Développement d’outils analytiques pour évaluer la biodisponibilité du Cd dans les eaux douces

Les phytochélatines (PC) sont des polypeptides ayant la structure générale, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, où n = 2 à 11. Leur synthèse est induite par un grand nombre de végétaux en réponse à une élévation de la concentration du milieu en métaux, en particulier le cadmium (ci-après, Cd). Le but de cette étude a été de développer un outil pour évaluer la biodisponibilité du Cd dans les eaux douces. Pour ce faire, une méthode analytique a été réalisée afin de déterminer les phytochélatines induites dans les algues C. reinhardtii. Celle-ci consiste à utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LCHP-SM/SM) "on-line". L’ionisation des molécules est celle faite par électronébulisation (IEN) (traduction de electrospray ionisation). L’objectif principal de ce mémoire est la validation de cette méthode : la détermination des courbes de calibration et des limites de détection et l'identification d'interférences potentielles. L’utilisation de dithiothreitol (DTT) à une concentration de 25 mM a été nécessaire à la conservation de la forme réduite des phytochélatines. En effet, suite à la validation de la méthode d’analyse des phytochélatines il a été démontré qu’elle représente un potentiel d’application. Ceci dans la mesure où l’induction des phytochélatines (PC2, PC3 et PC4) dans les algues C. reinhardtii a été possible à deux concentrations de Cd (1 x 10-7 M et 1 x 10 6 M) et ce, après plusieurs temps d'induction (1, 2, 4, et 6 h). Ainsi, l’étude de la stabilité des phytochélatines a été réalisée et toutes les températures examinées ont démontré une diminution des phytochélatines analysées par HPLC-ESI-MS/MS. Il se pourrait que la cause de la dégradation des phytochélatines soit physique ou chimique plutôt que bactérienne. Toutefois, un approfondissement au niveau de la purification de la solution d’extraction serait nécessaire à la mise au point de la dite méthode analytique afin de quantifier les phytochélatines dans l’algue C. reinhardtii.

Lier la spéciation chimique du cérium à sa biodisponibilité sous différentes conditions environnementales

L’étude qui suit porte sur l’évaluation du risque écotoxicologique du cérium, l’élément le plus exploité de la famille des lanthanides. La présence grandissante de ce métal dans notre quotidien rend possible son relargage dans l’environnement. Il est donc primordial de comprendre l’impact qu’il aura sur les organismes vivant dans un système aquatique. Une approche centrée sur le modèle du ligand biotique a été utilisée pour évaluer adéquatement l’interaction entre le cérium et un ligand biotique à la surface de l’algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. Pour mener une étude sur le risque écotoxicologique d’un élément métallique il faut, avant tout, comprendre la spéciation (répartition sous ses différentes formes chimiques) de l’élément en question. Les premières sections du mémoire vont donc traiter des expériences qui ont été menées pour évaluer la spéciation du cérium dans les conditions expérimentales d’exposition à C. reinhardtii. Il sera question de faire la distinction entre la forme particulaire du métal et sa forme dissoute, de caractériser ces changements par spectroscopie ainsi que d’évaluer le pouvoir complexant de la matière organique naturelle. Les résultats montrent une importante déplétion du métal dissout en solution à pH neutre et basique et une forte interaction avec la matière organique naturelle, peu importe le pH de la solution. Ensuite, les expériences de bioaccumulation seront expliquéesen comparant l’effet du pH, de la présence d’un ion compétiteur et de la présence de matière organique naturelle sur les paramètres d’internalisation du cérium. Les résultats indiquent qu’à pH acide, le comportement du cérium est plus prévisible qu’à pH neutre. Néanmoins, en tenant compte de la complexité des milieux naturels, l’interaction du métal avec les molécules complexantes va diminuer son risque d’interaction avec un organisme vivant.

Distribuzione e biodisponibilità dei metalli in traccia nei sedimenti della Pialassa Baiona

Il presente lavoro di tesi è stato realizzato al fine di valutare la distribuzione geografica ed i livelli ambientali di concentrazione per una serie di metalli (Cr, Cu, Ni, Zn, Mn, Co, V, Ba, Pb, Sr e Hg) presenti all’interno dei sedimenti della laguna costiera Pialassa Baiona, situata nei pressi del porto e dell’area industriale di Ravenna. L’area di studio considerata rappresenta un esempio di ambiente di transizione, dove i fattori fisici e chimici variano su scala spaziale e temporale e dove le attività antropiche, recenti e non, hanno provocato impatti significativi sullo stato di qualità dei sedimenti, delle acque e degli ecosistemi. Lo studio è stato progettato seguendo un disegno di campionamento ortogonale, che tiene conto del gradiente naturale terra-mare, tipico delle zone di transizione, e del gradiente antropico, legato alla vicinanza con l’area industriale. Sulla base di questo disegno sono state campionate 4 aree differenti e per ciascuna area sono stati scelti casualmente tre siti. La caratterizzazione dei sedimenti dal punto di vista chimico è stata effettuata determinando la frazione labile e quindi più biodisponibile dei metalli, oggetto del presente studio, per mezzo di una tecnica di estrazione parziale con HCl 1 M. Le concentrazioni biodisponibili ottenute sono state poi confrontate con il contenuto totale dei metalli, determinato mediante digestione totale al micronde. I sedimenti sono stati inoltre caratterizzati dal punto di vista granulometrico e del contenuto in sostanza organica (Loss on Ignition, LOI%). I risultati ottenuti dalle analisi chimiche sono stati confrontati con i valori tipi di fondo naturale del Mar Adriatico e con i valori guida di riferimento nazionale (SQA-MA) ed internazionale (ERL, ERM, TEL e PEL), al fine di valutare lo stato di qualità dei sedimenti della Baiona e di effettuare uno screening per individuare eventuali situazioni di rischio per gli organismi bentonici. I risultati ottenuti sono stati poi elaborati statisticamente con un analisi della varianza (ANOVA) con lo scopo di valutare la variabilità spaziale dei metalli nei campioni analizzati e la presenza di eventuali differenze significative.

