Efeito do número da passagem e do gênero das células doadoras de núcleo no desenvolvimento de bovinos produzidos por transferência nuclear

Objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito do número da passagem e do sexo das células doadoras de núcleo no desenvolvimento embrionário e fetal após transferência nuclear. Para isso, oócitos bovinos foram maturados, enucleados e reconstruídos com células somáticas de animal adulto. Após a fusão e ativação química, os zigotos reconstituídos foram cultivados em Charles Rosenkranz 2 (CR2) com monocamada de células da granulosa a 38,8ºC em atmosfera umidificada a 5% de CO2 em ar, durante sete dias, e transferidos para receptoras sincronizadas. As taxas de clivagem e desenvolvimento a blastocisto de embriões reconstruídos com células cultivadas por tempo maior foram inferiores às obtidas com os demais tempos de cultivo. Além disso, os blastocistos produzidos não resultaram no desenvolvimento de uma gestação a termo. Embora a taxa de clivagem em embriões fêmeas tenha sido maior, o número de embriões que atingiram o estádio de blastocisto foi maior nos embriões machos. No período gestacional, fêmeas apresentaram maior taxa de aborto entre 90 e 120 dias de gestação. Esses resultados indicam que células doadoras de núcleos cultivados por longos períodos dificultam a produção de blastocistos e aumentam as chances de perdas durante a gestação. Embriões clonados machos têm maior competência para se desenvolver a blastocisto e resultam em menor taxa de perda gestacional.

Autotransplantação de células estaminais olfactivas no tratamento das lesões traumáticas crónicas da medula espinal : estudos da região olfactiva e da sua mucosa

O objectivo principal dos estudos descritos nesta dissertação foi descrever a anatomia cirúrgica da região olfactiva, determinar a área de distribuição da mucosa olfactiva nas fossas nasais e estudar as células estaminais nela presentes para fundamentar e desenvolver uma técnica cirúrgica destinada à sua colheita por via transnasal endoscópica. O objectivo secundário foi avaliar a exequibilidade, segurança e eficácia da utilização da mucosa olfactiva na reparação das lesões traumáticas crónicas e severas da medula espinal. As investigações incluíram a dissecção endoscópica e estudos morfométricos da região olfactiva de cadáveres recentes, o exame histológico de especímenes de um banco de peças anatómicas da região olfactiva e a cultura de células estaminais olfactivas obtidas a partir de amostras de indivíduos sem patologia naso-sinusal. Realizaram-se ainda estudos clínicos experimentais nos quais se transplantou a mucosa olfactiva colhida das fossas nasais na medula espinal de doentes com lesões traumáticas da medula espinal. Os estudos foram realizados num hospital de nível terciário com afiliação universitária, o Hospital de Egas Moniz do Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental: em serviços clínicos (Serviço de Otorrinolaringologia) ou em unidades vocacionadas para a investigação (Unidade de Microcirurgia, Unidade de Neuropatologia). Parte dos estudos foram ainda realizados em locais externos à instituição, como o Serviço de Patologia Forense da Delegação de Lisboa do Instituto de Medicina Legal e a ECBio, I&D em Biotecnologia, S.A. Demonstrou-se que a região olfactiva pode ser abordada sistematicamente por técnica endoscópica. Demonstrou-se a área de distribuição da mucosa olfactiva nas fossas nasais e concebeu-se uma técnica para sua a colheita. Isolaram-se e quantificaram-se as células estaminais da mucosa olfactiva e colaborou-se na invenção de um método destinado à sua cultura e proliferação, que poderá ter valor na utilização das células cultivadas em outras patologias. Demonstrou-se ainda que, no tratamento dos doentes com lesões traumáticas crónicas da medula espinal, a transplantação de mucosa olfactiva autóloga é realizável, razoavelmente segura e potencialmente benéfica

Validação do método de extração e quantificação de 7-hidróxi- 4',6-dimetóxi-isoflavona em culturas de células em suspensão e calos de Dipteryx odorata

