984 resultados para Cellules T CD4 et CD8
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RESUME Dans le cadre de l'infection VIH-1, deux mcanismes gnraux, a) une destruction priphrique massive ou b) un dfaut dans la production priphrique ou centrale de nouvelles cellules, pourraient tre l'origine de l'puisement des lymphocytes T CD4. La question soulve une importante controverse. Dans cette tude, la production thymique et la capacit de prolifration de lymphocytes T ont t tudies conjointement. La production thymique a t value par l'analyse du contenu en cercles d'excision gnrs lors du rarrangement du rcepteur aux cellules T (ou TRECs) des cellules T CD4 et CD8 priphriques, provenant de sujets sains VIH-1 ngatifs (n=120) ou infects par le VIH-1 (n=297), au stade prcoce, intermdiaire et tardif de la phase chronique de la maladie. Au stade prcoce, nous observons que le contenu en TRECs de la population CD4 est suprieur celui de la population contrle. Aucune diffrence n'est observe lors de la phase intermdiaire, alors que le contenu en TRECs est infrieur lors de la phase tardive, en comparaison avec le groupe contrle. Pour les lymphocytes T CD8, le contenu en TRECs reste infrieur au groupe contrle, tous les stades de la maladie. Ainsi, au stade prcoce, la production thymique chercherait compenser la perte de lymphocytes T CD4 puis, avec l'volution de la maladie, cette possibilit s'puiserait. Les profils d'expression des gnes rgulateurs du cycle cellulaire pour les cellules T CD4 et CD8 priphriques, obtenus par la mthode des biopuces d'ADNc (microarray), ont permis l'analyse de la capacit de prolifration priphrique des lymphocytes T. Trois populations cellulaires ont t compares entre elles : lymphocytes provenant de sujets infects par le VIH-1, lymphocytes provenant de sujets VIH-1-ngatifs et lymphocytes activs in vitro provenant de sujets VIH-1-ngatifs. Les rsultats montrent, pour les cellules T CD8, un tat d'activation et un profil d'expression des gnes rgulateurs du cycle cellulaire comparables ceux des cellules actives in vitro. Le profil d'expression gntique des cellules T CD4, par contre, montre une activation sub-optimale, conjointement une forte expression de p53, ce qui pourrait amener un bloc en phase G1 du cycle cellulaire ainsi qu' une forte apoptose. En conclusion, cette perturbation de la progression du cycle cellulaire des lymphocytes T CD4 priphriques pourrait contribuer l'chec de la restauration du nombre de lymphocytes T CD4 et ceci, malgr une production thymique conserve dans les stades prcoces de la maladie, comme dmontr par l'analyse du contenu en TRECs.
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Linfection par le VIH-1 est caractrise par une dpltion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en labsence de traitements anti-rtroviraux, conduit inluctablement la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mcanismes impliqus dans ce dysfonctionnement de la rponse cellulaire T ont t lucids et ont rvl un rle important de la molcule PD-1 dans lexhaustion des cellules T en phase chronique de linfection. En effet, des niveaux levs de PD-1 ont t associs une charge virale leve ainsi qu une diminution de la production de cytokines et de la capacit de prolifrer des cellules T spcifiques du virus. De plus, bloquer in vitro linteraction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rtabli la fonction de ces cellules. De faon intressante, notre groupe ainsi que dautres quipes, ont montr que lexpression de PD-1 tait non seulement augmente sur les cellules spcifiques de lantigne mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant limpact de lexpression de PD-1 sur le renouvellement et la diffrenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de linfection. Lexpression de PD-1 na notamment pas t tudie en phase aigue de linfection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue quen phase chronique de linfection, lexpression de PD-1 est augmente sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naves. Nous avons galement mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phnotype plus diffrenci, et ce tous les stades de la maladie. Dans cette thse, nous discutons le rle possible de PD-1 dans lhomostasie des cellules T chez les individus infects par le VIH-1. En tudiant la transition de la phase aigue la phase chronique de linfection, nous avons trouv que les sous-populations T CD8+ des individus rcemment infects exprimaient moins de PD-1 que celles des individus un stade plus avanc de la maladie. Ces niveaux plus levs de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associs des niveaux rduits de prolifration in vivo comme mesur par lexpression de Ki67 suggrant que lexpression de PD-1 est partiellement implique dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naves saccumulent en frquence lors de la transition de la phase aigue la phase chronique de linfection. Considrant que les cellules naves expriment dj des hauts niveaux de PD-1, nous avons mis lhypothse que lactivation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infects est affecte. En rsum, nous proposons un modle o des hauts niveaux dexpression de PD-1 sont associs (1) un dysfonctionnement de la rponse cellulaire T CD8+ et (2) un dfaut dactivation des cellules naves ce qui contribue non seulement la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter lefficacit de potentiels vaccins dans linfection par le VIH-1 en empchant toute nouvelle rponse dtre initie. Afin de mieux dissquer la rponse immunitaire mise en place lors dune infection comme celle du VIH-1, nous avons dvelopp un outil qui permet de dtecter les cellules T CD4+ i.e. des ttramres de CMH de classe II. Ces ractifs ont pour but daugmenter lavidit du CMH de classe II pour son ligand et donc de dtecter des TCR de faible affinit. Dans cette thse, nous dcrivons une mthode originale et efficace pour produire diverses molcules de HLA-DR liant de faon covalente le peptide antignique. Mieux dterminer les mcanismes responsables de lexhaustion des cellules T dans linfection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que dvelopper des outils de pointe pour suivre ces rponses T, est central une meilleure comprhension de linteraction entre le virus et le systme immunitaire de lhte, et permettra ainsi le dveloppement de stratgies pertinentes pour lutter contre linfection par le VIH-1.
