Étude de la fonction de la protéine RPAP4 et de son association avec l’ARN polymérase II

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription. Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules. La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante.

Étude de la biogenèse de l'autotransporteur AIDA-I d'Escherichia coli

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif.

Study of the SRR1-gene family in Arabidopsis, yeast and mouse cells

Abstract: Light is a very important environmental cue for plants. In addition to the energy for photosynthesis, it also provides information that is essential for many processes including seed germination, seedlings development, neighbours detection or transition from the vegetative to the reproductive state. Plants evolved different photoreceptors, among which the phytochromes (PHY), which are red/far-red photoreceptors. This family is composed of 5 members in Arabidopsis thaliana, among which phyB plays the major role for detection of red light. Phytochromes are also able to reset the phase of the circadian clock, which is composed of a complicated network of genes able to produce rhythms of about 24 hours, even in constant conditions. SRR1 (Sensitivity to Red light Reduced) is a gene that was shown to act in the phyB pathway as well as in the circadian clock. It was proposed to play a role in the maintenance of rhythms of the core oscillator because of the circadian phenotype of the srr1 mutant in constant light and in constant darkness. In the present study, we present data confirming the role of SRR1 in the core oscillator. Moreover, we show that SRR1 levels are not limiting for circadian rhythms nor for light perception. We show that the protein levels, the sub-cellular localisation or the complex in which SRR1 is found are not regulated in a circadian manner. Orthologues of SRR1 exist in numerous eukaryotes, forming a new gene family. None of the members of this family have been described. Here, we present data suggesting that the mouse orthologue of SRR1 may not be required for oscillation of the circadian clock of mouse cells in culture. The yeast gene (called BER1 for Benomyl REsistant) was studied to understand the biochemical function of this gene family. Based on synthetic genetic screens, a role of Ber1 was inferred in microtubules dynamics, N-terminal acetylation of protein and proteasome biogenesis. The effect of Ber1 on microtubules was confirmed by the observation that the ber1Δ mutant is more resistant to microtubule-depolymerising drugs and microscopic examination of microtubules in ber 1 Δ mutants. Complementation assays of ber1 Δ mutants and srrl mutants failed to reveal any obvious functional conservation of the mouse, yeast and Arabidopsis orthologues. In conclusion, the SRR1 family might encode genes that either plays different roles in different organisms, or have similar biochemical function but are involved in diverse pathway. Résumé: La lumière est un des facteurs abiotiques les plus important pour les plantes. En plus de l'énergie fournie pour la photosynthèse, elle fourni également de l'information nécessaire pour différents processus comme la germination, le développement des jeunes plantules, la détection de plantes avoisinantes ou encore la transition entre le développement végétatif et reproductif. Plusieurs types de photorécepteurs sont apparus chez les plantes au cours de l'évolution, notamment les phytochromes (PHI, qui perçoivent la lumière rouge et rouge lointaine. Cette famille est composé de 5 membres chez Arabidopsis thaliana, parmi lesquels phyB est le principal récepteur pour la lumière rouge. Les phytochromes sont aussi utiles pour la synchronisation entre les cycles jour-nuit dus à la rotation de la terre et l'horloge circadienne. Cette dernière est composée d'un réseau compliqué qui permet la production de rythmes capables de perdurer même en conditions constantes. SRRI (Sensitivity to Red light Reduced) est un gène qui agit dans la voie de signalisation de phyB ainsi que dans l'horloge circadienne. Il a été proposé que SRRI joue un rôle dans la maintenance des rythmes de l'oscillateur principal à cause des phénotypes circadiens du mutant srrl observés en lumière et en obscurité continue. Dans ce travail, nous présentons des données confirmant le rôle de SRR1 dans l'oscillateur principal. Nous montrons que les niveaux d'expression de SRRI ne sont pas limitants pour les rythmes circadiens ou la perception de la lumière. Enfin, nous montrons que le niveau d'accumulation de la protéine, sa localisation subcellulaire ou encore la taille du complexe dans lequel SRRl est trouvé ne sont pas régulés de façon circadiennes. Des orthologues de SRRI existent chez de nombreux eucaryotes, formant une nouvelle famille de gènes. Aucun des membres de cette famille n'a été étudié avant ce travail. Nous présentons des données suggérant que l'orthologue de la souris n'est peut-être pas requis pour les oscillations de l'horloge circadienne de cellules de souris en culture. Le gène de la levure (appelé SERI pour Benomyl REsistant) a été étudié afin de mieux comprendre la fonction biochimique de cette famille de gène. Une analyse par crible synthétique léthal a révélé un rôle de Ber1 dans la dynamique des microtubules, l'acétylation des protéines en N-terminal et la biogenèse du protéasome. L'effet de Ber1 sur les microtubules a été confirmé par l'observation du mutant ber1 en présence de drogue capable de dépolymériser les microtubules. Celui-ci est plus résistant à ces drogues que le type sauvage. Des expériences de complémentation n'ont pas montré de conservation de la fonction entre SRRI et ses homologues de souris ou de levure. En conclusion, la famille SRRI code pour des gènes qui pourraient avoir soit des rôles différents selon les organismes, soit la même fonction biochimique mais qui serait utile pour des voies de signalisation différentes.

Characterization of the expression, regulation and function of Sorting Nexin 9 and Sorting Nexin 18

