Cell cycle and apoptosis in normal and cloned bovine near-term placentae

The bovine maternal epithelium is composed of cuboidal cells interspersed with low columnar cells having centrally located nuclei. Bovine trophoblast is composed of two cell types: mononuclear trophoblastic and giant trophoblastic cells that can have two or more nuclei. Number of apoptotic cells and proliferative cells are variable in both cell populations. This study compared tissue growth and apoptosis by flow cytometry in the cell population found at distinct placental regions (central region of placentomes, <= 1-cm microplacentomes and the interplacentomal region) between normal and cloned near-term bovine pregnancies. After a morphological comparison between regions and groups (controls vs. clones), a lesser proportion of diploid to tetraploid cells was observed in the central region of placentomes and in microplacentomes from cloned-derived pregnancies. In addition, cloned animals had a fewer apoptotic cells in the central region of the placentome and in interplacentomal region and a greater proliferative capacity in all regions (cells in G(2)/M) near term as opposed to control animals. These results may reveal the existence of a relationship between such changes in the proportions of uterine and trophoblastic epithelial cells at the end of pregnancy and normal placental function. This could be related to faulty placentation in early pregnancy, placental insufficiency during pregnancy or lack of placental and/or fetal maturation in late pregnancy, which may contribute to someof the abnormalities after in vitro embryo manipulations, such as poor preparation and initiation of parturition, prolonged gestation and lesser post-natal survival in some cloned animals. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Fetal-Maternal Interactions in the Synepitheliochorial Placenta Using the eGFP Cloned Cattle Model

Background: To investigate mechanisms of fetal-maternal cell interactions in the bovine placenta, we developed a model of transgenic enhanced Green Fluorescent Protein (t-eGFP) expressing bovine embryos produced by nuclear transfer (NT) to assess the distribution of fetal-derived products in the bovine placenta. In addition, we searched for male specific DNA in the blood of females carrying in vitro produced male embryos. Our hypothesis is that the bovine placenta is more permeable to fetal-derived products than described elsewhere. Methodology/Principal Findings: Samples of placentomes, chorion, endometrium, maternal peripheral blood leukocytes and blood plasma were collected during early gestation and processed for nested-PCR for eGFP and testis-specific Y-encoded protein (TSPY), western blotting and immunohistochemistry for eGFP detection, as well as transmission electron microscopy to verify the level of interaction between maternal and fetal cells. TSPY and eGFP DNA were present in the blood of cows carrying male pregnancies at day 60 of pregnancy. Protein and mRNA of eGFP were observed in the trophoblast and uterine tissues. In the placentomes, the protein expression was weak in the syncytial regions, but intense in neighboring cells on both sides of the fetal-maternal interface. Ultrastructurally, our samples from t-eGFP expressing NT pregnancies showed to be normal, such as the presence of interdigitating structures between fetal and maternal cells. In addition, channels-like structures were present in the trophoblast cells. Conclusions/Significance: Data suggested that there is a delivery of fetal contents to the maternal system on both systemic and local levels that involved nuclear acids and proteins. It not clear the mechanisms involved in the transfer of fetal-derived molecules to the maternal system. This delivery may occur through nonclassical protein secretion; throughout transtrophoblastic-like channels and/or by apoptotic processes previously described. In conclusion, the bovine synepitheliochorial placenta displays an intimate fetal-maternal interaction, similar to other placental types for instance human and mouse. © 2013 Pereira et al.

Expression of steroidogenic proteins and genes in bovine placenta from conventional and somatic cell nuclear transfer (SCNT) gestations

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus.