O presente trabalho consiste no desenvolvimento e validação de um método analítico por CLAE/DAD para a detecção da 7-hidróxi-4',6-dimetóxisoflavona em culturas de células em suspensão e calos de Dipteryx odorata cultivados in vitro. Os parâmetros de validação: curva analítica, linearidade, precisão, recuperação, limite de detecção e limite de quantificação foram avaliados e os resultados obtidos demonstraram que o procedimento analítico proposto para a detecção e dosagem desta isoflavona está dentro dos parâmetros recomendados pela RE899/03-ANVISA, podendo ser utilizado para o controle de qualidade de culturas de células cultivadas in vitro desta espécie vegetal.

Produção de progesterona in vitro pelas células do corpo lúteo bovino ao longo da gestação

O presente trabalho foi desenvolvido para testar a hipótese de que células luteínicas bovinas em cultivo, provenientes dos três terços de gestação, comportam-se da mesma maneira que células in vivo em relação à produção de P4. Foram coletadas amostras de corpos lúteos (CL) de 90 (n=3), 150 (n=3) e 210 (n=3) dias de gestação obtidos em abatedouro. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 poços. Após 24 horas de cultivo foram feitas a lavagem dos poços e a adição do precursor pregnenolona. Os tratamentos foram realizados em octuplicata para cada tempo de tratamento (24, 48 e 96 horas) com três repetições de cada período gestacional. As amostras de meio de cultura e as células foram coletadas 24, 48 e 96 horas após adição do precursor e acondicionadas em freezer a -20ºC até o processamento. A progesterona foi dosada através de radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os resultados foram analisados estatisticamente e considerados diferentes quando p<0.05. Foi observada maior produção de P4 aos 90 dias de gestação (35,277±0,075), posterior decréscimo aos 150 dias (28,820±0,231) e novo aumento aos 210 dias (32,777±0,099). A produção de P4 em células cultivadas por 24 horas foi maior (p<0,05) em células oriundas do grupo de 90 dias (2,912±0,047) quando comparado a 150 (2,669±0,137) e 210 dias (2,741±0,088). As 48 e 96 horas de cultivo, células luteínicas bovinas de 90 dias produziram mais P4 que células de 210 dias (2,934±0,029 e 2,976±0,121 respectivamente x 2,760±0,059 e 2,695±0,149, respectivamente; p<0,05), que por sua vez produziram mais do que células de 150 dias (2,334±0,084 para 48 horas e 2,205±0,136 para 96 horas). Aos 150 dias de gestação a produção de progesterona apresentou diminuição gradativa ao longo das 96 horas de cultivo. Essas diferenças podem ser explicadas pela expressão gênica diferencial de enzimas ou também de fatores presentes na cascata esteroidogênica de acordo com a idade gestacional. Este modelo de cultura celular luteínica poderá ser utilizado em estudos funcionais uma vez que o padrão de secreção de P4 mimetizou o que ocorre in vivo.

Diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais da medula óssea de cães em precursores osteogênicos

O objetivo principal da nossa pesquisa foi avaliar o potencial de diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas da medula óssea do cão. As MSC foram separadas pelo método Ficoll e cultivadas sob duas condições distintas: DMEM baixa glicose ou DMEM/F12, ambos contendo L-glutamina, 20% de SFB e antibióticos. Marcadores de MSC foram testados, confirmando células CD44+ e CD34- através da citometria de fluxo. Para a diferenciação osteogênica, as células foram submetidas a quatro diferentes condições: Grupo 1, as mesmas condições utilizadas para a cultura de células primárias com os meios DMEM baixa glicose suplementado; Grupo 2, as mesmas condições do Grupo 1, mais os indutores de diferenciação dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato; Grupo 3, células cultivadas com meios DMEM/F12 suplementado; e Grupo 4, nas mesmas condições que no Grupo 3, mais indutores de diferenciação de dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato. A diferenciação celular foi confirmada através da coloração com alizarin red e da imunomarcação com o anticorpo SP7/Osterix. Nós observamos através da coloração com alizarin red que o depósito de cálcio foi mais evidente nas células cultivadas em DMEM/F12. Além disso, usando a imunomarcação com o anticorpo SP/7Osterix obtivemos positividade em 1:6 células para o Meio DMEM/F12 comparada com 1:12 para o meio DMEM-baixa glicose. Com base nos nossos resultados concluímos que o meio DMEM/F12 é mais eficiente para a indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais caninas em promotores osteogênicos. Este efeito provavelmente ocorre em decorrência da maior quantidade de glicose neste meio, bem como da presença de diversos aminoácidos.