Summary : Sorting nexin (SNX) family members play important roles in intracellular protein and membrane trafficking, The membrane-tubulating SNX9 protein has been shown to interact with multiple components of the endocytic machinery and to participate in clathrin-mediated endocytosis of cell surface receptors. It has not been investigated if SNX9 may also participate in other protein sorting pathways that involve vesicular transport, specifically the biogenesis of lysosome-related organelles (LROs). Closely related to SNX9 is SNXl8, whose function is largely unknown. In this work, we have characterized the expression of SNX9 and SNXl8 in LRO-containing cells and investigated their role in protein trafficking during the formation of LROs. Our results indicate that SNX9 and SNXl8 are not essential for the formation of LROs, nor for the sorting of melanosomal proteins. We investigated how the level of intracellular SNX9 protein is regulated and found that it is a substrate of the ubiquitin ligase Itch, a member of the NEDD4 family of E3 ubiquitin ligases. Itch ubiquitylates SNX9 and regulates SNX9 levels by enhancing its degradation. Using ? truncated proteins we found that the interaction with SNX9 is mediated by the proline-rich domain of Itch, a domain distinct from the conventional WW recognition domain, and the SH3 domain of SNX9. Interaction with the PRD of Itch is essential for SNX9 ubiquitylation and degradation. We further showed that Itch binding is not affected by tyrosine phosphorylation of SNX9. Using lentivector-mediated siRNA techniques, we found that Itch regulates the level of melanosomal proteins, while knock-down of SNX9 does not alter their level. Interestingly, we revealed that silencing of SNXIS affects the amount of the melanosomal protein Melan-A, but also of SNX9, and that SNXl8 can interact with SNX9. Taken together, our results highlight that the pool of substrates of NEDD4 family E3 ligases extends to proteins containing SH3 domains and provide insight into the potential functions of SNXI8. Résumé : Les membres de la famille des Sorting Nexins (SNX) jouent des rôles importants dans le trafic intracellulaire de protéines et membranes. Il a été démontré que la protéine SNX9, qui génère les tubules membranaires, interagit avec plusieurs composants de la machinerie d'endocytose et participe à l'endocytose des récepteurs de surface mediée par la clathrine. Aucune étude n'a investigué si SNX9 pourrait aussi participer à d'autres voies de trafic de protéines tel que le transport vésiculaire, et plus particulièrement la biogenèse des organites lysosomaux ("lysosome-related organelles", LR©s). SNXl8 est similaire à SNX9, mais sa fonction est largement inconnue. Dans ce travail, nous avons caractérisé l'expression de SNX9 et SNX18 dans des cellules contenants des LROs et investigué leur rôle dans le trafic de protéines pendant la formation des LROS. Nos résultats indiquent que SNX9 et SNXI8 ne sont essentiels ni pour la formation des LR©s, ni pour le trafic de protéines mélanosomales. Nous avons examiné la régulation du niveau intracellulaire de la protéine SNX9 et avons trouvé qu'elle est un substrat de l'ubiquitine ligase Itch, un membre de la famille NEDD4 des ubiquitine ligases E3. Itch ubiquitine SNX9 et régule les niveaux de SNX9 en augmentant sa dégradation. En utilisant des protéines mutées nous avons découvert que l'interaction avec SNX9 est médiée par le domaine riche en proline de Itch, qui est différent du domaine conventionnel de reconnaissance WW, et par le domaine SH3 de SNX9. L'interaction avec le domaine riche en proline de Itch est essentielle pour l'ubiquitination et la dégradation de SNX9. De plus, nous avons montré que cette liaison n'est pas affectée par la phosphorylation des résidus tyrosine de SNX9. En utilisant des vecteurs lentiviraux exprimant des siARN, nous avons trouvé que Itch régule les niveaux de protéines mélanosomales, alors que l'extinction de l'expression de SNX9 ne change pas leurs niveaux. En autre, nous avons révélé que la diminution de SNXl8 affecte le niveau de la protéine mélanosomale Melan-A et de SNX9, et aussi que SNXl8 peut interagir avec SNX9. En résumé, nos résultats démontrent que l'ensemble des substrats de la famille NEDD4 des ubiquitine ligases E3 s'élargit aux protéines contenant des domaines SH3 et ouvrent des perspectives sur les fonctions potentielles de SNXl8.

Perinuclear Mlp proteins down-regulate gene expression in response to a defect in mRNA export

Résumé Une caractéristique des cellules eucaryotes est le confinement du matériel génétique (ADN/DNA) dans le noyau. Pour décoder cette information, un ARN messager (mRNA) est d'abord transcrit sous forme d'un ARN prémessager (pré-mRNA). Ce-dernier doit subir plusieurs étapes de maturation pour aboutir à une particule ribonucléoprotéique (mRNP) qui sera exportée vers le cytoplasme et traduite en protéine. La protéine de levure Mex67p et son homologue humain TAP sont des récepteurs d'export médiant la translocation du mRNP au travers des complexes du pore nucléaire (NPC). Mex67p/TAP ne se lient pas directement au mRNA, mais nécessitent la présence de protéines adaptatrices, telles que Yra1p et son homologue humain REF1. Afin d'identifier de nouveaux facteurs impliqués dans l'export des mRNPs ou de nouvelles fonctions pour Yra1p, nous avons effectué un crible génétique avec un mutant thermosensible de Yra1p, GFP-yra 1 -8. Ce mutant présente un défaut d'export des mRNAs et une diminution des niveaux de transcrits du gène rapporteur LacZ ainsi que de certains transcrits endogènes. Nous avons trouvé que la perte de Mlp2p, ou d'une protéine hautement similaire, Mlp1p, restaure la croissance du mutant GFP-yra1-8 à température restrictive. Mlp1p et Mlp2p sont des protéines nucléaires, dont l'homologue humain est TPR. Les Mlp (myosin¬like proteins) ainsi que TPR forment des structures filamenteuses ancrées aux NPC. Bien que la fonction des Mlp ne soit pas clairement définie, un rôle dans la biogenèse et la surveillance des mRNPs a été récemment proposé. Notre étude montre que la perte des Mlp, non seulement restaure la croissance de GFP-yra1-8, mais augmente aussi les niveaux des transcrits LacZ et facilite leur apparition dans le cytoplasme. Des expériences d'immunoprécipitations de la chromatine révèlent que Mlp2p diminue le taux de synthèse du transcrit LacZ dans GFP-yra1-8. Des analyses du transcriptome montrent que Mlp2p réduit aussi les niveaux d'une population de transcrits endogènes dans le mutant. Finalement, des localisations in situ suggèrent que la transcription du rapporteur LacZ a lieu à la périphérie du noyau, à proximité des Mlp. Ainsi, les protéines Mlp pourraient préférentiellement diminuer la transcription de gènes exprimés à la périphérie nucléaire. Nous montrons aussi que Yra1p interagit génétiquement avec Nab2p une protéine liée au mRNA et impliquée dans son export, mais non avec d'autres protéines également impliquées dans l'export des mRNAs. Les résultats obtenus soutiennent un modèle où les protéines Yra1p et Nab2p sont nécessaires à l'arrimage des mRNPs sur la plate-forme des Mlp. Si ces signaux manquent ou sont défectueux, les mRNPs ne peuvent pas poursuivre leur trajet vers le canal central du NPC. Ce bloc induirait par la suite une diminution de la transcription d'une population de gènes potentiellement localisée à la périphérie nucléaire. Dans son ensemble, cette étude suggère que les protéines Mlp établissent un lien entre la transcription de certains mRNAs et leur export au travers du pore nucléaire. Summary A hallmark of the eukaryotic cell is the packaging of DNA in the nucleus. To decode the genetic information, a messenger RNA (mRNA) is first synthesized as a pre-mRNA molecule, which undergoes different maturation steps resulting in an mRNP (messenger RNA ribonucleoprotein), which can be actively transported to the cytoplasm and translated into a protein. Yeast Mex67p and its human homologue TAP are export receptors mediating mRNP translocation through the nuclear pore complex (NPC). The recruitment of Mex67p/TAP to mRNA is mediated by mRNA export adaptors of the evolutionarily conserved REF (RNA and Export Factor binding) family: yeast Yra1p and human REF1. To uncover new functions of Yra1p or new factors implicated in mRNA export, we performed a genetic screen with a themiosensitive (ts) yra1 mutant, GFP-yra1-8. This mutant exhibits mRNA export defects and a decrease in the levels of LacZ reporter and certain endogenous transcripts. We found that the loss of Mlp2p, or the related Mlp1p protein, substantially rescues the growth defect of the GFP-yra1 -8 mutant. Mlp1p and M1p2p are large non-essential proteins, homologous to human TPR, proposed to form intra-nuclear filamentous structures anchored at the NPC. Their role is not clearly defined, but they have been implicated in mRNP biogenesis and surveillance. Our study shows that loss of Mlp proteins not only restores growth of GFP-yra1-8, but also rescues LacZ mRNA levels and increases their appearance in the cytoplasm. Chromatin immunoprecipitation and pulse chase experiments indicate that Mlp2p down-regulates LacZ mRNA synthesis in GFP-yra1-8. DNA micro- array analyses reveal that Mlp2p also reduces the levels of a subset of cellular transcripts in the yra1 mutant strain. In situ localizations suggest that LacZ transcription occurs at the nuclear periphery, in close proximity to Mlp proteins. Thus, Mlp proteins may preferentially down-regulate genes expressed at the nuclear periphery. Finally, we show that Yra1p genetically interacts with the shuttling mRNA-binding protein Nab2p and that loss of Mlp proteins rescues the growth defect of yra1 and nab2, but not other mRNA export mutants. The data support a model in which Nab2p and Yra1p are required for rnRNP docking to the Mlp platform. Lack of these signals prevents mRNPs from crossing the Mlp gate. This block may then negatively feed-back on the transcription of a subset of genes, potentially located at the nuclear envelope. Overall, this study suggests that perinuclear Mlp proteins establish a link between mRNA transcription and export.

