Desenvolvimento e validação de método analítico para determinação de teor de ácido gálico e catequina no fitoterápico sanativo® por cromatografia líquida de alta eficiência

The herbal medicine Sanativo® is produced by the Pernambucano Laboratory since 1888 with indications of healing and hemostasis. It is composed of a fluid extract about Piptadenia colubrina, Schinus terebinthifolius, Cereus peruvianus and Physalis angulata. Among the plants in their composition, S. terebinthifolius and P. colubrina have in common phenolic compounds which are assigned most of its pharmacological effects. The tannins, gallic acid and catechin were selected as markers for quality control. The aim of this study was the development and validation of analytical method by HPLC/UV/DAD for the separation and simultaneous quantification of gallic acid (GAC) and catechin (CTQ) in Sanativo®. The chromatographic system was to stationary phase, C-18 RP column, 4,6 x 150 mm (5 mm) under a temperature of 35 ° C, detection at 270 and 210 nm. The mobile phase consisted of 0.05% trifluoroacetic acid and methanol in the proportions 88:12 (v/v), a flow rate of 1 ml/min. The analytical method presented a retention factor of 0.30 and 1.36, tail factor of 1.8 and 1.63 for gallic acid and catechin, respectively, resolution of 18.2, and theoretical plates above 2000. The method validation parameters met the requirements of Resolution n º 899 of May 29, 2003, ANVISA. The correlation coefficient of linear regression analysis for GAC and CTQ from the standard solution was 0.9958 and 0.9973 and when performed from the Sanativo® 0.9973 and 0.9936, the matrix does not interfere in the range 70 to 110 %. The limits of detection and quantification for GAC and CQT were 3.25 and 0.863, and 9.57 and 2.55 mg/mL, respectively. The markers, GAC and CQT, showed repetibility (coefficient of variation of 0.94 % and 2.36 %) and satisfactory recovery (100.02 ± 1.11 % and 101.32 ± 1.36 %). The method has been characterized selective and robust quantification of GAC and CTQ in the Sanativo® and was considered validated

Desenvolvimento de um aditivo natural à base de catequina: otimização da extração e estabilização a partir de frutos de Arbutus unedo L.

The common Mediterranean ornamental strawberry-tree (Arbutus unedo L.) produces an edible reddish sweet berry that is found to be bland and tasteless unless it is consumed overripe, otherwise it is discarded or used as basic agricultural sub residue. The bioactive properties of this fruit have been reported and related with phenolic compounds, mainly flavan-3-ols, such as catechin and procyanidins, which has opened the opportunity to exploit their extraction from alternative sources.The common Mediterranean ornamental strawberry-tree (Arbutus unedo L.) produces an edible reddish sweet berry that is found to be bland and tasteless unless it is consumed overripe, otherwise it is discarded or used as basic agricultural sub residue. The bioactive properties of this fruit have been reported and related with phenolic compounds, mainly flavan-3-ols, such as catechin and procyanidins, which has opened the opportunity to exploit their extraction from alternative sources. This study compares and optimizes the maceration, microwave and ultrasound extraction techniques in the recovery of a catechin extract from Arbutus unedo L. fruits and evaluate the stability of flavan-3-ols during storage and application processes. To obtain conditions that maximize the catechin extraction yield, a response surface methodology was used. Maceration and microwave extractions were found to be the most effective methods, capable of yielding 1.38±0.1 