Plasticidade de células tronco mesenquimais de medula óssea de ratos na presença de meio condicionado do nervo facial e do fator de crescimento fibroblástico 2

A number of evidences show the influence of the growth of injured nerve fibers in Peripheral Nervous System (PNS) as well as potential implant stem cells (SCs) to make it more suitable for nerve regeneration medium. In this perspective, this study aimed to evaluate the plasticity of mesenchymal stem cells from bone marrow of mice in the presence of culture medium conditioned with facial nerve explants (D-10) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2). In this perspective, the cells were cultivated only with DMEM (group 1), only with D-10(group 2), only with FGF-2(group 3) or with D-10 and FGF-2(group 4). The growth and morphology were assessed over 72 hours. Quantitative phenotypic analysis was taken from the immunocytochemistry for GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulin III, NeuN and NF-200 on the fourth day of cultivation. Cells cultured with conditioned medium alone or combined with FGF-2 showed distinct morphological features similar apparent at certain times with neurons and glial cells and a significant proliferative activity in groups 2 and 4 throughout the days. Cells cultived only with conditioned medium acquired a glial phenotype. Cells cultured with FGF-2 and conditioned medium expressed GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulin III, NeuN and NF-200. On average, area and perimeter fo the group of cells positive for GFAP and the área of the cells immunostained for OX-42 were higher than those of the group 4. This study enabled the plasticity of mesenchymal cells (MCs) in neuronal and glial nineage and opened prospects for the search with cell therapy and transdifferentiation

Efeitos da laserterapia na atividade biológica de células de carcinoma epidermóide de língua humano

The low level laser therapy (LLLT) has shown to be effective in promoting the proliferation of different cells in vitro, including keratinocytes, osteoblasts, endothelial cells and stem cells. It has been speculated that the biostimulatory effect of LLLT could cause undesirable enhancement of tumor growth in neoplastic diseases, since the malignant cells are more susceptible to proliferative stimuli. Within this context, this study evaluated the effect of LLLT on epidermoid carcinoma of the tongue cell line (SCC25) proliferation and invasion. Cultured cells were irradiated with an InGaAIP diode laser, 660nm, 30mW using two energy densities (0.5J/cm2 and 1.0J/cm2). Proliferative activity was assessed through trypan blue staining method and through cell cycle analysis using flow cytometry. The invasive potential was measured through cell invasion assay using matrigel. Cyclin D1, E-cadherin, -catenin and MMP-9 expressions were analyzed by immunofluorescence and flow cytometry and related to the investigated biological activities. Proliferation curve demonstrated that SCC25 irradiated with 1.0J/cm2 had the highest proliferative rate when compared to the control group and the group irradiated with 0.5J/cm2 (p<0.05). LLLT affected cell cycle distribution and energy density of 1.0 J/cm2 promoted a higher percentage of cells in S/G2/M phases, with statistically significant differences at 24h interval (p<0.05). LLLT, mainly with 1.0J/cm2, revealed significantly higher potential for invasion and influenced the expression of cyclin D1, E-cadherin, -catenin and MMP-9, promoting the malignant phenotype. In conclusion, our results indicate that LLLT has an important stimulatory effect on proliferation and invasion of SCC25 cells, likely due to altered expression of proteins associated with these processes

Diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais da medula óssea de cães em precursores osteogênicos