Analysis of SKI-1/S1P prodomain provides insight on maturation and activation of SKI-1/S1P zymogen

SKI-l/SlP protease is a member of the proprotein convertase family, with several functions in cellular metabolism and homeostasis. It is responsible for the processing of several cellular substrates, including ATF6, SREBPs, and GlcNAc-1- phosphotranspherase. Furthermore, SKI-1/SlP is also responsible for maturation of arenavirus surface glycoprotein into GP1 and GP2 subunits. This processing is a strict requirement in order to achieve fully mature and fusion-competent virions. Furthermore, SKI-1/SlP itself is synthesized as an inactive zymogen, requiring sequential autocatalytic processing at several sites (B'/B and C) in its prodomain in order to mature and become fully active. Our project focused on the analysis of SKI- 1/S1P prodomain in the biogenesis of the active enzyme. In this context we have additionally developed and characterized a novel cell-based sensor for assessment of cellular activity of the enzyme, with a potential application in screening for novel SKI- 1/S1P inhibitors. In a first aim we have analysed the relevance of cleavage motifs found in the enzyme prodomain. Using molecular and biochemistry tools we have identified and characterized a novel C' maturation site. Furthermore, we found that SKI-1/SlP autoprocessing results in intermediates whose catalytic domain remains associated with prodomain fragments of different lengths. Contrasting with other proprotein convertases, incompletely matured intermediates of SKI-1/SlP exhibit full catalytic activity toward selected substrates. In a second aim, we turned our attention to the structural basis of SKI-1/SlP N- terminus assisted folding. Studying the folding and activity of prodomain-truncated forms of the enzyme we found that a minimal folding unit is contained in the AB region. Deletion of the BC sequence affected auto-maturation but not folding, and partial activity was retained. However, the BC region seemed required for complete and full activity. Phylogenetic analyses showed that the AB sequence is highly conserved, while the BC fragment is variable in sequence and length. Specifically, replacement of the human prodomain with that of Drosophila, resulted in a fully mature and active chimeric enzyme, suggesting an evolution process of SKI-1/SlP prodomain towards a more complex arrangement and steps of activation. Overall, the additional data we have produced might provide fundamental knowledge crucial for the development of novel SKI-1/SlP inhibitors while also providing new SKI- 1/S1P variants with potential use in crystallization purpose. -- SKI-l/SlP est une protéase membre de la famille des proprotéines convertases (PCs), avec plusieurs fonctions dans le métabolisme cellulaire et de l'homéostasie. Il est responsable pour la maturation de plusieurs substrats cellulaires, y compris ATF6, SREBPs et GlcNAc-1-phosphotranspherase. SKI-l/SlP est également responsable pour la maturation de la glycoprotéine des arénavirus, une exigence stricte pour atteindre des virions infectieuse. Synthétisé comme un zymogène inactif, SKI-l/SlP nécessite d'un traitement autocatalytique séquentiel sur plusieurs sites (B'/B et C) de son prodomaine afin de devenir pleinement active. Notre projet était axé sur l'analyse de SKI-l/SlP prodomaine dans la biogenèse de l'enzyme. Dans ce contexte, nous avons développé un nouveau senseur-cellulaire pour l'évaluation de l'activité de l'enzyme. Ce dernier pourrait avoir une potentielle application dans l'identification de nouveaux inhibiteurs de SKI-l/SlP. Premièrement, nous avons analysé la pertinence des motifs de clivage trouvés dans le prodomaine de l'enzyme. En utilisant des outils moléculaires et biochimiques, nous avons identifié et caractérisé un nouveau site de maturation (C'). Aussi, nous avons constaté que la maturation de SKI-l/SlP a des intermédiaires dont le domaine catalytique reste associé à des fragments du prodomaine de différentes longueurs. Contrastant avec d'autres PCs, les intermédiaires partiellement matures de SKI-1 / SIP présentent une activité catalytique complète envers des substrats spécifiques. Dans un deuxième but nous avons tourné notre attention sur la base structurelle du pliage de SKI-l/SlP assisté par son N-terminus: En étudiant l'activité et pliage des formes tronquées dans le prodomaine de l'enzyme, nous avons constaté qu'une unité de pliage minimale est contenue dans la région de l'AB. La suppression de la séquence d'auto-BC affecte la maturation mais pas le pliage, et l'activité partielle est maintenue. Cependant, la région BC semble nécessaire pour une activité complète. Les analyses phylogénétiques ont montré que la séquence AB est fortement conservée, tandis que le fragment de BC est variable en longueur et en séquence. En particulier, le remplacement du prodomaine humain avec celui de la drosophile, a donné lieu à une enzyme chimérique complètement mature et active. Suggérant un processus d'évolution du prodomaine vers un arrangement et des mesures d'activation plus complexe. Globalement, ces donnees supplémentaires augment les connaissances fondamentales cruciales pour le développement de nouveaux inhibiteurs de SKI-1/ SIP, tout en offrant de nouvelles variantes SKI-1 / SIP dans le but d'obtenir la structure cristallographique de l'enzyme.