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RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Parmi les globules blancs, les lymphocytes T 004 jouent un rle primordial dans la coordination de la rponse immunitaire contre les pathognes et les lymphocytes T CD8 dans leur limination. Lors d'une infection par le virus de l'immunodficience humaine (VIH-1), non seulement les cellules T CD4 sont les principales cibles d'infections, mais aussi elles disparaissent progressivement tout au long de la maladie. Ce phnomne, appel aussi puisement des lymphocytes T CD4, est la principale cause provoquant le Syndrome d'Immunodficience Acquise (SIDA). Malgr de grands efforts de recherche, nous ne sommes toujours pas en mesure de dire si ce phnomne est d un dfaut dans la production de nouvelles cellules ou une destruction massive de cellules en circulation. Dans cette tude, nous nous proposions, dans un premier temps, de comparer la production de nouvelles cellules T CD4 et CD8 chez des individus VIH-ngatifs et positifs. Les cellules nouvellement produites portent un marqueur commun que l'on appelle TREC et qui est facilement mesurable. En considrant des paramtres cliniques, nous tions en mesure de dterminer le niveau de TRECs de cellules T CD4 et CD8 dans diffrentes phases de la maladie. De l, nous avons pu dterminer que le niveau de TREC est toujours plus bas dans les cellules T CD8 de patients VIH-positifs comparativement notre groupe contrle. Nous avons pu dterminer par une analyse ultrieure que cette diffrence est due une forte prolifration de ces cellules chez les patients VIH-positifs, ce qui a pour effet de diluer ce marqueur. En revanche, la production de nouvelles cellules T CD4 chez des patients VIH-positifs est accentue lors de la phase prcoce de la maladie et largement rprime lors de la phase tardive. Dans un second temps, nous avons effectu une analyse grande chelle de l'expression de gnes associs la division cellulaire sur des lymphocytes T CD4 et CD8 d'individus VIH-positifs et ngatifs, avec comme contrle des cellules prolifrant in vitro. De cette tude, nous avons pu conclure que les cellules T CD8 de patients VIH-positifs taient en tat de prolifration, alors que les lymphocytes T CD4 prsentaient des dfauts majeurs conduisant un arrt de la division cellulaire. Nos rsultats montrent que la capacit produire de nouvelles cellules chez des patients VIHpositifs reste active longtemps pendant la maladie, mais que l'incapacit des cellules T CD4 prolifrer peut enrayer la reconstitution immunitaire chez ces individus. ABSTRACT The hallmark of HIV-1 infection is the depletion of CD4 T cells. Despite extensive investigation, the mechanisms responsible for the loss of CD4 T cells have been elucidated only partially. In particular, it remains controversial whether CD4 T cell depletion results from a defect in T cell production or from a massive peripheral destruction. In this study, de novo T cell generation has been investigated by measuring T cell receptor rearrangement excision circles (TRECs) on large cohorts of HIV-negative (N=120) and HIV-1 infected (N=298) individuals. Analysis of TREC levels was performed in HIV-infected subjects stratified by the stage of HIV disease based on CD4 T cell counts (early: >500 CD4 T cells/l; intermediate: <500>200; late: <200) and by age (20 to 60 years, n = 259). Our data show that TREC levels in CD8 T cells were significantly lower in HIV-infected subjects at any stage of disease compared to the control group. In contrast, TREC levels in CD4 T cells were significantly higher in HIV-infected subjects at early stages disease while no significant differences were observed at intermediate stages of the disease and were severely reduced only at late stages of disease. To investigate further the status of cell cycle in peripheral CD4 and CD8 T cells in HIV-1 infections, we determined the pattern of gene expression with the microarray technology. In particular, CD4 and CD8 T cells of HIV-1 infected and HIV-negative subjects were analysed by Cell Cycle cDNA expression array. The patterns of gene expression were compared to in vitro stimulated CD4 and CD8 T cells and this analysis showed that CD8 T cells of HIV-1 infected subjects had a pattern of gene expression very similar to that of in vitro stimulated CD8 T cells thus indicating ongoing cell cycling. In contrast, CD4 T cells of HIV-1 infected subjects displayed a complex pattern of gene expression. In fact, CD4 T cells expressed high levels of genes typically associated with cell activation, but low levels of cell cycle genes. Therefore, these results indicated that activated CD4 T cells of HIV-1 infected subjects were in cell cycle arrest. Taking together these results indicate that thymus function is preserved for long time during HIV- 1 infection and the increase observed in early stage disease may represent a compensatory mechanism to the depletion of CD4 T cells. However, we provide evidence for a cell cycle arrest of peripheral CD4 T cells that may prevent potentially the replenishment of CD4 T cells. RESUME Les mcanismes responsables de la perte des lymphocytes T CD4 lors de l'infection pas VIH n'ont t lucids que partiellement. Nous ne savons toujours pas si l'puisement des lymphocytes T CD4 rsulte d'un dfaut dans la production de cellules ou d'une destruction priphrique massive. Dans cette tude, la production de cellules T a t tudie en mesurant les cercles d'excision gnrs lors du rarrangement du rcepteur au cellules T (TRECs) chez des individus VIH-ngatifs (N=120) et VIH-1 positifs (N=298). L'analyse des niveaux de TREC a t faite chez sujets HIV-infects en considrant les phases de la maladie sur la base des comptes CD4 (phase prcoce: > 500 cellules CD4/l; intermdiaire: < 500>200; tardive: < 200) et par ge. Nos donnes dmontrent que les niveaux de TRECs des cellules T CD8 taient significativement plus bas chez les sujets VIH-1 infects, tous les stades de la maladie comparativement au groupe contrle. En revanche, les niveaux de TRECs des cellules T CD4 taient significativement plus levs chez les sujets VIH-1 infects durant la phase prcoce de la maladie, tandis qu'aucune diffrence significative n'tait observe durant la phase intermdiaire et taient trs rduits dans la phase tardive. Dans une deuxime partie, nous avons utilis la technique des biopuces d'ADN complmentaire pour analyser la rgulation du cycle cellulaire chez les lymphocytes T CD4 et CD8 priphriques lors d'une infection au VIH-1. Des profils d'expression ont t dtermins et compars ceux de cellules T CD4 et CD8 stimules in vitro, dmontrant que les cellules T CD8 des sujets VIH-positifs avaient un profil d'expression trs semblable celui des cellules stimules in vitro en prolifration. En revanche, les lymphocytes T CD4 des sujets VIH-1 positifs avaient un profil d'expression de gne plus complexe. En fait, leur profil montrait une sur- expression de gnes associs une activation cellulaire, mais une sous-expression de ceux induisant une division. Ainsi, ces rsultats indiquent que les lymphocytes T CD4 d'individus VIH-positifs prsentent des drgulations qui conduisent un arrt du cycle cellulaire. Ces rsultats montrent que la fonction thymique est prserve longtemps pendant l'infection au VIH-1 et que l'augmentation de la quantit de TRECs dans la phase prcoce de la maladie peut reprsenter un mcanisme compensatoire l'puisement des cellules T CD4. Cependant, nous dmontrons aussi un clair dysfonctionnement du cycle cellulaire chez les cellules T CD4 d'individus infects par VIH-1 ce qui peut enrayer la reconstitution du systme immunitaire.
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Mmoire numris par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Mmoire numris par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Rapport de synthse : L'infection par le virus de l'hpatite C (VHC) a une volution svre chez les patients co-infects par VIH/VHC, de mme que chez les patients transplants hpatiques. Toutefois, les mcanismes impliqus dans cette volution restent peu clairs. Dans ce travail, nous tudions le profil fonctionnel des cellules T spcifiques diriges contre le virus de l'hpatite C chez 86 patients mono-infects par VHC, 48 patients co-infects par VIH/VHC et 42 patients ayant bnfici d'une transplantation hpatique. La production d'IFN-Y et d'IL-2 et la capacit de prolifrer des cellules T CD4+ et CD8+ sont values aprs stimulation par des peptides drivs du VHC. Chez les patients mono-infects par le VHC, les cellules T spcifiques au VHC sont polyfonctionnelles du point de vue de la scrtion de cytokines, avec trois profils de scrtion pour les cellules T CD4+: scrtion uniquement de IL-2, scrtion de IL-2 et IFN-y et scrtion uniquement de IFN-gamma, et de deux profils pour les cellules T CD8+: scrtion de IL-2 et IFN-y et scrtion uniquement de IFN-gamma. En revanche, les cellules T spcifiques au VHC chez les individus coinfects par VIH/VHC et chez les patients transplants hpatiques ont un profil de scrtions de cytokines marqu par l'absence de cellules CD4+ scrtant uniquement l'Il-2 et l'absence de cellules CD8+ scrtant la fois IL-2 et IFN-gamma. De plus, la prolifration de cellules T CD4+ et CD8+ spcifiques au VHC est considrablement rduite chez les patients co-infects par VIH/VHC, comme chez les transplants hpatiques. La prsence de cellules T effectrices uniquement (dfinies par l'absence de cellules T CD4+ scrtants uniquement de l'IL-2 et l'absence de cellules T CD8+ scrtant la fois IL-2 et IFN-gamma et altration de la capacit prolifrative) est associe avec une charge virale VHC significativement plus leve et une fibrose hpatique plus svre. Par consquent, les prsents rsultats suggrent la participation de mcanismes immunitaires dans l'volution acclre de l'hpatite C chez les patients co-infects par VIH-1 et chez les patients greffs hpatiques.