Arricchimento e biodisponibilità di metalli in relazione all'uso del suolo: il caso del Comune di Ravenna

La contaminazione da fonti diffuse e locali può determinare perdite di funzionalità del suolo e ripercuotesi a cascata nelle catene alimentari, attraverso la contaminazione di falde e corpi d'acqua, l'assorbimento da parte dei vegetali e degli animali fino all'uomo. Industrializzazione, urbanizzazione e pratiche agricole sono le tre principali sorgenti di metalli nei suoli. In questo lavoro di tesi, che ha avuto come area oggetto di studio parte del territorio del Comune di Ravenna, sono stati analizzati gli arricchimenti di Cr, Ni, Cu, Zn e Pb applicando una metodica impostata sul confronto tra le concentrazioni totali rinvenute in superficie e in profondità mediante il calcolo dell'Indice di Geoaccumulo. La sola determinazione delle aliquote dei metalli negli orizzonti superficiali del suolo, non è, di per sé, in grado di fornire indicazioni esaustive circa lo stato di contaminazione dei suoli. Infatti, tale informazione, non permette la distinzione tra origine naturale o arricchimento determinato da attività antropica. In più lo studio ha valutato la possibile relazione con le caratteristiche del substrato (origine del sedimento) e l'uso del suolo. Alte concentrazioni di Cr e Ni, in corrispondenza della Pineta San Vitale (area naturale) non sono attribuibili a contaminazioni di natura antropica, bensì dipendono dal parent material. La distribuzione delle anomalie per Cu, Zn e Pb, invece, sembra dipendere invece dall'uso dei suoli presenti nell'area oggetto di studio. Il contenuto naturale di questi metalli può variare notevolmente a seconda del materiale su cui si è sviluppato il suolo e questo riflette i tenori di fondo per le diverse unità. I tenori di fondo del Cr calcolati per il deposito di cordone litorale (DCL), dove oggi è impostata la Pineta San Vitale (area naturale), sono maggiori rispetto ai limiti di concentrazione previsti dal Decreto Legislativo n°152 del 2006 per questa tipologia di aree. Cu, Zn e Pb, invece, presentano tenori di fondo bassi in corrispondenza del deposito del cordone litorale (DCL), costituito da materiale a granulometria grossolana. Per questi metalli è il fattore granulometria ad avere un ruolo fondamentale nello stabilire i valori di background negli altri depositi. In ultima analisi, per valutare gli effetti e i rischi associati in presenza di alte concentrazioni di Cr, Ni, Cu, Zn e Pb, è stata quantificata la frazione che può essere resa biodisponibile con DTPA. Le anomalie riscontrate sono state confrontate in primo luogo con alcuni campioni di controllo, coerenti con i valori di background per i cinque metalli. La bassa biodisponibilità osservata per Cr e Ni riflette il forte legame di questi metalli con la fase mineralogica, non rappresentando un pericolo per le piante e di conseguenza per gli animali superiori. Cu, Zn e Pb presentano, in alcuni casi, concentrazioni biodisponibili sia proporzionali all'entità dell'anomalia evidenziata con il calcolo dell'Indice di Geoaccumulo, sia maggiori rispetto a quelle dei campioni selezionati come controlli.

Spéciation et biodisponibilité de métaux traces (Cd, Cu, Ni, Pb, Zn) dans la rhizosphère de sols contaminés

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Spéciation et biodisponibilité de métaux traces (Cd, Cu, Ni, Pb, Zn) dans la rhizosphère de sols contaminés

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Exercice physique et athérosclérose : quels sont les mécanismes physiologiques et moléculaires de l'exercice qui préviennent et protègent de l'athérosclérose? : approche chez un modèle expérimental d'athérosclérose : la souris génétiquement dépourvue en apolipoprotéine E (apoE-/-)