Post-transcriptional regulation of circadian gene expression by miRNAs

La grande majorité des organismes vivants ont développé un système d'horloges biologiques internes, appelées aussi horloges circadiennes, contrôlant l'expression de gênes impliqués dans de nombreux processus moléculaires et comportementaux. Au cours de la dernière décennie, des analyses « microarray » et séquençages à haut débit sur divers tissus de mammifères, indiquent que jusqu'à 20% du transcriptome serait sous contrôle circadien. Il était jusqu'à présent admis que la majorité des ARNm ayant une accumulation rythmique était générée par une transcription qui était elle-même rythmique. Toutefois, de récentes études ont suggéré qu'une proportion considérable des ARNm cycliques serait en fait générée par des mécanismes post-transcriptionnelles, incluant une régulation par micro-ARN (miARN). Lorsque j'ai débuté mon travail de thèse, l'influence des miARN sur l'expression des gènes circadiens, au niveau pangénomique, était encore méconnue. Par l'utilisation d'un modèle murin, dont la biogenèse des miARN a été spécifiquement désactivée au niveau des cellules hépatiques (knockout conditionnel pour Dicer), je me suis donc intéressée au rôle que jouaient ces molécules régulatrices sur la rythmicité de l'expression génique dans le foie. Des séquençages sur l'ensemble du transcriptome révèlent que l'horloge interne du foie est étonnement résistante à la perte totale des miARN. Nous avons cependant trouvé que les miARN agissent de façon importante sur la régulation de l'expression des gènes contrôlés par l'horloge moléculaire. La corégulation par les miARN, affectant jusqu'à 30% des gènes transcrits de façon rythmiques, conduit ainsi à une modulation de phase et d'amplitude du rythme de l'abondance des ARNm. En revanche, seuls peu de transcrits dépendent uniquement des miARN pour la rythmicité de leur accumulation. Enfin, mon travail met en évidence plusieurs miARN spécifiques, qui semblent préférentiellement moduler l'expression des gènes cycliques et permet l'identification de voies hépatiques particulièrement sujettes à une double régulation par les miARN et l'horloge biologique interne. La première masse d'analyses a essentiellement porté sur le rôle que jouent les miARN au niveau de l'expression des gènes contrôlés par l'horloge interne. Dans deux études de suivi, je me suis penchée sur deux aspects supplémentaires et complémentaires de la manière dont les miARN et l'oscillation de l'expression des gènes interagissent. Dans les hépatocytes murins, spécifiquement privés de Dicer, je me suis demandée si un phénotype horloge avait pu être masqué, dû à un entraînement stable de l'horloge du foie par l'horloge maîtresse du cerveau. J'ai donc commencé une série d'expériences ambitieuses (impliquant la mesure de la rythmicité du foie in vivo, chez l'animal vivant) afin de déséquilibrer l'entrainement de l'horloge hépatique via l'utilisation d'un protocole nutritionnel spécifique. Les premiers résultats suggèrent que dans des conditions où l'animal subit une restriction alimentaire pendant la journée, les miARN sont importants dans la cinétique d'adaptation des organes périphériques à un nouvel horaire de sustentation. Dans une deuxième ligne de recherche, j'ai plus profondément étudié quels seraient les miARN responsables des rythmes post-transcriptionnels des ARNm, en utilisant le séquençage de « small » ARN sur 24h. L'analyse est en cours et se poursuivra après l'obtention de mon diplôme. De façon générale, mon travail révèle d'importants et nouveaux rôles des miARN dans la modulation de l'expression circadienne des gènes hépatiques. De plus, le set de données générées dans l'étude déjà publiée, peut dorénavant servir de ressource valable pour de prochaines investigations sur le rôle physiologique que les miARN jouent au niveau du foie. -- Most living organisms have developed internal timing systems, called circadian clocks, to drive the rhythmic expression of genes involved in many molecular and behavioral processes. Over the last decade, microarray analyses and high- throughput sequencing from various mammalian tissues have indicated that up to 20% of the transcriptome are under circadian control. It was generally assumed that the majority of rhythmic mRNA accumulation is generated by rhythmic transcription. However, recent studies have suggested that a considerable proportion of mRNA cycling may actually be generated by post-transcriptional mechanisms, including by microRNAs. When I started my thesis work, it was still unknown how miRNAs influence circadian gene expression in a genome-wide fashion. Using a mouse model in which miRNA biogenesis can be inactivated in hepatocytes (conditional Dicer knockout mouse), I have thus addressed the role that these regulatory molecules play in rhythmic gene expression in the liver. Whole transcriptome sequencing revealed that the hepatic core clock was surprisingly resilient to total miRNA loss. However, we found that miRNAs acted as important regulators of clock-controlled gene expression. Co- regulation by miRNAs, which affected up to 30% of rhythmically transcribed genes, thus led to the modulation of phases and amplitudes of mRNA abundance rhythms. By contrast, only very few transcripts were strictly dependent on miRNAs for their rhythmic accumulation. Finally, my work highlights several specific miRNAs that appear to preferentially modulate cyclic gene expression, and identifies pathways in the liver that are particularly prone to dual regulation through miRNAs and the clock. The first bulk of analyses mainly dealt with the role that miRNAs play at the level of rhythmic clock output gene expression. In two follow-up studies I further