and 1.70±0.3 mg of catechin/g dry weight (dw) in the corresponding optimal extraction conditions. The optimal conditions for maceration were 93.2±3.7 min, 79.6±5.2 ºC and 23.1±3.7 % of ethanol, while for the microwave extraction were 42.2±4.1 min, 137.1±8.1 ºC and 12.1±1.1 % of ethanol. The microwave system was a quicker solution, conducting to slightly higher yields of catechin than maceration, but this one needed lower temperatures to reach similar yields. The ultrasound method was the least effective solution in terms of catechin yield extraction (0.71±0.1 mg/g at 42.4±3.6 min, 314.9±21.2 W and 40.3±3.8 %. ethanol). The stability was tested with of the catechin-enriched extract (60% flavan-3-ols and 22% catechin), obtained under the best maceration conditions, was tested. Therefore, catechin-enriched extracts were submitted to physical and chemical stability studies, considering the main affecting variables (time, temperature and pH): i) a stability study of the extracts during storage as powder system; and ii) a stability study of the extracts in simulated food environment (aqueous solution system). The measured responses were the flavan-3-ols and catechin contents, determined by HPLC-DAD, and the antioxidant activity of the extracts evaluated by hydrophilic assays. Mechanistic and phenomenological equations were used to describe the responses, and the optimal conditions for flavan-3-ols (including catechin) stability as powder extract during a month were pH= 5.4 and T= -20ºC; while its stability in aqueous solution remained during the 24 h of application at pH<4 and T<30ºC. This study compares and optimizes the maceration, microwave and ultrasound extraction techniques in the recovery of a catechin extract from Arbutus unedo L. fruits and evaluate the stability of flavan-3-ols during storage and application processes. To obtain conditions that maximize the catechin extraction yield, a response surface methodology was used. Maceration and microwave extractions were found to be the most effective methods, capable of yielding 1.38±0.1 and 1.70±0.3 mg of catechin/g dry weight (dw) in the corresponding optimal extraction conditions. The optimal conditions for maceration were 93.2±3.7 min, 79.6±5.2 ºC and 23.1±3.7 % of ethanol, while for the microwave extraction were 42.2±4.1 min, 137.1±8.1 ºC and 12.1±1.1 % of ethanol. The microwave system was a quicker solution, conducting to slightly higher yields of catechin than maceration, but this one needed lower temperatures to reach similar yields. The ultrasound method was the least effective solution in terms of catechin yield extraction (0.71±0.1 mg/g at 42.4±3.6 min, 314.9±21.2 W and 40.3±3.8 %. ethanol). The stability was tested with of the catechin-enriched extract (60% flavan-3-ols and 22% catechin), obtained under the best maceration conditions, was tested. Therefore, catechin-enriched extracts were submitted to physical and chemical stability studies, considering the main affecting variables (time, temperature and pH): i) a stability study of the extracts during storage as powder system; and ii) a stability study of the extracts in simulated food environment (aqueous solution system). The measured responses were the flavan-3-ols and catechin contents, determined by HPLC-DAD, and the antioxidant activity of the extracts evaluated by hydrophilic assays. Mechanistic and phenomenological equations were used to describe the responses, and the optimal conditions for flavan-3-ols (including catechin) stability as powder extract during a month were pH= 5.4 and T= -20ºC; while its stability in aqueous solution remained during the 24 h of application at pH<4 and T<30ºC.