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The leishmaniases are a group of diseases transmitted by the bite of Leishmania infected female phlebotomine sand flies. The diseases occur in different forms: localized, diffuse and muco-cutaneous leishmaniasis, and visceral leishmaniasis (VL). Inside macrophages, the main host cells of the obligate intracellular Leishmania parasites, nitric oxide synthase and arginase can regulate parasite killing or growth. In experimental leishmaniasis, we previously reported that non-healing disease is associated with higher arginase activity at site of pathology, correlating with local suppression of T cell function. To test whether these data translate to human leishmaniasis, the following study was initiated: I first tested the hypothesis that local suppression of T cell responses observed in persistent CL is associated with arginase induced L-arginine depletion. The results showed that arginase activity is increased at site of pathology compared to peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of LCL patients and intact skin of healthy controls. The phenotype of arginase expressing cells was identified in both compartments as CD15+ CD14|0W low-density granulocytes (LDGs). Finally, high arginase activity at site of pathology observed in cutaneous lesions of patients coincides with downregulation of CD3, CD4 and CD8 molecules in CD4+ and CD8+ T cells at site of pathology. We concluded that increased arginase levels in lesions of LCL patients might contribute to CL pathogenesis by impairing T cell effector function at site of pathology. Next, it was tested whether arginase, an enzyme associated with immunosuppression, is higher in patients with VL and contributes to impaired T cell function through depletion of L- arginine. The results showed that higher level of arginase activity in the PBMC coincides with active phase of VL. Cells expressing arginase in PBMCs were also found to be LDGs. Importantly, increased arginase activity and frequency of degranulated neutrophils coincided with lower plasma L-arginine levels. Furthermore, downregulation of CD3, in T cells correlated with low plasma arginine levels. VL/HIV co-infection is a frequently reported leishmaniasis complication in Ethiopia associated with poor prognosis, with up to 40% mortality rate and high relapse rate. Arginase activity was significantly increased in PBMCs and plasma of VL patients co-infected with HIV than in those having VL alone. Similarly, cells expressing arginase in PBMCs were found to be LDGs. In summary, the results presented here show that increased arginase activity is a marker of disease severity in human leishmaniasis with and without HIV; further, these results suggest that arginase mediated L-arginine depletion may inhibit T cell function and contribute to impaired control of infection. - Les leishmanioses sont un groupe de maladies transmises par la piqre de mouches des sables femelles, appeles phlbotomes, ayant t infectes par Leishmania. Les maladies se manifestent sous diffrentes formes: la leishmaniose cutane localise, la leishmaniose diffuse et mucocutane et la leishmaniose viscrale (LV). A l'intrieur des macrophages, les principales cellules htes des parasites, l'oxyde nitrique synthase et l'arginase, peuvent contrler, soit la mort du parasite, soit sa croissance. Pour la leishmaniose exprimentale, nous avons dj rapport que le dveloppement de lesions qui ne gurissent pas est associ une activit plus grande d'arginase au site d'infection, en corrlation avec la suppression locale de la fonction des cellules T. Pour vrifier si ces donnes pouvaient s'appliquer la leishmaniose humaine, j'ai d'abord vrifi l'hypothse selon laquelle la suppression locale des rponses des cellules T observe dans la CL persistante, est associe la la diminution de L- arginine induite par l'arginase. Les rsultats ont montr que l'activit arginase est augmente au site d'infection, par rapport aux cellules mononucles du sang priphrique (CMSP) de patients LCL et la peau intacte des contrles sains. Le phnotype de cellules exprimant l'arginase a t identifi dans les deux compartiments comme des granulocytes CD15+ et CD 14" de basse densit (LDG). Enfin, l'activit arginase leve au site de la pathologie, observe dans les lsions cutanes de patients, concide avec la reduction dde l'expression des molcules CD3, CD4 et CD8 dans les cellules T CD4+ et CD8+ au site de pathologie . Nous avons conclu que l'augmentation des niveaux d'arginase dans les lsions de patients LCL pourrait contribuer la pathogense de la CL, en altrant la fonction effectrice des celllules T au site de la pathologie. Ensuite, nous avons vrifi si l'arginase, une enzyme associe l'immunosuppression, tait plus leve chez les patients atteints de VL et si elle contribuait la mauvaise fonction des cellules T par la depletion en L-arginine. Les rsultats ont montr qu'un niveau plus lev de l'activit arginase dans les PBMC correspond la phase active de la VL. Les cellules exprimant l'arginase dans les CMSP se sont rvles tre de type LDG . Il est important de souligner que l'augmentation de l'activit arginase et la frquence des neutrophiles dgranuls a concid avec des niveaux infrieurs de L-arginine plasmatique. En outre, la suppression de CD3 dans les cellules T correlle avec de faibles niveaux d'arginine plasmatique . Il a t frquement rapport que la co-infection VL/VIH est une complication de la leishmaniose en Ethiopie, associe un mauvais prognostic, un taux de mortalit pouvant atteindre 40% et un pourcentage lev de rechutes. L'activit de l'arginase a beaucoup plus augmente dans les CMSP et le plasma de patients atteints de VL et co-infects par le VIH, que chez ceux seulement attaints de VL. De mme, les cellules exprimant l'arginase dans les CMSP sont aussi des LDG. En rsum, les rsultats prsents ici montrent que l'augmentation de l'activit de l'arginase est un marqueur de gravit de la la leishmaniose humaine, avec ou sans VIH ; en outre, ces rsultats suggrent que la dpltion de L-arginine par l'arginase pourrait inhiber la fonction des cellules T et contribuer un contrle rduit de l'infection. - Les Leishmanioses sont des maladies parasitaires transmises par la piqre d'une mouche des sables femelle (phlbotome) infecte par Leishmania. La maladie se manifeste sous diffrentes formes cliniques : la leishmaniose viscrale, une maladie progressive mortelle en l'absence de traitement, la leishmaniose muco-cutane (MCL), la leishmaniose cutane diffuse (LCD ) maladie mutilante, qui peut tre de longue dure et la leishmaniose cutane localise maladie dont on gurit mais laissant une cicatrice inesthtique vie. La maladie est largement rpandue, elle affecte les populations les plus pauvres dans 98 pays et 350 millions de personnes risque. Globalement on estime 500.000 les nouveaux cas de la forme viscrale et 1-1.5 million ceux de la leishmaniose cutane. La leishmaniose est fortement endmique en Ethiopie et se manifeste dans les formes viscrale et cutane. Le parasite Leishmania infecte et se multiplie dans les cellules du systme immunitaire, principalement les macrophages. Les macrophages sont capables de tuer le parasite Leishmania s'ils reoivent des instructions correctes de la part d'autres cellules du systme immunitaire, les lymphocytes. Les macrophages expriment deux enzymes importants, appels oxide nitrique synthase inductible (iNOS ) et l'arginase, qui sont respectivement associs la promotion de la mort du parasite et la multiplication. L'enzyme iNOS prsent dans les macrophages mtabolise l'arginine afin de gnrer de l'oxyde d'azote (NO) , une molcule effectrice ncessaire pour tuer le parasite . Au contraire, lorsque les macrophages sont activs d'une certaine manire conduisant l'augmention de la rgulation de l'arginase, ils mtabolisent l'arginine en polyamines qui favorisent la croissance du parasite. Au cours du dveloppement de la leishmaniose, les lymphocytes ne parviennent pas transmettre aux macrophages les signaux ncessaires pour tuer le parasite. Les mcanismes cellulaires qui sont la cause de ce dfaut, ne sont pas bien compris. En utilisant des modles animaux, nous avons montr la rgulation la hausse de l'arginase au site de la pathologie, qui s'est traduit par l'altration de la fonction effectrice des lymphoctes. Nous avons initi des tudes de leishmaniose humaine en Ethiopie afin d'identifier le rle de l'arginase dans la svrit de la maladie. Nos rsultats montrent, que l'arginase est fortement augmente dans la lsion des patients CL, et dans le sang des patients VL et ceux co-infects par VL / VIH. Le niveau d' arginase rgule la hausse coincide avec l'expression infrieure d'une molcule de signalisation dans les lymphocytes, qui est essentielle leur bon fonctionnement. En VL actif, l'augmentation d'arginase se traduit par la diminution de l'arginine qui est indispensable la synthse de NO et au bon fonctionnement des lymphocytes. Ainsi, l'incapacit des lymphocytes envoyer des signaux adquats aux macrophages pourrait tre due la suppression de l'arginine.