delved into two additional, complementary aspects of how miRNAs and gene expression oscillations interact. First, I addressed whether a core clock phenotype in the hepatocyte-specific Dicer knockout could have been masked due to the stable entrainment of the liver clock by the animals' master clock in the brain. I thus started a series of ambitious experiments (involving the in vivo recording of liver rhythms in live animals) to bring the stable entrainment of the liver clock out of equilibrium using specific feeding protocols. My first results suggest that under conditions when animals are challenged by food restriction to daytime, miRNAs are important for the kinetics of adapting to unusual mealtime in peripheral tissue. In a second line of research, I have more carefully investigated which miRNAs are responsible for post- transcriptional mRNA rhythms using small RNA sequencing around-the-clock. The analyses are ongoing and will be continued after my graduation. Overall, my work uncovered important and novel roles of miRNA activity in shaping hepatic circadian gene expression; moreover, the datasets collect in the published studies can serve as a valuable resource for further investigations into the physiological roles that miRNAs play in liver. -- L'alternance du jour et de la nuit dirige depuis longtemps la vie quotidienne des êtres humains et de la plupart des organismes sur terre. Ce cycle de 24 heures façonne beaucoup de changements comportementaux et physiologiques tels que la vigilance, la température corporelle et le sommeil. Les rythmes journaliers, appelés rythmes circadiens, sont dirigés par des horloges biologiques tournant dans presque chaque cellule du corps. Une structure dans le cerveau agit en tant qu'horloge maitresse pour synchroniser les horloges internes entre elles et en fonction des signaux de jour/nuit extérieurs. Dans les cellules "les gènes de l'horloge" sont activés et désactivés une fois par jour ce qui déclenche des cycles dans lesquels des protéines sont produites de manière circadienne. Ces rythmes protéiques sont spécialisés pour chaque tissu ou organe et peuvent les aider à réaliser leurs tâches quotidiennes. Les rythmes circadiens peuvent être générés d'autres manières n'impliquant pas directement les composants des gènes de l'horloge. Les ARN messagers (ARNm) sont des molécules intermédiaires dans la production de protéines à partir d'ADN. Dans le foie des souris jusqu'à 20% des molécules d'ARNm sont produites suivant des rythmes circadiens. Le foie réalise des tâches essentielles dans le contrôle du métabolisme incluant celui des hydrates de carbone, des graisses et du cholestérol. Un timing précis est important afin de traiter les substances nutritives correctement lors des repas il en résulte une variation des quantités de certains ARNm et protéines coïncidant avec les repas. Les microARNs constituent une autre classe de molécules ARN de très petite taille qui régulent l'efficacité de traduction des ARNm en protéines et la stabilité des ARNm. Lors de mon travail de thèse, j'ai exploré de manière approfondie l'influence de ces petits régulateurs sur les rythmes circadiens du foie de souris. Ces expériences qui impliquaient le "Knock-out" d'un gène essentiel à la production de microARNs montrent qu'au lieu de générer les rythmes des ARNm, les microARNs les ajustent pour répondre aux besoins spécifiques du foie comme assurer leur pic au bon moment de la journée. Le ciblage de microARNs spécifiques peut révéler de nouvelles stratégies pour rectifier ces rythmes lorsque par exemple les fonctions métaboliques ne fonctionnent plus normalement. -- The rising and setting of the sun have long driven the daily schedules of humans and most organisms on the earth. This 24-hr cycle shapes many behavioural and physiological changes, such as alertness, body temperature, and sleep. These daily rhythms, which are called circadian rhythms, are dictated by biological clocks that are ticking in almost every single cell of the body. A region in the brain acts as a master clock to synchronize the internal clocks with each other and with the outside light/dark cycles. In cells, "core clock genes" are turned on and off once per day, which triggers cycles that cause some proteins to be produced in a circadian manner. The protein rhythms are specialized to a particular tissue or organ, and may help them to carry out their designated daily tasks. However, circadian rhythms might also be produced by other ways that do not involve these core clock components. Messenger RNAs (mRNAs) are intermediate molecules in the production of proteins from DNA. In the mouse liver, up to 20% of mRNA molecules are produced in circadian cycles. The liver performs essential tasks that control metabolism-including that of carbohydrates, fats, and cholesterol. Precisely timing when certain mRNAs and proteins reach peaks and troughs in their activities to coincide with mealtimes is important for nutrients to be properly processed. Other RNA molecules called microRNAs, i.e. RNAs of very small size, regulate at which rate mRNA molecules are translated into proteins. In my thesis work, I have explored at the influence of these small regulators on circadian rhythms in the mouse liver in greater detail. These experiments, which involved "knocking out" a gene that is essential for the production of microRNAs, show that rather than generating the mRNA rhythms, the microRNAs appear to adjust them to meet the specific needs of the liver, such as ensuring that they peak at the right time-of-day. Targeting specific microRNA molecules may reveal new strategies to tweak these rhythms, which could help to improve conditions when metabolic functions go wrong.