O objetivo principal da nossa pesquisa foi avaliar o potencial de diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas da medula óssea do cão. As MSC foram separadas pelo método Ficoll e cultivadas sob duas condições distintas: DMEM baixa glicose ou DMEM/F12, ambos contendo L-glutamina, 20% de SFB e antibióticos. Marcadores de MSC foram testados, confirmando células CD44+ e CD34- através da citometria de fluxo. Para a diferenciação osteogênica, as células foram submetidas a quatro diferentes condições: Grupo 1, as mesmas condições utilizadas para a cultura de células primárias com os meios DMEM baixa glicose suplementado; Grupo 2, as mesmas condições do Grupo 1, mais os indutores de diferenciação dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato; Grupo 3, células cultivadas com meios DMEM/F12 suplementado; e Grupo 4, nas mesmas condições que no Grupo 3, mais indutores de diferenciação de dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato. A diferenciação celular foi confirmada através da coloração com alizarin red e da imunomarcação com o anticorpo SP7/Osterix. Nós observamos através da coloração com alizarin red que o depósito de cálcio foi mais evidente nas células cultivadas em DMEM/F12. Além disso, usando a imunomarcação com o anticorpo SP/7Osterix obtivemos positividade em 1:6 células para o Meio DMEM/F12 comparada com 1:12 para o meio DMEM-baixa glicose. Com base nos nossos resultados concluímos que o meio DMEM/F12 é mais eficiente para a indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais caninas em promotores osteogênicos. Este efeito provavelmente ocorre em decorrência da maior quantidade de glicose neste meio, bem como da presença de diversos aminoácidos.

Polímeros biorreabsorvíveis como substrato para cultura de células e engenharia tecidual

Biomateriais poliméricos são desenvolvidos para uso como substitutos de tecidos danificados e/ou estimular sua regeneração. Uma classe de biomateriais poliméricos são os biorreabsorvíveis, compostos que se decompõem tanto in vitro quanto in vivo. São empregados em tecidos que necessitam de um suporte temporário para sua recomposição tecidual. Dentre os vários polímeros biorreabsorvíveis, destacam-se os alfa-hidróxi ácidos, entre eles, diferentes composições do poli(ácido lático) (PLA), como o poli(L-ácido lático) (PLLA), poli(D-ácido lático) (PDLA), poli(DL-ácido lático) (PDLLA), além do poli(ácido glicólico) (PGA) e da policaprolactona (PCL). Estes polímeros são considerados biorreabsorvíveis por apresentarem boa biocompatibilidade e os produtos de sua decomposição serem eliminados do corpo por vias metabólicas. Diversas linhas de pesquisa mostram que os diferentes substratos à base de PLA estudados não apresentam toxicidade, uma vez que as células são capazes de crescer e proliferar sobre eles. Além disso, diversos tipos de células cultivadas sobre diferentes formas de PLA são capazes de se diferenciarem sobre os diferentes polímeros e passar a produzir componentes de matriz extracelular. Neste trabalho, é revisada a utilização de substratos à base de alfa-hidróxi ácidos, com destaque para diferentes formas de PLA, utilizados como substratos para cultura de células, bem como suas aplicações.

Obtenção e caracterização de populações de células-tronco CD200 e CD34 positivas da pele na espécie canina

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Obtenção e caracterização de populações de células-tronco CD200 e CD34 positivas da pele na espécie canina

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais da medula óssea de cães em precursores osteogênicos