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Several evidences in humans underscored the contribution of CD4 and CD8 T-cell responses in controlling viral and bacterial infections. However, CD4 and CD8 Τ cells have distinct and specific effector functions leading to a hierarchical importance in responding to different types of pathogens. In this context, the present work aimed to investigate distinct CD8 T-cell features potentially influencing T-cell efficacy against viral infection. To achieve this-objective, CD8 Τ cells derived from HIV-infected patients and healthy donors harbouring virus-specific immune responses or immunized with an HTV vaccine candidate were studied. In particular, we performed a comprehensive cross-sectional and longitudinal analysis to characterize the function, the phenotype and the functional avidity of HIV-specific CD8 Τ cells during acute (PHI) and chronic infection and, in particular, we investigated immunological parameters potentially associated with the functional avidity of HIV-specific CD8 Τ cells. In addition, we studied the expression pattern of co-inhibitory molecules and the influence of CD 160 on the functions of CD8 Τ cells in absence of chronic infections. From these analyses we observed that the functional avidity of HIV-specific CD8 T- cell responses was significantly lower in acute than in chronic infection, but was not different between chronic progressive and non-progressive patients. Functional avidity remained low after several years of antiretroviral therapy in PHI patients, but increased in patients experiencing a virus rebound following treatment interruption in association with a massive renewal of the global CD8 complementarity-determining region 3 of the TCR. The functional avidity was also directly associated to T-cell exhaustion. In individuals with no sign of HIV or Hepatitis A, Β or C virus infection, CD8 Τ cells expressed higher levels of co-inhibitory molecules than CD4 Τ cells and this was dependent on the stage of T-cell differentiation and activation. The expression of CD 160 impaired the proliferation capacity and IL-2 production of CD8 Τ cells and was reduced upon CD8 T-cell activation, entitling CD 160 as unique marker of CD8 T-cell exhaustion. The CD 160 blockade restored the proliferation capacity of virus-specific CD8 Τ cells providing a potential new target for immunotherapy. All together, these results expand our knowledge regarding the interplay between the immune system and the viruses. - De nombreuses tudes chez l'Homme ont mis en vidence la contribution des rponses cellulaires Τ CD4 et CD8 dans le contrle des infections virales et bactriennes. En particulier, les lymphocytes Τ ont diffrentes fonctions effectrices spcifiques qui leur confrent un rle cl lors d'infections par diffrents pathognes. Ce travail vise tudier diffrentes caractristiques des cellules Τ CD8 affectant l'efficacit des rponses cellulaires contre les virus. Pour atteindre cet objectif nous avons tudi les cellules Τ CD8 provenant de patients infects par le VIH et de donneurs sains avec des rponses immunitaires naturelles ou vaccinales contre des virus. Nous avons effectu plusieurs analyses transversales et longitudinales des fonctions, du phnotype et de l'avidit fonctionnelle des lymphocytes Τ CD8 spcifiques au VIH au cours d'infections aigus et chroniques; en particulier, nous avons tudi les paramtres immunologiques qui pourraient tre associs l'avidit fonctionnelle. De plus, nous avons investigu le profil d'expression des principales molcules co-inhibitrices et en particulier le rle du CD 160 dans les fonctions des lymphocytes Τ CD8. Sur la base de ces analyses, nous avons constat que l'avidit fonctionnelle des cellules Τ CD8 spcifiques au VIH tait significativement plus faible lors infections aigus que lors d'infections chroniques, mais n'tait, par contre, pas diffrente entre les patients avec des infections chroniques progressives et non progressives. L'avidit fonctionnelle reste faible aprs plusieurs annes de traitement antirtroviral, mais augmente chez les patients subissant un rebond viral, et donc exposs des hautes virmies, suite l'interruption du traitement. Cette augmentation d'avidit des lymphocytes Τ CD8, lie un puisement fonctionnel accru, tait quantitativement directement associe un renouvellement massif du TCR. Indpendamment de l'infection par le VIH, les cellules Τ CD8 expriment des niveaux plus levs de molcules co-inhibitrices (PD-1, 2B4 et CD 160) par rapport aux cellules Τ CD4 et ceci dpend de leur stade de diffrenciation et d'activation. En particulier, CD 160 semble tre un marqueur cl d'puisement cellulaire des cellules Τ CD8, et donc une nouvelle cible potentielle pour l'immunothrapie, car a) son expression rduit la capacit prolifrative et la production d'IL-2 b) CD 160 diminue suite 1'activation et c) le blocage de CD 160 redonne la capacit prolifrative aux cellules Τ CD8 spcifiques aux virus. - Le systme immunitaire est un ensemble de cellules, tissus et organes indispensables pour limiter l'entre des pathognes travers la peau et les muqueuses. Parmi les diffrentes cellules composant le systme immunitaire, les cellules Τ CD4 et CD8 sont fondamentales pour le contrle des infections virales et bactriennes. Les moyens pour combattre les diffrents pathognes peuvent tre cependant trs variables. Les cellules Τ CD8, qui sont indispensables pour la lutte contre les virus, peuvent avoir diffrents niveaux de sensibilit; les cellules qui rpondent de faibles quantits d'antigne ont une forte sensibilit. Suite une premire infection virale, les cellules Τ CD8 ont une sensibilit plus faible que lors d'expositions rptes au mme virus. En effet, la rexposition au pathogne induit une augmentation de sensibilit, grce au recrutement et/ou l'expansion de cellules Τ dotes d'une sensibilit plus leve. Les cellules Τ CD8 avec une plus haute sensibilit semblent tre caractrises par une perte de fonctionnalit (puisement fonctionnel associ une haute expression de molcules dites inhibitrices). En absence d'infection, la fonction des molcules inhibitrices n'est pas encore clairement dfinie. Les cellules Τ CD8 montrent un niveau d'expression plus lev de ces molcules par rapport aux cellules Τ CD4. Ceci dpend de l'tat des cellules. Parmi ces molcules, le CD160 est associ l'incapacit des cellules prolifrer et produire de l'IL-2, une protine importante pour la prolifration et la survie cellulaire. L'incapacit des cellules exprimant le CD 160 prolifrer en rponse des virus peut tre restaure par le blocage fonctionnel du rcepteur CD 160. Cette tude toffe notre connaissance du rle des cellules Τ CD8 ainsi que des consquences induites par leur puisement fonctionnel. Ces informations sont fondamentales pour le dveloppement de nouvelles stratgies thrapeutiques et vaccinales.