The role of raptor in cell death

Selon les statistiques, les maladies cancéreuses sont en augmentation dans les pays en développement ainsi que dans les pays industrialisés. Ceci peut s'expliquer largement par les habitudes alimentaires, le tabagisme, les infections, le manque d'activité physique, la pollution et le stress, entre autres. Ainsi, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) prévoit une augmentation de la fréquence des cancers avec 15 millions de nouveaux cas par an en 2020. La transformation d'une cellule normale en une cellule cancéreuse se déroule en plusieurs étapes avec, au niveau moléculaire, différentes mutations ciblant des protéines régulant la croissance cellulaire. Un des exemples de protéines qui participent au contrôle des voies cellulaires impliquées lors de la prolifération des cellules sont les complexes de protéines mTORCl et mTORC2 (« mammalian target of rapamycin complex 1 and 2 »). Ces complexes mTORCl et mTORC2 activent des processus anaboliques (la synthèse de protéines et de lipides, le métabolisme énergétique, entre autres) et inhibent en même temps des voies de catabolismes cellulaires (autophagie et synthèse de lysosomes). Ils sont souvent mutés dans de nombreux cas de cancers, c'est pourquoi ils sont la cible de nombreux traitements anti-cancéreux. Pour ces raisons, nous nous sommes intéressés aux mécanismes d'actions moléculaires des drogues qui ciblent les complexes mTORCl et mTORC2. Nous avons ainsi découvert qu'une molécule présente uniquement dans le complexe mTORCl, raptor, était clivée en un fragment plus petit lors du traitement de cellules cancéreuses avec des drogues. Des molécules activées durant la mort cellulaire programmée par apoptose, les caspases, se sont révélées responsables du clivage de raptor. Nous avons ensuite décrit de façon précise les sites de clivage de raptor par les caspases durant la mort cellulaire. Il s'est avéré que le clivage de raptor affaiblissait son interaction avec mTOR au sein du complexe mTORCl, ce qui participe à l'inactivation de mTORCl lors de traitements avec des molécules anti-cancéreuses. Ces résultats nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes d'actions de différentes drogues anti-cancéreuses au niveau du complexe mTORCl, ce qui peut être utile pour la synthèse de nouvelles molécules ciblant mTORCl ainsi que pour lutter contre les mécanismes de résistance chimiothérapeutiques. -- La protéine « mammalian target of rapamycin » (mTOR) est une sérine/thréonine kinase qui est hautement conservée des protistes à l'être humain. Deux complexes mTOR existent : le complexe 1 mTOR (mTORCl) et le complexe 2 mTOR (mTORC2). Ils régulent positivement des processus anaboliques (synthèse de protéines et de lipides, le métabolisme énergétique, l'organisation du cytosquelette, la survie cellulaire) et négativement des voies cataboliques (autophagic, biogenèse de lysosomes). Les complexes mTORCl et mTORC2 sont sensibles aux signaux mitogéniques tels que les acides aminés, le glucose, les facteurs de croissance, l'état énergétique (ATP) et les niveaux d'oxygène et induisent des voies de croissance cellulaire essentielles. La voie cellulaire regulée par mTORCl peut être hyperactivée dans de nombreux cancers humains. Puisque plusieurs voies cellulaires convergent et régulent les complexes mTORCl et mTORC2, des mutations dans les kinases en amont peuvent mener à une dérégulation de l'activation de mTOR. Des stratégies thérapeutiques ont été développées pour cibler les complexes mTORCl et mTORC2, ainsi que les kinases en amont qui régulent mTOR. Plusieurs drogues ciblant mTORCl, telles que la rapamycine et la curcumine, affectent l'interaction entre mTOR et un composant spécifique de mTORCl, raptor. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires des drogues qui ciblent mTORCl, ainsi que leur effet déstabilisant sur l'interaction entre mTOR et raptor dans des lignées cellulaires de lymphomes. Nous avons démontré que raptor était clivé en un fragment de lOOkDa après traitement avec la rapamycine, la curcumine, l'étoposide, la cisplatine, la staurosporine et le ligand Fas (FasL). Etant donné que ces drogues ont été décrites comme induisant I'apoptose, l'utilisation d'un inhibiteur de caspases (z- VAD-fmk) a révélé que le clivage de raptor, lors de la mort cellulaire, était dépendant des caspases. Des essais caspases in vitro ont permis d'identifier la caspase-6 (ainsi que probablement d'autres caspases) comme étant une protéase impliquée dans le clivage de raptor. La séquence protéique de raptor a montré potentiellement plusieurs sites de clivage de caspases aux extrémités amino-terminale et carboxy-terminale. La mutagénèse a permis d'identifier les sites de clivages de raptor par les caspases comme étant DEAD LTD (acides aminés 17-23) et DDADD (acides aminés 939¬943). De plus, le clivage de raptor corrèle avec l'inhibition de l'activité de mTORCl envers ces substrats (S6K et 4E-BP1). Nous avons aussi observé que le clivage de raptor affaiblissait l'interaction entre mTOR et raptor, ce qui indique que ce clivage est une étape critique dans l'inhibition de mTORCl durant I'apoptose. Pour terminer, la mutagénèse du site de clivage de raptor DDADD a montré une résistance à la mort cellulaire de cellules cancéreuses. Notre travail de recherche a révélé un nouveau mécanisme moléculaire qui module l'organisation et l'activité de mTORCl, ce qui peut être d'un grand intérêt pour les recherches dans le domaine de mTOR ainsi que pour la découverte de molécules ciblant mTORCl. -- The mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine/threonine protein kinase, which is highly conserved from yeast to humans. Two different mTOR complexes exist: the mTOR complex 1 (mTORCl) and the mTOR complex 2 (mTORC2). They positively regulate anabolic processes (protein and lipid synthesis, energy metabolism, cytoskeleton organization, cell survival) and negatively regulate catabolic pathways (autophagy, lysosome biogenesis). The mTORCl and mTORC2 respond to mitogenic stimuli such as amino acids, glucose, growth factors, energy levels (ATP) and oxygen levels and drive essential cellular growth pathways. The mTORCl pathway can be found hyperactivated in numerous human cancers. As various cellular pathways converge and regulate mTORCl and mTORC2, mutations in upstream protein kinases can lead to a deregulated mTOR activation. Different therapeutic strategies have been developped to target mTORCl, mTORC2, as well as upstream protein kinases regulating mTOR pathways. Various drugs targeting mTORCl, such as rapamycin and curcumin, affect the interaction between mTOR and a specific mTORCl component, raptor. In this study, we investigated the molecular mechanisms of drugs targeting mTORCl, as well as their destabilizing effect on the mTOR-raptor interaction in lymphoma cell lines. We demonstrated that raptor was processed into a lOOkDa fragment after treatment with rapamycin, curcumin, etoposide, cisplatin, staurosporine and FasL. As these drugs were reported to induce apoptosis, the use of a pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk) revealed that the cleavage of raptor under cell death was caspase-dependent. In vitro caspase assays were performed to identify caspases-6 (and probably other caspases) as an important cysteine protease implicated in the cleavage of raptor. Analysis of raptor protein sequence showed several putative caspase-specific cleavage sites at the N-terminal and the C-terminal ends. Mutagenesis studies allowed us to identify the DEADLTD (amino acids 17-23) and the DDADD (amino acids 939-943) as the caspase-dependent cleavage residues of raptor. Furthermore, the cleavage of raptor correlated with inhibition of mTORCl activity towards its specific targets (4E-BP1 and S6K). We also highlighted that raptor processing weakened the interaction between mTOR and raptor, indicating that raptor cleavage is a critical step in the mTORCl inhibition process during apoptosis. Finally, mutagenesis of raptor C-terminal cleavage site (DDADD) conferred resistance to the chemotherapeutic-mediated cell death cascade of cancer cell. Our research work highlighted a new molecular mechanism modulating mTORCl organization and activity, which can be of great interest in the mTOR field research and for designing drugs trageting mTORCl.

Systematic analysis of protein complexes involved in the human RNA polymerase II machinery

La transcription, la maturation d’ARN, et le remodelage de la chromatine sont tous des processus centraux dans l'interprétation de l'information contenue dans l’ADN. Bien que beaucoup de complexes de protéines formant la machinerie cellulaire de transcription aient été étudiés, plusieurs restent encore à identifier et caractériser. En utilisant une approche protéomique, notre laboratoire a purifié plusieurs composantes de la machinerie de transcription de l’ARNPII humaine par double chromatographie d’affinité "TAP". Cette procédure permet l'isolement de complexes protéiques comme ils existent vraisemblablement in vivo dans les cellules mammifères, et l'identification de partenaires d'interactions par spectrométrie de masse. Les interactions protéiques qui sont validées bioinformatiquement, sont choisies et utilisées pour cartographier un réseau connectant plusieurs composantes de la machinerie transcriptionnelle. En appliquant cette procédure, notre laboratoire a identifié, pour la première fois, un groupe de protéines, qui interagit physiquement et fonctionnellement avec l’ARNPII humaine. Les propriétés de ces protéines suggèrent un rôle dans l'assemblage de complexes à plusieurs sous-unités, comme les protéines d'échafaudage et chaperonnes. L'objectif de mon projet était de continuer la caractérisation du réseau de complexes protéiques impliquant les facteurs de transcription. Huit nouveaux partenaires de l’ARNPII (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 et CCT5) ont été purifiés par la méthode TAP, et la spectrométrie de masse a permis d’identifier de nouvelles interactions. Au cours des années, l’analyse par notre laboratoire des mécanismes de la transcription a contribué à apporter de nouvelles connaissances et à mieux comprendre son fonctionnement. Cette connaissance est essentielle au développement de médicaments qui cibleront les mécanismes de la transcription.

Caractérisation moléculaire de la modulation spatio-temporelle des fonctions du phagosome

La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome. D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose. Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus, en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées.