O objetivo principal da nossa pesquisa foi avaliar o potencial de diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas da medula óssea do cão. As MSC foram separadas pelo método Ficoll e cultivadas sob duas condições distintas: DMEM baixa glicose ou DMEM/F12, ambos contendo L-glutamina, 20% de SFB e antibióticos. Marcadores de MSC foram testados, confirmando células CD44+ e CD34- através da citometria de fluxo. Para a diferenciação osteogênica, as células foram submetidas a quatro diferentes condições: Grupo 1, as mesmas condições utilizadas para a cultura de células primárias com os meios DMEM baixa glicose suplementado; Grupo 2, as mesmas condições do Grupo 1, mais os indutores de diferenciação dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato; Grupo 3, células cultivadas com meios DMEM/F12 suplementado; e Grupo 4, nas mesmas condições que no Grupo 3, mais indutores de diferenciação de dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato. A diferenciação celular foi confirmada através da coloração com alizarin red e da imunomarcação com o anticorpo SP7/Osterix. Nós observamos através da coloração com alizarin red que o depósito de cálcio foi mais evidente nas células cultivadas em DMEM/F12. Além disso, usando a imunomarcação com o anticorpo SP/7Osterix obtivemos positividade em 1:6 células para o Meio DMEM/F12 comparada com 1:12 para o meio DMEM-baixa glicose. Com base nos nossos resultados concluímos que o meio DMEM/F12 é mais eficiente para a indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais caninas em promotores osteogênicos. Este efeito provavelmente ocorre em decorrência da maior quantidade de glicose neste meio, bem como da presença de diversos aminoácidos.

Resistência de células de carcinoma epidermóide bucal à terapia fotodinâmica mediada pelo ácido 5-aminolevulínico

O carcinoma epidermóide bucal (CEC) é uma neoplasia maligna com alta morbidade e mortalidade e de difícil tratamento. O tratamento convencional para o CEC inclui cirurgia e radioterapia, seguida ou não de quimioterapia. Apesar de serem amplamente difundidos, esses tratamentos podem ser ineficazes para alguns CECs resistentes. A terapia fotodinâmica (PDT) oncológica tem sido utilizada para o tratamento adjuvante do CEC bucal, principalmente nos casos menos invasivos e que necessitam de redução do tumor para a ressecção cirúrgica. Contudo, semelhantemente aos tratamentos convencionais, a PDT pode também induzir o aparecimento de populações celulares resistentes, fato já descrito para carcinoma cutâneo, adenocarcinoma de cólon e adenocarcinoma mamário. A hipótese de que células de CEC bucal possam desenvolver resistência à PDT ainda não foi testada. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar se células de CEC bucal (SCC9) desenvolvem resistência a ciclos repetidos de PDT mediada pelo ácido 5- aminolevulínico (5-ALA-PDT) e avaliar se nesse processo ocorre modificação da expressão de marcadores relacionados a sobrevivência celular (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR e Akt). Foi utilizada linhagem de células de CEC bucal (SCC9), submetida às seguintes condições: 1) Controle - células cultivadas sem nenhum tratamento; 2) ALA - células incubadas com 5-ALA (1mM durante 4 horas); 3) LED - tratadas com iluminação LED (630nm, 5,86J/cm2, 22,5J, 150mW, 150s); 4) PDT - tratadas com 5- ALA-PDT, com os protocolos do grupo ALA e LED combinados, gerando dose letal de 90%. Inicialmente foi realizado somente um ciclo de PDT, sendo avaliada a viabilidade celular em todos os grupos após 24, 48, 72 e 120h da irradiação. Também foi realizado ensaio de detecção da fragmentação de DNA (TUNEL) e análise por imunofluorescência da expressão das proteínas NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt nas células viáveis. Como resultado desse primeiro tratamento com 5-ALA-PDT, observou-se que as células sobreviventes ao tratamento apresentaram intensa marcação para pmTOR e exibiram potencial de crescimento durante o período analisado. Após esses ensaios, as células que sobreviveram a essa primeira sessão foram coletadas, replaqueadas e novamente cultivadas, sendo então submetidas a novo ciclo de 5-ALA-PDT. Esse processo foi realizado 5 vezes, variando-se a intensidade de irradiação à medida que se observava aumento na viabilidade celular. As populações celulares que exibiram viabilidade 1,5 vezes maior do que a detectada no primeiro ciclo PDT foram consideradas resistentes ao tratamento. Os mesmos marcadores analisados no primeiro ciclo de PDT foram novamente avaliados nas populações resistentes. Foram obtidas quatro populações celulares resistentes, com viabilidade de até 4,6 vezes maior do que a do primeiro ciclo de PDT e irradiação com LED que variou de 5,86 a 9,38J/cm2. A população mais resistente apresentou ainda menor intensidade de protoporfirina IX, maior capacidade de migração e modificação na morfologia nuclear. As populações resistentes testadas exibiram aumento na expressão de pNF?B, iNOS, pmTOR e pAkt, mas não da proteína anti-apoptótica Bcl- 2. Ensaio in vivo foi também conduzido em ratos, nos quais CEC bucal foi quimicamente induzido e tratado ou não com 5-ALA-PDT. Houve intensa expressão imuno-histoquímica das proteínas pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt em relação ao controle não tratado, nas células adjacentes à área de necrose provocada pela PDT. Concluiu-se que as células de CEC bucal tratadas com 5-ALA-PDT a uma dose de 90% de letalidade desenvolveram viabilidade crescente após ciclos repetidos do tratamento, bem como exibiram superexpressão de proteínas relacionadas à sobrevivência celular, tanto in vitro quanto in vivo. Esses fatos, aliados à maior capacidade de migração, sugerem a aquisição de fenótipo de resistência à 5-ALAPDT. Esse aspecto deve ser cuidadosamente considerado no momento da instituição dessa terapia para os CECs bucais.