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Rsum pour un large public: La vaccination a eu un impact norme sur la sant mondiale. Mais, quel est le principe d'un vaccin? Il est bas sur la 'mmoire immunologique', qui est une particularit exclusive des systmes immunitaires des organismes volus. Suite une infection par un pathogne, des cellules spcialises de notre systme immunitaire (les lymphocytes) le reconnaissent et initient une raction immunitaire qui a pour but son limination. Pendant cette raction se dveloppent aussi des cellules, appeles cellules lymphocytaires mmoire, qui persistent pour longue dure et qui ont la capacit de stimuler une raction immunitaire trs efficace immdiatement aprs une seconde exposition ce mme pathogne. Ce sont ces cellules mmoires (lymphocytes B et T) qui sont la base de la 'mmoire immunologique' et qui sont stimules lors de la vaccination. Chez l'homme, deux populations distinctes des lymphocytes T mmoires ont t identifies: les cellules centrales (CM) et effectrices (EM) mmoires. Ces populations sont fonctionnellement htrognes et exercent des rles distincts et essentiels dans l'immunit protectrice. Typiquement, les cellules effectrices mmoires sont capables de tuer immdiatement le pathogne tandis que les cellules centrales mmoires sont responsables d'initier une rponse immunitaire complte. Pourtant, les mcanismes biochimiques qui contrlent les fonctions de ces cellules ont t jusqu' prsent peu tudis cause de la faible frquence de ces cellules et de la quantit limite de tissus humains disponibles pour les analyses. La comprhension de ces mcanismes est cruciale pour la ralisation de vaccins efficaces et pour le dveloppement de nouveaux mdicaments capables de moduler la rponse immunitaire lymphocytaire. Dans cette thse, nous avons d'abord dvelopp et amlior une technologie appele 'protine array en phase inverse' qui possde un niveau de sensibilit beaucoup plus lev par rapport aux technologies classiquement utilises dans l'tude des protines. Grce cette technique, nous avons pu comparer la composition protique du systme de transmission des signaux d'activation des cellules CM et EM humaines. L'analyse de 8 13 sujets sains a montr que ces populations des cellules mmoires possdent un systme de signalisation protique diffrent. En effet, les cellules EM possdent, par rapport aux cellules CM, des niveaux rduits d'une protine rgulatrice (appele c-Cbl) que nous avons dmontr comme tant responsable des fonctions spcifiques de ces cellules. En effet, en augmentant artificiellement l'expression de cette protine rgulatrice dans les cellules EM jusqu'au niveau de celui des cellules CM, nous avons induit dans les cellules EM des capacits fonctionnelles caractristiques des cellules CM. En conclusion, notre tude a identifi, pour la premire fois chez l'homme, un mcanisme biochimique qui contrle les fonctions des populations des cellules mmoires. Rsum en Franais: Les cellules mmoires persistent inertes dans l'organisme et produisent des ractions immunitaires rapides et robustes contre les pathognes prcdemment rencontrs. Deux populations distinctes des cellules mmoires ont t identifies chez l'homme: les cellules centrales (CM) et effectrices (EM) mmoires. Ces populations sont fonctionnellement htrognes et exercent des rles distincts et critiques dans l'immunit protectrice. Les mcanismes biochimiques qui contrlent leurs fonctions ont t jusqu' prsent peu tudis, bien que leur comprhension soit cruciale pour le dveloppement des vaccins et des nouveaux traitements/mdicaments. Les limites majeures ces tudes sont la faible frquence de ces populations et la quantit limite de tissus humains disponibles. Dans cette thse nous avons d'abord dvelopp et amlior la technologie de 'protine array en phase inverse' afin d'analyser les molcules de signalisation des cellules mmoires CD4 et CD8 humaines isoles ex vivo. L'excellente sensibilit, la reproductibilit et la linarit de la dtection, ont permis de quantifier des variations d'expression protiques suprieures 20% dans un lysat quivalent 20 cellules. Ensuite, grce l'analyse de 8 13 sujets sains, nous avons prouv que les cellules mmoires CD8 ont une composition homogne de leur systme de signalisation tandis que les cellules CD4 EM expriment significativement de plus grandes quantits de SLP-76 et des niveaux rduits de c-Cbl, Syk, Fyn et LAT par rapport aux cellules CM. En outre, l'expression rduite du rgulateur ngatif c-Cbl est corrle avec l'expression des SLP-76, PI3K et LAT uniquement dans les cellules EM. L'valuation des proprits fonctionnelles des cellules mmoires a permis de dmontrer que l'expression rduite du c-Cbl dans les cellules EM est associ une diminution de leur seuil d'activation. En effet, grce a la technique de transduction cytosolique, nous avons augment la quantit de c-Cbl des cellules EM un niveau comparable celui des cellules CM et constat une rduction de la capacit des cellules EM prolifrer et scrter des cytokines. Ce mcanisme de rgulation dpend principalement de l'activit d'ubiquitine ligase de c-Cbl comme dmontr par l'impact rduit du mutant enzymatiquement dficient de c-Cbl sur les fonctions de cellules EM. En conclusion, cette thse identifie c-Cbl comme un rgulateur critique des rponses fonctionnelles des populations de cellules T mmoires et fournit, pour la premire fois chez l'homme, un mcanisme contrlant l'htrognit fonctionnelle des ces cellules. De plus, elle valide l'utilisation combine des 'RPP arrays' et de la transduction cytosolique comme outil puissant d'analyse quantitative et fonctionnel des protines de signalisation. Summary : Memory cells persist in a quiescent state in the body and mediate rapid and vigorous immune responses toward pathogens previously encountered. Two subsets of memory cells, namely central (CM) and effector (EM) memory cells, have been identified in humans. These subsets display high functional heterogeneity and assert critical and distinct roles in the control of protective immunity. The biochemical mechanisms controlling their functional properties remain so far poorly investigated, although their clarification is crucial for design of effective T-cell vaccine and drug development. Major limitations to these studies lie in the low frequency of memory T cell subsets and the limited amount of human specimen available. In this thesis we first implemented the innovative reverse phase protein array approach to profile 15 signalling components in human CD8 and CD4 memory T cells isolated ex vivo. The high degree of sensitivity, reproducibility and linearity achieved, allowed an excellent quantification of variations in protein expression higher than 20% in as few as 20-cell equivalent per spot. Based on the analysis of 8 to 13 healthy subjects, we showed that CD8 memory cells have a homogeneous composition of their signaling machinery while CD4 EM cells express statistically significant increased amounts of SLP-76 and reduced levels of c- Cbl, Syk, Fyn and LAT as compared to CM cells. Moreover, in EM but not CM cells, reduced expression of negative regulator c-Cbl correlated with the expression of SLP-76, PI3K and LAT. Subsequently, we demonstrated that the higher functional properties and the lower functional threshold of EM cells is associated with reduced expression of c-Cbl. Indeed, by increasing c-Cbl content of EM cells to the same level of CM cells using cytosolic transduction, we impaired their proliferation and cytokine production. This regulatory mechanism was primarily dependent on c-Cbl E3 ubiquitin ligase activity as evidenced by the weaker impact of enzymatically deficient c-Cbl C381A mutant on EM cell functions. Together, these results identify c-Cbl as a critical regulator of the functional responses of memory T cell subsets and provides, for the first time in humans, a mechanism controlling the functional heterogeneity of memory CD4 cells. Moreover it validates the combined use of RPP arrays and cytosolic transduction approaches as a powerful tool to quantitatively analyze signalling proteins and functionally assess their roles.