Analyse cinétique des rétinaldéhydes déshydrogénases recombinantes de type 3 et 4 de souris

Les Rétinal déshydrogénases (RALDHs) catalysent irréversiblement la déshydrogénation du Rétinal en Acide Rétinoïque (AR) qui est impliqué dans l’embryogenèse et la différenciation tissulaire. Pour comprendre le rôle dans la biosynthèse de l’AR des RALDHs type 3 et 4 de souris, nous avons déterminé leurs propriétés cinétiques ainsi que leur comportement en présence de différents inhibiteurs. Les tests enzymatiques sont effectués avec une préparation d’enzyme recombinante, tagguée avec 6 histidines, purifiée sur colonne Ni-NTA (Qiagen). L’activité enzymatique est évaluée en quantifiant la production d’AR par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inversée. Les constantes cinétiques ont été déterminées pour les isomères du rétinal tout-trans, 9-cis et 13-cis. La RALDH4 catalyse les isomères 9-cis et 13-cis de rétinal, elle présente un faible KM (3μM) pour les deux isomères et a une efficacité catalytique élevée pour le 9-cis rétinal 3.4 fois supérieure au 13-cis rétinal. La RALDH3 est spécifique au tout-trans rétinal avec un KM de 4 μM et une efficacité élevée. β-Ionone, inhibiteur possible pour la RALDH4, inhibe l’activité avec le rétinal 9-cis et 13-cis, mais n’influence pas l’activité de la RALDH3. Le para-hydroxymercuribenzoïque (p-HMB) inhibe l’activité de deux isoenzymes. Le cation MgCl2 augmente par 3 fois l’oxydation du rétinal 13-cis par la RALDH4, diminue l’oxydation du 9-cis rétinal et influence faiblement la RALDH3. Ces données enrichissent les connaissances sur les caractéristiques cinétiques des RALDHs recombinantes de souris de types 3 et 4 et fournissent des éclaircissements sur la biogenèse de l’acide rétinoïque in vivo.

The role of NHL-2 in regulating C.elegans P granule function

La divison cellulaire asymétrique est un processus essentiel qui permet aux cellules souches de s’auto-renouveller et de produire une cellule fille destinée à la différenciation. La lignée germinale de C. elegans, totipotente et immortelle, est une lignée de cellules souches qui contient des organites ribonucléoprotéiques appelés granules P. Au cours du développement ces derniers sont toujours localisés spécifiquement dans les cellules précurseurs de la lignée germinals, suggérant qu’ils sont des déterminants de la lignée germinale. De façon intéressante, des granules ribonucléoprotéiques, comme les P bodies impliqués dans le contrôle post-transcriptionnel, ont été observés chez tous les organismes. Néanmoins, la fonction précise des granules P de C. elegans est inconnue. Récemment, notre laboratoire a montré que NHL-2, un homologue de Mei-P26 de Drosophile, colocalise avec les granules P dans des embryons précoces et joue un rôle dans la division cellulaire asymétrique et dans la polarité cellulaire. Tous les granules P contiennent NHL- 2, ce qui nous a mené à poser l’hypothèse que NHL-2 régule la biogenèse et la fonction des granules P. Nous avons testé cette hypothèse par imagerie et quantification de l'intensité de PGL-1, un composant essentiel des granules P, dans des embryons fixés. Nos résultats montrent que dans des embryons mutants pour nhl-2 il y a une réduction du nombre de granules P, de l'intensité de fluorescence moyenne (IFM) et de l'intensité de fluorescence total (IFT) de PGL-1. Une analyse plus poussée a montré qu'il existe deux populations distinctes d’embryons mutants pour nhl-2 : l’une présente une intensité de PGL-1 comparable à celle d’une population sauvage alors que le second groupe présente une forte réduction des quantités de PGL-1 et est comparable à des mutants pour pgl-1. Cette variabilité est aussi observée dans le phénotype de stérilité de nhl-2 mutant à des températures élevées. Globalement, nos résultats suggèrent que la perte de fonction de NHL-2 perturbe la prolifération des cellules germinales ainsi que la formation et/ou la stabilité des granules P au cours des étapes précoces du développement des précurseurs de la lignée germinals. D’autre part, ils suggèrent que la fonction de NHL-2 pourrait être partiellement redondants avec les autres régulateurs de la stabilité des granules P. Mots-clés : Granules P, NHL-2, Cellules germinals.

Trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase chez Saccharomyces cerevisiæ : relation entre biogénèse de la télomérase et homéostasie des télomères

Le contrôle de la longueur des télomères est une étape critique régissant le potentiel réplicatif des cellules eucaryotes. A cause du problème de fin de réplication, les chromosomes raccourcissent à chaque cycle de division. Ce raccourcissement se produit dans des séquences particulières appelées télomères. La longueur des télomères est en relation directe avec les capacités prolifératives des cellules et est responsable de la limite de division de Hayflick. Cependant, dans certains types cellulaires et dans plus de 90% des cancers, la longueur des télomères va être maintenue par une enzyme spécialisée appelée télomérase. Encore aujourd’hui, comprendre la biogénèse de la télomérase et savoir comment elle est régulée reste un élément clé dans la lutte contre le cancer. Depuis la découverte de cette enzyme en 1985, de nombreux facteurs impliqués dans sa maturation ont été identifiés. Cependant, comment ces facteurs sont intégrés dans le temps et dans l’espace, afin de produire une forme active de la télomérase, est une question restée sans réponse. Dans ce projet, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiæ comme modèle d’étude des voies de biogénèse et de trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase, en condition endogène. La première étape de mon travail fut d’identifier les facteurs requis pour l’assemblage et la localisation de la télomérase aux télomères en utilisant des techniques d’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH). Nous avons pu montrer que la composante ARN de la télomérase fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, en condition endogène, dans les cellules sauvages. Nos travaux suggèrent que ce trafic sert de contrôle qualité puisqu’un défaut d’assemblage de la télomérase conduit à son accumulation cytoplasmique et prévient donc sa localisation aux télomères. De plus, nous avons identifié les voies d’import/export nucléaire de cet ARN. Dans une deuxième approche, nous avons réussi à développer une méthode de détection des particules télomérasiques in vivo en utilisant le système MS2-GFP. Notre iv étude montre que contrairement à ce qui a été précédemment décrit, la télomérase n’est pas associée de façon stable aux télomères au cours du cycle cellulaire. En fin de phase S, au moment de la réplication des télomères, la télomérase se regroupe en 1 à 3 foci dont certains colocalisent avec les foci télomériques, suggérant que nous visualisons la télomérase active aux télomères in vivo. La délétion des gènes impliqués dans l’activation et le recrutement de la télomérase aux télomères entraine une forte baisse dans l’accumulation des foci d’ARN au sein de la population cellulaire. Nos résultats montrent donc pour la première fois la localisation endogène de l’ARN TLC1 in situ et in vivo et propose une vue intégrée de la biogenèse et du recrutement de la télomérase aux télomères.