Morphological and functional characterization of placenta during gestation in bovine clones derived by somatic nuclear transfer

La technique de clonage par transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) présente une page importante dans les annales scientifiques, mais son application pratique demeure incertaine dû à son faible taux de succès. Les anomalies placentaires et de développement fœtal se traduisent par des pertes importantes de gestation et des mortalités néonatales. Dans un premier temps, la présente étude a caractérisé les changements morphologiques des membranes fœtales durant la gestation clonée en les comparant à des gestations contrôles obtenues à partir de l’insémination artificielle. Les différentes anomalies morphologiques des placentomes telles que l’œdème chorioallantoique, la présence de zones hyperéchoiques et irrégulières dans la membrane amniotique et la présence de cellules inflammatoires dégénérées compromettent le développement fœtal normal de la gestation clonée. L’examen ultrasonographique représente une technique diagnostique importante pour faire le suivi d’une gestation et de caractériser les changements placentaires dans le cadre d’évaluation globale du bien-être fœtal. Le profil hormonal de trois stéroïdes (progestérone (P4), estrone sulfate (E1S), et œstradiol (E2)) et de la protéine B spécifique de gestation (PSPB) dans le sérum des vaches porteuses de clones SCNT a été déterminé et associé aux anomalies de gestations clonées. Une diminution de la P4 sérique au jour 80, une élévation du niveau de la concentration de la PSPB au jour 150, et une augmentation de la concentration d’E2 sérique durant le deuxième et troisième tiers de la gestation clonée coïncident avec les anomalies de gestation déjà reportées. Ces changements du profil hormonal associés aux anomalies phénotypiques du placenta compromettent le déroulement normal de la gestation clonée et gênent le développement et le bien-être fœtal. Sur la base des observations faites sur le placenta de gestation clonée, le mécanisme moléculaire pouvant expliquer la disparition de l’épithélium du placenta (l’interface entre le tissue maternel et le placenta) a été étudié. L’étude a identifié des changements dans l’expression de deux protéines d’adhérence (E-cadhérin et β-catenin) de cellules épithéliales pouvant être associées aux anomalies du placenta chez les gestations clonées. Le tissu de cotylédons provenant de gestations clonées et contrôles a été analysé par Western blot, RT-PCR quantitatif, et par immunohistochimie. Les résultats présentaient une diminution significative (p<0.05) de l’expression des dites protéines dans les cellules trophoblastiques chez les gestations clonées. Le RT-PCR quantitatif démontrait que les gènes CCND1, CLDN1 et MSX1 ciblés par la voie de signalisation de la Wnt/β-catenin étaient significativement sous exprimés. La diminution de l’expression des protéines E-cadherin et β-catenin avec une réduction de l’activation de la protéine β-catenin durant le période d’attachement de l’embryon peut potentiellement expliquer l’absence totale ou partielle de l’attachement des membranes fœtales au tissu maternel et éventuellement, l’insuffisance placentaire caractéristique des gestations clonées chez la vache. La caractérisation morphologique et fonctionnelle du placenta durant les gestations clonées à haut risque est essentielle pour évaluer le statut de la gestation. Les résultats de la présente étude permettront de prédire le développement et le bien-être fœtal de façon critique à travers un protocole standardisé et permettre des interventions médicales pour améliorer le taux de succès des gestations clonées chez les bovins.

Morpho-physical Recording of Bovine Conceptus (Bos indicus) and Placenta from Days 20 to 70 of Pregnancy

The study is based on 141 pregnant Bos indicus cows, from days 20 to 70 post-insemination. First, special attention was given to the macroscopically observable phenomena of attachment of the conceptus to the uterus, i.e. the implantation, from about days 20 to 30 post-insemination up to day 70, and placentome development by growth, vascularization and increase in the number of cotyledons opposite to the endometrial caruncles. Secondly, as for the conceptuses, semiquantitative, statistical analyses were performed of the lengths of chorio-allantois, amnion and yolk sac; and the different parts of the centre and two extremes of the yolk sacs were also analysed. Thirdly, the embryos/foetuses corresponding to their membranes were measured by their greatest length and by weight, and described by the appearance of external developmental phenomena during the investigated period like neurulation, somites, branchial arcs, brain vesicles, limb buds, C-form, pigmented eye and facial grooves. In conclusion, all the data collected in this study from days 20 to 70 of bovine pregnancy were compared extensively with corresponding data of the literature. This resulted in an `embryo/foetal age-scale`, which has extended the data in the literature by covering the first 8 to 70 days of pregnancy. This age-scale of early bovine intrauterine development provides model for studies, even when using slaughtered cows without distinct knowledge of insemination or fertilization time, through macroscopic techniques. This distinctly facilitates research into the cow, which is now being widely used as `an experimental animal` for testing new techniques of reproduction like in vitro fertilization, embryo transfer and cloning.