Resumo:
Les chimiokines et leurs rcepteurs respectifs jouent un rle important dans limmunit inne et adaptative. Les rcepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spcifiques et fonctionnalit distincte du point de vue de la spcificit antignique et de la production de cytokines. Lidentit de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus rsistantes linfection par le virus de limmunodficience humaine (VIH) reste mal dfinie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales dun excs de cellules T effectrices (CD8+) compar aux cellules cibles (CD4+) reprsente un bon pronostic de linfection par le virus de limmunodficience simienne (VIS), tandis que la dpltion des cellules Th17 dans les tissus lymphodes associs au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de linfection VIH. Leffet rgulateur des chimiokines sur lactivation de la rplication virale dans diffrentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu tudi. Ce projet de matrise est divis en 3 parties: (1) lidentification des rcepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilit distincte linfection par le VIH; (2) la caractrisation phnotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spcifiques au VIH de sujets progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur lactivation cellulaire et la rplication virale in vitro. Nos rsultats dmontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives linfection par le VIH. Nous proposons galement de nouveaux corrlats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spcifiques au VIH via lintgrine 7, (ii) le ratio lev entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spcifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacit des cellules T CD4+ et CD8+ spcifiques au VIH produire des ligands de CCR5 bloquant lentre virale. Finalement, nos rsultats sur leffet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposs sur la rplication virale dmontrent limplication du rseau des chimiokines dans la rgulation de la pathogense de linfection VIH.
Resumo:
La thymectomie est un geste chirurgical frquemment ncessaire lors des interventions cardiaques en priode nonatale. Il est connu que la rsection du thymus entrane une lymphopnie ne semblant pas avoir de consquences cliniques graves. La lymphopnie constate serait plus importante chez les patients ayant eu une chirurgie cardiaque de type Fontan. Toutefois, on ignore si la lymphopnie est uniquement secondaire la thymectomie ou si elle est lie ce type particulier de chirurgie cardiaque. La prsente recherche porte sur 19 patients oprs selon l'approche Fontan; ils ont t compars 6 patients "contrle" ayant eu une thymectomie au cours d'une chirurgie cardiaque d'un autre type. Les rsultats indiquent que les patients de type Fontan accusent une diminution du nombre de cellules naves CD4+ et CD8+ et plus particulirement une baisse de leurs migrants thymiques (CD45RA+CD31+/CD4+). On note en contrepartie une expansion du rpertoire mmoire (CD45RO+). Ces altrations lymphocytaires sont comparables aux contrles. Il semble donc que les anomalies lymphocytaires releves soient relies principalement la thymectomie et non pas au type de chirurgie. Les infections plus importantes chez les Fontan, quant elles, pourraient s'expliquer par une volution post-opratoire dfavorable.
Resumo:
Le virus de lhpatite C (VHC) infecte ~185 millions dindividus dans le monde. Malgr le dveloppement des nouvelles thrapies diriges contre le VHC, on compte deux millions de nouvelles infections chaque anne, en particulier dans les pays sous-dvelopps et les populations marginalises. Comme pour la plupart des virus infection chronique, le dveloppement dun vaccin prophylactique efficace est limit par le manque de caractrisation des dterminants de la mmoire immunitaire protectrice lors des pisodes de rinfection naturelle chez les tres humains. Le VHC reprsente un modle unique au sein des virus infection chronique pour tudier limmunit protectrice. En effet ~30% des patients infects par le VHC peuvent tre guris suite un premier pisode dinfection spontanment. Dans cette thse, nous avons tudi limmunit protectrice contre le VHC dans une cohorte dutilisateurs de drogues par injection qui sont risque dtre infects ou rinfects. Notre hypothse est que la majorit des patients qui ont rsolu une premire infection par le VHC sont protgs contre le dveloppement dune infection chronique sils sont rexposs. Cette immunit protectrice est associe la prsence des cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles qui possdent des frquences, magnitudes et avidits leves. La capacit protectrice des cellules T mmoire contre les squences variables du VHC est dpendante de la diversit et flexibilit du rpertoire de leurs rcepteurs de cellules T (TCR), qui reconnaissent les squences variables des pitopes cibls. Notre premier objectif tait de dfinir et dtailler les dterminants de limmunit protectrice confre par les cellules T spcifiques du VHC. Nos rsultats ont montr que la protection pendant lpisode de rinfection tait associe une augmentation de la magnitude et du spectre des rponses spcifiques par les cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles, ainsi que par lapparition dune population de cellules T ttramre+ CD8+ effectrices qui expriment faiblement le marqueur CD127 (CD127lo) lors du pic de la rponse. Chez les patients qui ont dvelopp une infection chronique pendant lpisode de rinfection, nous avons observ une expansion trs limite des cellules T CD4 et CD8. Le squenage des pitopes cibls par les cellules T CD8 chez ces patients qui sont non-protgs a montr que les squences de ces pitopes sont diffrentes des squences de rfrence qui taient utilises pour tous les essais immunologiques de cette tude. Le deuxime objectif tait danalyser la dynamique du rpertoire des TCRs des cellules T CD8 spcifiques chez les patients protgs versus les patients non-protgs. Nos rsultats ont montr que le rpertoire des cellules T CD8 spcifiques est plus focalis que chez les patients protgs. En plus, nous avons observ que les clonotypes qui forment le rpertoire chez les patients protgs sont distincts de ceux chez les patients non-protgs. Ces clonotypes chez les patients protgs ont montr de plus grandes avidit et polyfonctionnalit que leurs homologues chez les patients non-protgs. En conclusion, nos rsultats suggrent que la protection contre le dveloppement dune infection chronique pendant lpisode de rinfection par le VHC est associe une augmentation de la magnitude, du spectre et de la fonctionnalit des rponses des cellules T spcifiques, ainsi qu un rpertoire des TCRs plus focalis compos des clonotypes distincts qui possdent de plus grandes avidit et polyfonctionnalit que chez les patients non-protgs. Lhomologie des squences des souches virales entre les diffrents pisodes de linfection est un dterminant majeur de ltablissement dune protection efficace. Ces rsultats ont donc des implications trs importantes pour le dveloppement dun vaccin prophylactique contre le VHC et dautres virus infection chronique.