Regulation of lipid metabolism in adipocytes and hepatocytes by hexarelin through scavenger receptor CD36

Les sécrétines de l’hormone de croissance (GHRPs) sont de petits peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance à partir de l’hypophyse via leur liaison au récepteur de la ghréline GHS-R1a. Le GHRP hexaréline a été utilisé afin d’étudier la distribution tissulaire de GHS-R1a et son effet GH-indépendant. Ainsi, par cette approche, il a été déterminé que l’hexaréline était capable de se lier à un deuxième récepteur identifié comme étant le récepteur scavenger CD36. Ce récepteur possède une multitude de ligands dont les particules oxLDL et les acides gras à longue chaîne. CD36 est généralement reconnu pour son rôle dans l’athérogénèse et sa contribution à la formation de cellules spumeuses suite à l’internalisation des oxLDL dans les macrophages/monocytes. Auparavant, nous avions démontré que le traitement des macrophages avec l’hexaréline menait à l’activation de PPARƔ via sa liaison à GHS-R1a, mais aussi à CD36. De plus, une cascade d’activation impliquant LXRα et les transporteurs ABC provoquait également une augmentation de l’efflux du cholestérol. Une stimulation de la voie du transport inverse du cholestérol vers les particules HDL entraînait donc une diminution de l’engorgement des macrophages de lipides et la formation de cellules spumeuses. Puisque CD36 est exprimé dans de multiples tissus et qu’il est également responsable du captage des acides gras à longue chaîne, nous avons voulu étudier l’impact de l’hexaréline uniquement à travers sa liaison à CD36. Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation du métabolisme des lipides par CD36, nous avons choisi des types cellulaires jouant un rôle important dans l’homéostasie lipidique n’exprimant pas GHS-R1a, soient les adipocytes et les hépatocytes. L’ensemble de mes travaux démontre qu’en réponse à son interaction avec l’hexaréline, CD36 a le potentiel de réduire le contenu lipidique des adipocytes et des hépatocytes. Dans les cellules adipeuses, l'hexaréline augmente l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la mobilisation et l’oxydation des acides gras, et induit également l’expression des marqueurs thermogéniques PGC-1α et UCP-1. De même, hexaréline augmente l’expression des gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale, un effet accompagné de changements morphologiques des mitochondries; des caractéristiques observées dans les types cellulaires ayant une grande capacité oxydative. Ces résultats démontrent que les adipocytes blancs traités avec hexaréline ont la capacité de se transformer en un phénotype similaire aux adipocytes bruns ayant l’habileté de brûler les acides gras plutôt que de les emmagasiner. Cet effet est également observé dans les tissus adipeux de souris et est dépendant de la présence de CD36. Dans les hépatocytes, nous avons démontré le potentiel de CD36 à moduler le métabolisme du cholestérol. En réponse au traitement des cellules avec hexaréline, une phosphorylation rapide de LKB1 et de l’AMPK est suivie d’une phosphorylation inhibitrice de l’HMG-CoA réductase (HMGR), l’enzyme clé dans la synthèse du cholestérol. De plus, la liaison d'hexaréline à CD36 provoque le recrutement d’insig-2 à HMGR, l’étape d’engagement dans sa dégradation. La dégradation de HMGR par hexaréline semble être dépendante de l’activité de PPARƔ et de l’AMPK. Dans le but d’élucider le mécanisme d’activation par hexaréline, nous avons démontré d’une part que sa liaison à CD36 provoque une déphosphorylation de Erk soulevant ainsi l’inhibition que celui-ci exerce sur PPARƔ et d’autre part, un recrutement de l’AMPK à PGC-1α expliquant ainsi une partie du mécanisme d’activation de PPARƔ par hexaréline. Les résultats générés dans cette thèse ont permis d’élucider de nouveaux mécanismes d’action de CD36 et d'approfondir nos connaissances de son influence dans la régulation du métabolisme des lipides.

Supercomplexes multifonctionnels chez les mitochondries, et chez E. coli

Les processus mitochondriaux tels que la réplication et la traduction sont effectués par des complexes multiprotéiques. Par contre, le métabolisme et la voie de maturation des ARN mitochondriaux (p. ex précurseurs des ARNt et des ARNr) sont habituellement traités comme une suite de réactions catalysées par des protéines séparées. L’exécution fidèle et optimale de ces processus mitochondriaux, exige un couplage étroit nécessaire pour la canalisation des intermédiaires métaboliques. Or, les évidences en faveur de l'interconnexion postulée de ces processus cellulaires sont peu nombreuses et proviennent en grande partie des interactions protéine-protéine. Contrairement à la perception classique, nos résultats révèlent l’organisation des fonctions cellulaires telles que la transcription, la traduction, le métabolisme et la régulation en supercomplexes multifonctionnels stables, dans les mitochondries des champignons (ex Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans et Neurospora crassa), des animaux (ex Bos taurus), des plantes (B. oleracea et Arabidopsis thaliana) et chez les bactéries (ex E. coli) à partir desquelles les mitochondries descendent. La composition de ces supercomplexes chez les champignons et les animaux est comparable à celle de levure, toutefois, chez les plantes et E. coli ils comportent des différences notables (ex, présence des enzymes spécifiques à la voie de biosynthèse des sucres et les léctines chez B. oleracea). Chez la levure, en accord avec les changements dûs à la répression catabolique du glucose, nos résultats révèlent que les supercomplexes sont dynamiques et que leur composition en protéines dépend des stimulis et de la régulation cellulaire. De plus, nous montrons que l’inactivation de la voie de biosynthèse des lipides de type II (FASII) perturbe l’assemblage et/ou la biogenèse du supercomplexe de la RNase P (responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNt), ce qui suggère que de multiples effets pléiotropiques peuvent être de nature structurale entre les protéines. Chez la levure et chez E. coli, nos études de la maturation in vitro des précurseurs des ARNt et de la protéomique révèlent l’association de la RNase P avec les enzymes de la maturation d’ARNt en 3’. En effet, la voie de maturation des pré-ARNt et des ARNr, et la dégradation des ARN mitochondriaux semblent êtres associées avec la machinerie de la traduction au sein d’un même supercomplexe multifonctionnel dans la mitochondrie de la levure. Chez E. coli, nous avons caractérisé un supercomplexe similaire qui inclut en plus de la RNase P: la PNPase, le complexe du RNA degradosome, l’ARN polymérase, quatre facteurs de transcription, neuf aminoacyl-tRNA synthétases, onze protéines ribosomiques, des chaperons et certaines protéines métaboliques. Ces résultats supposent l’association physique de la transcription, la voie de maturation et d’aminoacylation des ARNt, la dégradation des ARN. Le nombre de cas où les activités cellulaires sont fonctionnellement et structurellement associées est certainement à la hausse (ex, l’éditosome et le complexe de la glycolyse). En effet, l’organisation en supercomplexe multifonctionnel représente probablement l’unité fonctionnelle dans les cellules et les analyses de ces super-structures peuvent devenir la prochaine cible de la biologie structurale.