Evaluation of the contribution of the placentomal fusion during gestation in cattle

The placenta of mammals is a structure formed by the juxtaposition of the fetal membranes and the maternal tissues. The main function of the placenta is to regulate the physiological interchange between the fetus and the mother as well as to operate as an important endocrine organ during the gestation. The placentomal fusions were characterized throughout gestation of cattle using macroscopic, histological and flow cytometry analyses. Analyzing the cell cycle phases with a flow cytometry, a balance between the G2M phase and apoptosis was observed, suggesting that the placentomal fusions do not interfere in the placentary maturation process, which is a pre-requirement for the fetal-maternal disconnection and the release of fetal membrane. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

Delivery of cloned offspring: experience in Zebu cattle (Bos indicus)

The production of a healthy cloned calf is dependent on a multitude of successful steps, including reprogramming mediated by the oocyte, the development of a functional placenta, adequate maternal-fetal interaction, the establishment of a physiological metabolic setting and the formation of a complete set of well-differentiated cells that will eventually result in well-characterised and fully competent tissues and organs. Although the efficiency of nuclear transfer has improved significantly since the first report of a somatic cell nuclear transfer-derived animal, there are many descriptions of anomalies concerning cloned calves leading to high perinatal morbidity and mortality. The present article discusses some our experience regarding perinatal and neonatal procedures for cloned Zebu cattle (B. indicus) that has led to improved survival rates in Nellore cloned calves following the application of such `labour-intensive technology`.

Possible role of bovine trophoblast giant cells in transplacental transmission of Neospora caninum in cattle

Neospora caninum is an aplicomplexan parasite that has brought several concerns to cattle raisers worldwide due to its relationship to fetal loss. However, the mechanism of the parasite's transplacental infection and induced abortions are not completely understood. Bovine trophoblastic binucleated cells (BNC) play a major role in the maternal-fetal interactions, migrating during the entire pregnancy from chorionic connections to uterine epithelium. This study aimed to investigate the possible role of BNC as phagocytic cells and its participation in the bovine transplacental infection of N. caninum. BNC was isolated by discontinuous Percoll gradient, and characterized by Hoeschst 33342 nucleus-specific staining. Isolated BNC were cultured in DMEM supplemented with 10% bovine fetal serum, and infected with 10(4) tachyzoites of N. caninum NC-1 strain. Parasite invasion was visualized by indirect immunofluorescence and Giemsa technique. Multiplication of parasites took place in 2-3 day cycles. Healthy cows' placenta and normal and infected cultured BNC was immunostained with monoclonal antibodies against CD-163, MAC-387 and NOS, demonstrating their phagocyte capacity. Thus, BNC was characterized as cells with macrophagic activity, which may host N. caninum in vitro. Therefore, we may conclude that BNC could potentially participate in the transplacental infection of bovine neosporosis.

Caracterização das áreas hemófagas da placenta bovina

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeito da aplicação de prostaglandina (PGF2α) no pós-parto imediato sobre a incidência de retenção de placenta em vacas de leite

The purpose of this study was to evaluate the effect of an intramuscular injection of prostaglandin, within the first hour post partum, on the incidence of retained fetal membranes in cows, at 8 and 12 hours post-partum. Eighty-two cows were used as controls and 82 were treated with 25mg of prostaglandin (LUTALYSE®, 5ml), in two different farms. Cows treated with PGF 2α released the placenta faster (P < 0.10) than cows in the control group (7.72±0.84 vs. 10.07±1.09h). The incidence of retained placenta with more than 8h post partum was 30.5% in the control group and 17.1% in the treated group (P < 0.05), and with more than 12h was 19.5% in the control group and 12.2% in the treated group (P < 0.10). Farm, body condition score and parity showed influence on retained placenta rates, whereas sex of calf and help during calving did not have influence. These data showed that prostaglandin treatment within the first hour post-partum is capable of reduce the incidence of retained placenta and may work as a preventive treatment.