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Le diabte auto-immun rsulte de la destruction des cellules bta pancratiques scrtrices dinsuline par les lymphocytes T du systme immunitaire. Il sensuit une dficience hormonale qui peut tre comble par des injections quotidiennes dinsuline dorigine exogne, toutefois il demeure ce jour impossible de gurir les patients atteints de la maladie. De faon gnrale, un systme immunitaire sain reconnat une multitude dantignes diffrents et assure ainsi notre dfense lgard de diffrents pathognes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons gntiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent sactiver de faon aberrante suite la reconnaissance dantignes provenant du soi. Cest ce bris de tolrance qui mne au dveloppement de pathologies auto-immunes telles que le diabte auto-immun. Afin de limiter lauto-immunit, des mcanismes de slection stricts permettent dliminer la majorit des lymphocytes T prsentant une forte affinit envers des antignes du soi lors de leur dveloppement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes russissent toutefois chapper lapoptose et migrent en priphrie afin dy circuler en qute dun antigne spcifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mcanismes priphriques assurent le maintien de la tolrance immunitaire en faisant obstacle lactivation et la prolifration des lymphocytes T auto-ractifs. Lune des avenues afin dinhiber le dveloppement de rponses immunitaires aberrantes est la gnration de lymphocytes T rgulateurs. Ces cellules, dorigine thymique ou priphrique, peuvent arborer diffrents phnotypes et agissent via de multiples mcanismes afin dinactiver et/ou liminer les cellules impliques dans lapparition de pathologies auto-immunes. Lutilisation de modles murins transgniques a permis la mise en vidence dune population peu caractrise de lymphocytes T au potentiel rgulateur. En effet, la proportion de ces cellules T nexprimant pas les corcepteurs CD4 et CD8 (double ngatives, DN) a t inversement corrle la prdisposition lauto-immunit chez ces ii souris. Lobjectif principal de cette thse est de dmontrer la fonction immuno-rgulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs gntiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observ que les lymphocytes T DN exercent une activit cytotoxique lgard des lymphocytes B de faon spcifique lantigne, via la libration de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons tabli quun unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin dinhiber le dveloppement du diabte auto-immun chez des htes transgniques prdisposs la maladie. Le recours des souris dficientes pour lexpression du gne CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prdisposition au diabte auto-immun Idd13, qui contient le gne Sirp, a t identifi pour son rle dans la rgulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse gntique a rvl que dautres intervalles gntiques sont impliqus dans le contrle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situ en rgion proximale du chromosome 12 a t valid grce la cration de souris congniques. Grce aux rsultats prsents dans cette thse, notre comprhension de la biologie ainsi que de la rgulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la cration de thrapies cellulaires novatrices permettant de prvenir et de gurir diverses pathologies auto-immunes.
Resumo:
MHC class II-peptide multimers are important tools for the detection, enumeration and isolation of antigen-specific CD4+ Τ cells. However, their erratic and often poor performance impeded their broad application and thus in-depth analysis of key aspects of antigen-specific CD4+ Τ cell responses. In the first part of this thesis we demonstrate that a major cause for poor MHC class II tetramer staining performance is incomplete peptide loading on MHC molecules. We observed that peptide binding affinity for "empty" MHC class II molecules poorly correlates with peptide loading efficacy. Addition of a His-tag or desthiobiotin (DTB) at the peptide N-terminus allowed us to isolate "immunopure" MHC class II-peptide monomers by affinity chromatography; this significantly, often dramatically, improved tetramer staining of antigen-specific CD4+ Τ cells. Insertion of a photosensitive amino acid between the tag and the peptide, permitted removal of the tag from "immunopure" MHC class II-peptide complex by UV irradiation, and hence elimination of its potential interference with TCR and/or MHC binding. Moreover, to improve loading of self and tumor antigen- derived peptides onto "empty" MHC II molecules, we first loaded these with a photocleavable variant of the influenza A hemagglutinin peptide HA306-318 and subsequently exchanged it with a poorly loading peptide (e.g. NY-ESO-1119-143) upon photolysis of the conditional ligand. Finally, we established a novel type of MHC class II multimers built on reversible chelate formation between 2xHis-tagged MHC molecules and a fluorescent nitrilotriacetic acid (NTA)-containing scaffold. Staining of antigen-specific CD4+ Τ cells with "NTAmers" is fully reversible and allows gentle cell sorting. In the second part of the thesis we investigated the role of the CD8α transmembrane domain (TMD) for CD8 coreceptor function. The sequence of the CD8α TMD, but not the CD8β TMD, is highly conserved and homodimerizes efficiently. We replaced the CD8α TMD with the one of the interleukin-2 receptor a chain (CD8αTac) and thus ablated CD8α TMD interactions. We observed that ΤΙ Τ cell hybridomas expressing CD8αTacβ exhibited severely impaired intracellular calcium flux, IL-2 responses and Kd/PbCS(ABA) P255A tetramer binding. By means of fluorescence resonance energy transfer experiments (FRET) we established that CD8αTacβ associated with TCR:CD3 considerably less efficiently than CD8αβ, both in the presence and the absence of Kd/PbCS(ABA) complexes. Moreover, we observed that CD8αTacβ partitioned substantially less in lipid rafts, and related to this, associated less efficiently with p56Lck (Lck), a Src kinase that plays key roles in TCR proximal signaling. Our results support the view that the CD8α TMD promotes the formation of CD8αβP-CD8αβ dimers on cell surfaces. Because these contain two CD8β chains and that CD8β, unlike CD8α, mediates association of CD8 with TCR:CD3 as well as with lipid rafts and hence with Lck, we propose that the CD8αTMD plays an important and hitherto unrecognized role for CD8 coreceptor function, namely by promoting CD8αβ dimer formation. We discuss what implications this might have on TCR oligomerization and TCR signaling. - Les multimres de complexes MHC classe II-peptide sont des outils importants pour la dtection, le dnombrement et l'isolation des cellules Τ CD4+ spcifiques pour un antigne d'intrt. Cependant, leur performance erratique et souvent inadquate a empch leur utilisation gnralise, limitant ainsi l'analyse des aspects cls des rponses des lymphocytes Τ CD4+. Dans la premire partie de cette thse, nous montrons que la cause principale de la faible efficacit des multimres de complexes MHC classe II-peptide est le chargement incomplet des molcules MHC par des peptides. Nous montrons galement que l'affinit du peptide pour la molcule MHC classe II "vide" n'est pas ncessairement lie au degr du chargement. Grce l'introduction d'une tiquette d'histidines (His-tag) ou d'une molcule de desthiobiotine l'extrmit N-terminale du peptide, des monomres MHC classe II- peptide dits "immunopures" ont