Extracção supercrítica de óleo de grainha de uva combinada com pré-tratamentos enzimáticos

Neste trabalho estudou-se a extracção supercrítica do óleo de grainha de uva, usando dióxido de carbono, e combinou-se este processo com um prétratamento enzimático da semente para aumentar o rendimento global da extracção. A qualidade dos extractos obtidos foi avaliada pelo seu conteúdo em triacilglicerídeos, perfil de ácidos gordos e capacidade antioxidante. Realizaram-se também alguns estudos exploratórios sobre a aplicação de um pré-tratamento de alta pressão (HPP) à grainha da uva. Adicionalmente, efectuou-se o estudo da extracção, fraccionamento e caracterização estrutural das procianidinas da grainha da uva, bem como a avaliação da sua capacidade antioxidante. A extracção de procianidinas da grainha da uva foi efectuada sequencialmente com metanol e acetona/água, tendo sido posteriormente fraccionadas por adição sucessiva de misturas metanol/clorofórmio progressivamente mais concentradas em clorofórmio. A caracterização das procianidinas foi feita por HPLC-UV e LC–MS, antes e depois de sujeitar as amostras a uma tiólise, e também por ESI-MS e ESI-MS/MS. Este estudo permitiu reportar, pela primeira vez, a ocorrência de procianidinas do tipo-A galoiladas na grainha da uva. Os resultados de HPLC-UV permitiram determinar o grau médio de polimerização das procianidinas e a sua composição monomérica em (+)- catequina, (-)-epicatequina e (-)-epicatequina-O-galato. Mostrou-se que a (+)- catequina é o flavan-3-ol terminal mais abundante e a (-)-epicatequina predomina largamente como unidade de extensão. No caso de procianidinas do tipo A, a ligação interflavânica C2-C7 encontra-se essencialmente nas unidades terminais. O grau médio de polimerização das diversas fracções varia entre 1.0 e 10.8. A sua capacidade antioxidante, medida pelo método espectrofotométrico de DPPH•, mostrou-se ser equivalente à de uma amostra comercial de (+)-catequina usada como referência. A partir dos graus médios de polimerização experimentais e das análises de FTIR das fracções correspondentes foi possível obter um modelo preditivo O-PLS com apenas uma variável latente. O pré-tratamento enzimático justificou-se pelo conhecimento existente acerca do uso de enzimas específicas que destroem parcialmente as paredes celulares. Atendendo à composição das paredes celulares da grainha da uva preparou-se uma suspensão contendo protease, xilanase, pectinase e celulase. Para determinar as condições experimentais do pré-tratamento que maximizam o rendimento da extracção, estudou-se o efeito do tempo de reacção, temperatura, pH, diâmetro médio das partículas de grainha moída e a concentração das enzimas. Os incrementos do rendimento da extracção de óleo observados atingiram 163.2%. O estudo da extracção supercrítica (SFE) do óleo da grainha de uva tratada e não-tratada permitiu obter as curvas de extracção correspondentes, bem com analisar a influência das condições operatórias sobre o seu andamento. Montou-se uma instalação laboratorial onde se realizaram experiências com dióxido de carbono a 160, 180, 200 e 220 bar e temperaturas de 313.15 e 323.15 K. Os rendimentos obtidos por SFE foram semelhantes aos de Soxhlet com n-hexano. As curvas de extracção medidas compreendem um primeiro período de extracção, onde se remove cerca de 92-97% do óleo disponível, e um segundo período, essencialmente difusional, com pouco impacto no rendimento final. Os vários extractos recolhidos e o óleo global obtido foram caracterizados para avaliar a sua qualidade e relacioná-la com as condições operatórias de SFE. Determinaram-se o conteúdo total em triacilglicerídeos, o seu perfil de ácidos gordos e a capacidade antioxidante (AOC). Os resultados mostraram que a AOC aumenta com a elevação da pressão e, acentuadamente, com o acréscimo da temperatura. Ao longo da curva de extracção, a AOC é mais pronunciada nos extractos iniciais, nomeadamente nos primeiros 30 a 40% da extracção. A modelação efectuada considerou que o óleo extractável se reparte entre células rompidas, predominantes na periferia da semente, e células intactas, mais interiores. Admitiu-se que o transporte de massa ocorre em série, i.e. das células intactas para as rompidas e destas para o solvente; mostrou-se que a dispersão axial era desprezável. Os balanços materiais à fase fluida e aos volumes de células rompidas e intactas, combinados com os fluxos interno, externo e a relação de equilíbrio foram resolvidos numericamente pelo método das linhas combinado com diferenças finitas atrasadas. O modelo reproduziu bem as curvas experimentais e permitiu simular curvas de eluição e os três perfis de concentração no leito.