Micoplasma como contaminante de culturas celulares mantidas em laboratórios de instituições particulares e oficiais

Foi realizado estudo sobre a incidência de contaminação por micoplasma em 29 tipos de linhagens celulares pertencentes a sete laboratórios de instituições particulares, oficiais e de ensino superior. Utilizando o método de cultivo direto e oito passagens seriadas em meios específicos, líquido e sólido, verificou-se que, do total de 106 amostras, 48 apresentaram-se contaminadas por micoplasma (45,28%), o que constitui elevado índice de contaminação. O fato indica que testes periódicos para a determinação da presença de micoplasma nas culturas em utilização é recomendável e que as culturas contaminadas devem ser eliminadas para evitar a disseminação do microrganismo. Outras medidas preventivas devem ser adotadas, como a eliminação da pipetagem bucal, execução de técnicas assépticas mais estritas no manuseio das células, controle dos soros de origem animal, da tripsina e de outros componentes dos meios de cultura utilizados em cultura celular. O estudo mostrou que, ao invés das oito passagens seriadas propostas inicialmente, cinco foram suficientes para a detecção dos micoplasmas, o que representa economia de tempo e de materiais de custo elevado, reduzindo de 848 para 530 o número de passagens e a duração do teste, de oito para cinco semanas.

Caracterização bioquímica de soros de bezerros utilizados na manutenção de culturas celulares usadas em virologia

Oito lotes de soros de bezerros com idade maior ou menor de seis meses, usados para suplementar meios de cultivo de linhagens de células de uso difundido em virologia, foram testados quanto à sua capacidade promotora de crescimento (CPC) e classificados como bons promotores ou promotores pobres. Foram pesquisados parâmetros relacionados com macronutrientes para estabelecer o perfil bioquímico daqueles lotes. Os resultados obtidos podem ser considerados valores normais para animais aparentemente sadios. As variações que ocorreram para um mesmo parâmetro bioquímico, entre os resultados da pesquisa e os de alguns estudos existentes na literatura, podem ser atribuídas à metodologia utilizada, à raça e idade dos animais, ou mesmo à própria dieta regional. A análise estatística, realizada pela aplicação do teste "t" de Student aos valores das médias e dos desvios padrão, demonstrou que, com relação às frações séricas, não ocorreram diferenças significantes entre soros de CPC celular boa ou pobre, considerando-se t c=2,45, enquanto que, para soros animais maiores ou menores de seis meses, apenas os resultados relativos às frações alfa e beta (t=2,68 e 2,61, respectivamente) apresentaram significância, sendo superiores ao t crítico. Ficou evidenciado que a avaliação do conjunto de parâmetros bioquímicos pesquisados não permite diferenciar soros pertencentes aos dois grupos de animais, isto é, identificar soros de boa ou de pobre CPC, ou soros de bezerros maiores ou menores de seis meses de idade