pu tre isols par chromatographic d'affinit. Ceci a permis d'amliorer significativement et souvent de faon spectaculaire, le marquage des cellules Τ CD4+ spcifiques pour un antigne d'intrt. L'insertion d'un acide amin photosensible entre l'tiquette et le peptide a permis la suppression de l'tiquette du complexe MHC classe- Il peptide "immunopure" par irradiation aux UV, liminant ainsi de potentielles interfrences de liaison au TCR et/ou au MHC. De plus, afin d'amliorer le chargement des molcules MHC classe II "vides" avec des peptides drivs d'auto-antignes ou d'antignes tumoraux, nous avons tout d'abord charg les molcules MHC "vides" avec un analogue peptidique photoclivable issu du peptide HA306-318 de l'hmagglutinine de la grippe de type A, puis, sous condition de photolyse, nous l'avons chang avec de peptides chargement faible (p.ex. NY-ESO-1119-143). Finalement, nous avons construit un nouveau type de multimre rversible, appel "NTAmre", bas sur la formation chlatante reversible entre les molcules MHC-peptide tiquetts par 2xHis et un support fluorescent contenant des acides nitrilotriacetiques (NTA). Le marquage des cellules Τ CD4+ spcifiques pour un antigne d'intrt avec les "NTAmres" est pleinement rversible et permet galement un tri cellulaire plus doux. Dans la deuxime partie de cette thse nous avons tudi le rle du domaine transmembranaire (TMD) du CD8α pour la fonction corceptrice du CD8. La squence du TMD du CD8α, mais pas celle du TMD du CD8β, est hautement conserve et permet une homodimrisation efficace. Nous avons remplac le TMD du CD8α avec celui de la chane α du rcepteur l'IL-2 (CD8αTac), liminant ainsi les interactions du TMD du CD8α. Nous avons montr que les cellules des hybridomes Τ T1 exprimant le CD8αTacβ prsentaient une atteinte svre du flux du calcium intracellulaire, des rponses d'IL-2 et de la liaison des ttramres Kd/PbCS(ABA) P255A. Grce aux expriences de transfert d'nergie entre molcules fluorescentes (FRET), nous avons montr que l'association du CD8αTacβ avec le TCR:CD3 est considrablement moins efficace qu'avec le CD8αβ, et ceci aussi bien en prsence qu'en absence de complexes Kd/PbCS(ABA). De plus, nous avons observ que le CD8αTacβ se distribuait beaucoup moins bien dans les radeaux lipidiques, engendrant ainsi, une association moins efficace avec p56Lck (Lck), une kinase de la famille Src qui joue un rle cl dans la signalisation proximale du TCR. Nos rsultats soutiennent l'hypothse que le TMD du CD8αβ favorise la formation des dimres de CD8αβ la surface des cellules. Parce que ces derniers contiennent deux chanes CD8β et que CD8β, contrairement CD8α, favorise l'association du CD8 au TCR:CD3 aussi bien qu'aux radeaux lipidiques et par consquent Lck, nous proposons que le TMD du CD8α joue un rle important, jusqu'alors inconnu, pour la fonction coreceptrice du CD8, en encourageant la formation des dimres CD8αβ. Nous discutons des implications possibles sur l'oligomerisation du TCR et la signalisation du TCR.
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La prolifration, la diffrenciation ainsi que les fonctions des cellules du systme immunitaire sont contrles en partie par les cytokines. Lors de linfection par le VIH-1, les dfauts observs dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du systme immunitaire sont en large partie attribus une production altre des cytokines et un manque defficacit au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces tudes, nous nous sommes intrsss la rgulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont lIL-18 et lIL-21. Nous avons observ une corrlation inverse significative entre les concentrations sriques dIL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infects par le VIH-1. Nos expriences in vitro ont dmontr que cette cytokine induit lapoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut tre inhibe par des anticorps neutralisants spcifiques pour FasL et TNF-. Cette mort cellulaire est due lexpression de FasL sur les cellules NK et la production de TNF- par ces cellules. LIL-18 augmente aussi la susceptibilit la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant lexpression de la protine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous dmontrons aussi que, contrairement lIL-18, les niveaux dIL-18BP sont plus faibles dans les srum de patients infects. Ceci rsulte sur une production non coordonne de ces deux facteurs, aboutissant des niveaux levs dIL-18 libre et biologiquement active chez les patients infects. Linfection de macrophages in vitro induit la production dIL-18 et rduit celle dIL-18BP. De plus, lIL-10 et le TGF-, dont les concentrations sont leves chez les patients infects, rduisent la production dIL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous dmontrons que lIL-18 augmente la rplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infects. Les niveaux levs dIL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infects contribuent donc limmuno-pathognse induite par le VIH-1 en perturbant lhomostasie des cellules NK ainsi quen augmentant la rplication du virus chez les patients. Ces tudes suggrent donc la neutralisation des effets nfastes de lIL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de lIL-18BP exogne. Ceci permettrait de moduler lactivit de lIL-18 in vivo des niveaux souhaitables. LIL-21 joue un rle clef dans le contrle des infections virales chroniques. Lors de ces tudes, nous avons dtermin la dynamique de la production dIL-21 lors de linfection par le VIH-1 et sa consquence sur la survie des cellules T CD4+ et la frquence des cellules T CD8+ spcifiques au VIH-1. Nous avons dmontr que sa production est compromise tt au cours de linfection et que les concentrations dIL-21 corrlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectes. Nos tudes ont dmontr que le traitement antirtroviral restaure partiellement la production dIL-21. De plus, linfection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en rduisant lexpression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi dmontr que la frquence des cellules T CD4+ spcifiques au VIH-1 qui produisent de lIL-21 est rduite chez les patients virmiques. Selon nos rsultats, lIL-21 empche lapoptose spontane des cellules T CD4+ de patients infects et labsence dIL-21 rduit la frquence des cellules T CD8+ spcifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos rsultats dmontrent que l'IL-21R est exprim de faon gale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infects. LIL-21 active les protines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilit des cellules NK, mais ne possde aucun effet sur leur prolifration. Nous dmontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions scrtrices et cytotoxiques ainsi que la viabilit des cellules NK provenant de patients chroniquement infects par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble prsenter ces effets sans augmenter en contrepartie la rplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la rplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectes d'une manire dpendante l'expression de perforine et l'utilisation de la protine LFA-1. Les niveaux dIL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur ltat de fonctionnalit de ce compartiment cellulaire. De plus, ces rsultats suggrent lutilisation de cette cytokine en tant quagent immunothrapeutique pour restaurer les niveaux normaux dIL-21 et augmenter la rponse antivirale chez les patients infects par le VIH-1.