Phenolic compounds from forest industrial by-products

Em Portugal, as indústrias corticeira e de pasta de papel constituem um importante sector económico, contudo, gerando elevadas quantidades de subprodutos. Estes subprodutos poderiam ser explorados em aplicações de alto valor acrescentado, como fonte de compostos fenólicos, por exemplo, em vez de serem apenas queimados para produção de energia. Estes compostos são conhecidos pelas suas inúmeras propriedades, entre as quais, antioxidante, anti-inflamatória e anti-trombótica. Neste estudo as frações fenólicas da maior parte dos subprodutos gerados nas indústrias corticeira e de pasta de papel foram caracterizados em detalhe, com vista à sua valorização. A fração fenólica das cascas de Eucalyptus globulus, E. grandis, E. urograndis e E. maidenii, bem como da cortiça de Quercus suber e resíduos provenientes da sua exploração, nomeadamente, o pó de cortiça e os condensados negros, foi obtida por processos convencionais de extração sólido-líquido. No caso da casca de E. globulus, foi ainda avaliado o potencial de metodologias “verdes” no processo de extração de compostos fenólicos, usando extração com CO2 supercrítico. Esta técnica foi otimizada com recurso a metodologias de superfície de resposta. Na identificação e quantificação dos compostos fenólicos foi usada cromatografia líquida de alta resolução aliada a técnicas de espectrometria de massa. O teor de fenólicos totais foi ainda determinado pelo método de Folin- Ciocalteu, essencialmente para efeitos comparativos. A caracterização da fração fenólica de cada extrato foi ainda complementada com a análise da atividade antioxidante, usando o radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Foram identificados trinta compostos fenólicos na casca de E. globulus, 17 deles referenciados pela primeira vez como seus constituintes, nomeadamente os ácidos quínico, di-hidroxifenilacétic, cafeico e metil-elágico, bis-hexahidroxidifenoil( HHDP)-glucose, galoil- bis-HHDP-glucose, galoil-HHDPglucose, isoramnetina—hexosídeo, quercetina-hexosídeo, ácido metil-elágicopentosídeo, miricetina-ramnosídeo, isoramnetina-ramnosídeo, mearnsetina, floridzina, mearnsetina-hexosídeo, luteolina e uma proantocianidina B. Neste trabalho, foi estudada pela primeira vez a composição fenólica das cascas de E. grandis, E. urograndis e E. maidenii. Treze, doze e vinte e quatro compostos fenólicos foram identificados nas cascas de E. grandis, E. urograndis e E. maidenii, respetivamente. Entre estes compostos encontram-se os ácidos quínico, gálico, metilgálico, protocatequínico, clorogénico e elágico, catequina, galoil-bis-HHDP-glucose, digaloilglucose, epicatequina, quercetina-glucoronídeo, di-hidroxiisopropilcromona- hexosídeo, isoramnetina-hexosídeo, ácido elágicoramnosídeo, taxifolina, quercetina-hexosídeo, di-hidroxi- (metilpropil)isopropilcromona-hexosídeo, ácido metil-elágico-pentosídeo, miricetina-ramnosídeo, isoramnetina-ramnosídeo, aromadendrina-ramnosídeo, mearnsetina, mearnsetina-hexosídeo, eriodictiol, quercetina, isoramnetina e naringenina. A análise da fração fenólica da cortiça permitiu identificar vinte e dois compostos fenólicos, dez deles referenciados pela primeira vez como seus constituintes, nomeadamente, os ácidos quínico, salicílico, p-hidroxifenillático e metilgálico, ácido carboxílico da brevifolina, eriodictiol, naringenina, um éster isoprenílico do ácido cafeico, isoramnetina-ramnosídeo e isoramnetina. No pó de cortiça industrial foram identificados dezasseis compostos fenólicos, nomeadamente os ácidos quínico, gálico, protocatequínico, cafeico, ferúlico, elágico e metilgálico, esculetina, ácido carboxílico da brevifolina, coniferaldeído, um éster isoprenílico do ácido cafeico, uma dilactona do ácido valoneico, ácido elágico-pentosídeo, ácido elágico-ramnosídeo, isoramnetinaramnosídeo e isoramnetina. Destes, apenas o ácido elágico foi previamente referenciado como componente do pó de cortiça. Do mesmo modo, treze compostos fenólicos foram identificados no condensado negro, doze deles referenciados pela primeira vez como seus constituintes. São eles os ácidos quínico, gálico, p-hidroxifenil-láctico, protocatequínico, p-coumarico, cafeico e elágico, vanilina, esculetina, coniferaldeído, um éster isoprenílico do ácido cafeico e o eriodictiol. A extração supercrítica de compostos fenólicos da casca de eucalipto permitiu não só verificar os parâmetros que afetam a qualidade e quantidade finais dos extratos, como também obter os valores ótimos para estes parâmetros. Esta extração mostrou ainda ser bastante seletiva para determinados grupos de compostos fenólicos, como as flavanonas eriodictiol e naringenina e para o flavonol O-metilado isoramnetina. Este é também o primeiro estudo envolvendo a determinação da atividade antioxidante de extratos da cortiça e dos resíduos da sua exploração, bem como da casca de E. grandis, E. urograndis e E. maidenii. A vasta gama de compostos fenólicos identificados em cada extrato analisado, assim como as prominentes atividades antioxidantes, todas na mesma gama de valores do bem conhecido antioxidante comercial, ácido ascórbico, são claramente um grande contributo para a valorização destes subprodutos industriais.

Desenvolvimento de filmes à base de quitosano com microencapsulação de agentes naturais: cinéticas de libertação

Dissertação de mestrado, Tecnologia de Alimentos, Instituto Superior de Engenharia, Universidade do Algarve, 2013

Avaliação das variáveis analíticas dos métodos de determinação do teor de taninos totais baseados na formação de complexos com substâncias protéicas e derivados da polivinilpirrolidona

