont permis le développement de nouvelles sources de cellules souches pour ces thérapies régénératives. Des cellules souches pluripotentes induites (iPS) autologues peuvent être dérivées de cellules adultes par la reprogrammation directe à travers l'expression induite des gènes de pluripotence. Le clonage par transfert nucléaire (SCNT) suivi de la dérivation de cellules souches embryonnaires (ES) permet la reprogrammation indirecte des cellules adultes. Cependant, l’efficacité de ces deux méthodes pour la dérivation de cellules pluripotentes génétiquement stables est faible. Nous avons donc combiné les techniques SCNT et iPS dans le but de développer un protocole efficace de dérivation de cellules iPS autologues à partir de fibroblastes de la peau équine. Quatre facteurs de reprogrammation ont été introduits dans les cellules fibroblastes de fœtus clonés (ntFF) ainsi que les cellules ES provenant d’embryons clonés (ntES) pour induire leur reprogrammation en cellules iPS autologues. Les cellules ntFF-iPS et ntES-iPS ont des capacités prolifératives avancées et expriment des marqueurs de pluripotence importants. Par contre, les cellules ntES ont une efficacité de reprogrammation significativement supérieure aux cellules nt-FF et forment des colonies trois fois plus rapidement. Contrairement aux cellules ntES, les cellules ntES-iPS démontrent une augmentation de l’expression des marqueurs de pluripotence et survivent à la culture cellulaire prolongée. Les résultats présentés dans ce mémoire attestent que l’utilisation de la reprogrammation secondaire de cellules FF et ES clonées permet la production de cellules souches pluripotentes autologues stables chez le cheval.

Mise au point d'une nouvelle approche permettant la génération de délétions chevauchantes sur le chromosome X des cellules ES

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mise au point d'une nouvelle approche permettant la génération de délétions chevauchantes sur le chromosome X des cellules ES

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Phénotype et localisation des cellules infiltrant l’interstitium rénal dans la néphropathie aux acides aristolochiques

10ème réunion commune de la Société de Néphrologie et de la Société Francophone de Dialyse (Marrakech, 26-29 novembre 2008)