O presente trabalho objetivou estudar as principais variáveis analíticas associadas aos métodos espectrofotométricos de quantificação do teor de taninos utilizando caseína e pó-de-pele, os reagentes de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu, bem como a avaliação de diferentes tipos de PVPP (Divergan® F, Divergan® RS, Kollidon® CL e PVPP-P6755) na substituição dos substratos protéicos. Para tanto, dois métodos de análise, um espectrofotométrico e outro por CLAE foram desenvolvidos, utilizando os polifenóis catequina, ácido tânico, ácido gálico e pirogalol como substâncias de referência e rutina como flavonóide modelo. Para maiores inferências uma solução extrativa de folhas secas de Psidium guajava L também foi quantificada. A análise comparativa assinalou o uso vantajoso do reagente de Folin-Ciocalteu, em relação ao reagente de Folin-Denis. Em termos de reprodutibilidade, a caseína grau técnico (GT) mostrou-se superior à caseína purificada, embora essa última possua maior afinidade pelos polifenóis testados. Contudo, as análises por UV-VIS e por CLAE em comprimentos de onda de 280m e 352 nm, demonstraram que tanto a caseína GT quanto o pó-de-pele não são seletivos para complexar taninos, de acordo com as normas do ICH. Tanto o pó-de-pele quanto a caseína GT foram capazes de complexar polifenóis e rutina de maneira inespecífica. Isso foi evidenciado quando misturas de um único polifenol e rutina ou a fração flavonoídica de P. guajava foram testadas. A capacidade de complexação de polifenóis e rutina por parte da PVPP foi avaliada por UV-VIS, DSC e CLAE. Os melhores resultados foram observados para PVPP-P6755, no entanto com restrições. De maneira similar a caseína GT e pó-depele a PVPP-P6755 foram capazes de complexar de maneira inespecífica rutina e outros flavonóides do extrato de P. guajava. Uma validação plena para o caso específico de folhas de P. guajava é questionável. No entanto, o método baseado na utilização de PVPP mostrou-se passível de padronização utilizando 500,0 mg de pó de droga, 2,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu, tempo de leitura 30 min após adição desse reagente e quantificação em 760 nm. Sob essas condições, a análise comparativa demonstrou que 50,0 mg de PVPP foram, em termos analíticos, equivalentes a 100,0 mg de pó-de-pele ou a 750 mg de caseína GT.

Atividade antibacteriana das plantas copaifera duckei dwyer e pseudobombax marginatum e sua interação com a superfície celular bacteriana

A resistência microbiana a antimicrobianos tem favorecido a busca por substâncias bioativas provenientes de plantas usadas na medicina popular, com o intuito de se obter novos fármacos com atividade antimicrobiana. Neste estudo, foi proposta a investigação da atividade antibacteriana do óleo-resina de Copaifera duckei e de diferentes extratos da casca de Pseudobombax marginatum, e seus possíveis mecanismos de ação. O potencial inibitório antibacteriano foi avaliado utilizando-se os métodos de difusão e diluição em ágar, e a bioautografia. O mecanismo de ação foi analisado por microscopia eletrônica, no qual se observou alterações na ultraestrutura bacteriana, e por eletroforese em SDS-PAGE, que determinou ação sobre as proteínas das superfícies celulares. A análise química foi realizada pelas técnicas de Espectrometria de massas acoplada ao Cromatógrafo a gás- EM/CG (C. duckei) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência- CLAE (P. marginatum). Entre as bactérias estudadas, B. cereus foi a mais suscetível às plantas em estudo, com concentrações inibitórias mínimas (CIMs) correspondentes a 0,3125 mg/mL para o óleo-resina de copaíba, e 0,5 mg/mL para extrato hidroalcoólico (1:1) e 0,512 mg/mL para a fração butanólica da casca P. marginatum, nos quais pôde-se observar alterações na parede celular do B. cereus, com remoção da camada S, espessamento da parede celular e formação de diversos septos nos centros de divisão celular. A análise química por EM/CG mostrou compostos terpênicos no óleo-resina de C. duckei, tendo como composto majoritário o β-bisaboleno, e a análise por CLAE mostrou a presença de compostos derivados da catequina na casca do P. marginatum. Desta forma, as plantas em estudo mostram um potencial antibacteriano considerável, podendo contribuir tanto na terapia antimicrobiana como na área de alimentos, tendo como um de seus prováveis sítios de ação a parede celular bacteriana

Avaliação química e da atividade antidiarréica das folhas de Byrsonima cinera DC. (Malpighiaceae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Atividade mutagênica e ativadora da resposta imune celular induzidas por Byrsonima crassa Niedenzu e Byrsonima intermedia A.Juss. (Malpighiaceae)

Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR

Identificação de inibidores de pectinase fúngica para o controle de formigas cortadeiras

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Determinação do potencial biológico e antioxidante de extratos de casca de raiz de Maytenus ilicifolia (Celastraceae)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Extrato metanólico de folhas de mandioca como alternativa ao controle da lagarta-do-cartucho e de formigas cortadeiras

The objective of this study was to characterize phenolic compounds and evaluate the effect, under laboratory conditions, of the cassava leaf powder methanol extract on the development of fall armyworm Spodoptera frugiperda and of leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa. The extract was incorporated into an artificial diet, to which the armyworm was exposed, at concentrations of 250, 500, 1000 and 1500 mg kg-1,in order to evaluate biological characteristics. Soon after the insects emergence, another experiment was conducted to verify the possible sub lethal activity of the extract; therefore, S. frugiperda couples were isolated in cages and eggs were collected and counted. The Manihot esculenta Crantz extract caused a reduction in the percentage of armyworm survival, as well as in the eggs number. Then, the same extract was solubilized in 10% ethanol and applied to ants; mortality was observed, compared to the control. It is possible to conclude that the M. esculenta Crantz leaf powder methanolic extract, containing gallic acid and catechin, is a promising alternative to control S. frugiperda and Atta sexdens rubropilosa.

Uso sustentável da biodiversidade brasileira: prospecção químico-farmacológica em plantas superiores: Miconia spp

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Atividade anti-Helicobacter pylori e potencial antioxidante de espécies vegetais do Cerrado brasileiro

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Prospecção de moléculas químicas com propriedades alelopáticas em Acacia mangium (Willd.)

Muito se tem estudado sobre o potencial que algumas plantas têm de inibir o desenvolvimento de outras plantas. Em busca de alternativas para reduzir a dependência de herbicidas sintéticos, diminuindo os danos ambientais e prejuízos à saúde humana e procurando alternativas à resistência aos herbicidas do mercado, os compostos naturais oferecem excelentes perspectivas. Este trabalho isola, identifica as estruturas e caracteriza a atividade alelopática de duas substâncias químicas produzidas pela espécie Acacia mangium. Para isso, procede-se com solução hidroalcoólica (7:3) extração exaustiva das folhas secas caídas, folhas verdes, raízes e sementes dessa espécie, passando-se pela recuperação do etanol (evaporador rotativo) e liofilização dos extratos para a desidratação e obtenção do extrato bruto hidroalcoólico (EBHA). Para identificar qual parte da planta possui maior potencial alelopático, é preparado um bioensaio com a utilização de solução hidroalcoólica (7:1) de cada EBHA em concentração de 1%. É determinado o potencial inibitório sobre a germinação, desenvolvimento do hipocótilo e desenvolvimento da radícula das sementes das plantas daninhas malícia (Mimosa pudica), mata-pasto (Senna alata) e puerária (Pueraria phaseoloides). 10 g do EBHA das folhas caídas são submetidas à CCVU para separação das substâncias, a partir do qual são obtidas quatro reuniões de substâncias semelhantes. Três delas são refracionadas em colunas menores (R1’, R2- R3’, R4’) e da coluna R1’ são isoladas as substâncias Lupenona e Lupeol. Nos bioensaios com os extratos, o das folhas secas apresenta as inibições mais acentuadas, notadamente sobre a germinação (99%). Nesta característica, mata-pasto é a espécie de menor sensibilidade, com inibições abaixo de 12%. São realizados bioensaios com as substâncias isoladas e em par (solubilizadas em clorofórmio), na concentração de 140 ppm, sobre as sementes de Mimosa pudica e Senna obtusifolia. Para a germinação das sementes, as substâncias em todos os tratamentos não evidenciam qualquer efeito. Para o desenvolvimento da radícula, ambas as substâncias, isoladamente, promovem inibições em torno de 40% sobre duas espécies de plantas daninhas, enquanto que em par, observa-se que há antagonismo entre as substâncias, já que os resultados são inferiores, ficando ao redor de 30%. Com relação ao crescimento do hipocótilo a inibição em todos os tratamentos fica em torno de 15% e não há diferença significativa entre os resultados. É testado também o efeito do pH (3,0 e 9,0) na atividade alelopática das substâncias, isoladas e em par, sobre a germinação das sementes de malícia e observa-se que há interação para os fatores pH e germinação, havendo maior atividade inibitória da lupenona em condições ácidas e do lupeol em condições alcalinas. Não há efeito aditivo ou negativo quando da associação das substâncias. É realizada também análise por HPLC nos extratos brutos hidroalcoólicos de três partes da planta Acacia mangium para a detecção dos flavonóides catequina e epicatequina (substâncias com comprovado efeito alelopático), sendo que a epicatequina é a substância com absorção para os espetros selecionados, mostrando que esta substância pode ter contribuído para os resultados expressivos observados nos primeiros bioensaios com os extratos brutos das partes das plantas.