RESUME : L'athérosclérose, pathologie inflammatoire artérielle chronique, est à l'origine de la plupart des maladies cardiovasculaires qui constituent l'une des premières causes de morbidité et mortalité en France. Les études observationnelles et expérimentales montrent que l'exercice physique prévient la mortalité cardiovasculaire. Cependant, les mécanismes précisant les bénéfices cliniques de l'exercice sur l'athérosclérose sont encore largement inconnus. Le but général de ce travail a donc été d'explorer, en utilisant un modèle expérimental d'athérosclérose, la souris hypercholestérolémique génétiquement dépourvue en apolipoprotéine E (apoE-/-), les mécanismes athéroprotecteurs de l'exercice. La dysfonction endothéliale, généralement associée aux facteurs de risque cardiovasculaire, serait l'une des étapes précoces majeures de l'athérogenèse. Elle est caractérisée par une diminution de la biodisponibilité en monoxyde d'azote (NO) avec la perte de ses propriétés vasculo-protectrices, ce qui favorise un climat pro-athérogène (stress oxydatif, adhésion et infiltration des cellules inflammatoires dans la paroi artérielle...) conduisant à la formation de la plaque athéromateuse. L'objectif de notre premier travail a donc été d'explorer les effets de l'exercice d'une part, sur le développement des plaques athéromateuses et d'autre part, sur la fonction endothéliale de la souris apoE-/-. Nos résultats montrent que l'exercice réduit significativement l'extension de l'athérosclérose et prévient la dysfonction endothéliale. L'explication pharmacologique montre que l'exercice stimule la fonction endothéliale via, notamment, une plus grande sensibilité des récepteurs endothéliaux muscariniques, ce qui active les événements signalétiques cellulaires récepteurs-dépendants à l'origine d'une bioactivité accrue de NO. Les complications cliniques graves de l'athérosclérose sont induites par la rupture de la plaque instable provoquant la formation d'un thrombus occlusif et l'ischémie du territoire tissulaire en aval. L'objectif de notre deuxième travail a été d'examiner l'effet de l'exercice sur la qualité/stabilité de la plaque. Nos résultats indiquent que l'exercice de longue durée stabilise la plaque en augmentant le nombre de cellules musculaires lisses et en diminuant le nombre de macrophages intra-plaques. Nos résultats montrent aussi que la phosphorylation de la eNOS (NO Synthase endothéliale) Akt-dépendante n'est pas le mécanisme moléculaire majeur à l'origine de ce bénéfice. Enfin, dans notre troisième travail, nous avons investigué l'effet de l'exercice sur le développement de la plaque vulnérable. Nos résultats montrent, chez un modèle murin de plaque instable (modèle d'hypertension rénovasculaire à rénine et angiotensine II élevés) que l'exercice prévient l'apparition de la plaque vulnérable indépendamment d'un effet hémodynamique. Ce bénéfice serait associé à une diminution de l'expression vasculaire des récepteurs AT1 de l'Angiotensine II. Nos résultats justifient l'importance de l'exercice comme outil préventif des maladies cardiovasculaires. ABSTRACT : Atherosclerosis, a chronic inflammatory disease, is one of the main causes of morbidity and mortality in France. Observational and experimental data indicate that regular physical exercise has a positive impact on cardiovascular mortality. However, the mechanisms by which exercise exerts clinical benefits on atherosclerosis are still unknown. The general aim of this work was to elucidate the anti-atherosclerotic effects of exercise, using a mouse model of atherosclerosis: the apolipoprotein E-deficient mice (apoE-/- mice). Endothelial dysfunction, generally associated with cardiovascular risk factors, has been recognized to be a major and early step in atherogenesis. Endothelial dysfunction is characterized by Nitric Oxide (NO) biodisponibility reduction with loss of NO-mediated vasculoprotective actions. This leads to vascular effects such as increased oxidative stress and increased adhesion of inflammatory cells into arterial wall thus playing a role in atherosclerotic plaque development. Therefore, one of the objective of our study was to explore the effects of exercise on atherosclerotic plaque extension and on endothelial function in apoE-/- mice. Results show that exercise significantly reduces plaque progression and prevents endothelial dysfunction. Pharmacological explanation indicates that exercise stimulates endothelial function by increasing muscarinic receptors sensitivity which in turn activates intracellular signalling receptor-dependent events leading to increased NO bioactivity. The clinical manifestations of atherosclerosis are the consequences of unstable plaque rupture with thrombus formation leading to tissue ischemia. The second aim of our work was to determine the effect of exercise on plaque stability. We demonstrate that long-term exercise stabilizes atherosclerotic plaques as shown by decreased macrophage and increased Smooth Muscle Cells plaque content. Our results also suggest that the Akt-dependent eNOS phosphorylation pathway is not the primary molecular mechanism mediating these beneficial effects. Finally, we assessed a putative beneficial effect of exercise on vulnerable plaque development. In a mouse model of Angiotensine II (Ang II)-mediated vulnerable atherosclerotic plaques, we provide fist evidence that exercise prevents atherosclerosis progression and plaque vulnerability. The beneficial effect of swimming was associated with decreased aortic Ang II AT1 receptor expression independently from any hemodynamic change. These findings suggest clinical benefit of exercise in terms of cardiovascular event protection.

On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

Dibenzofuran degradation by Sphingomonas wittichii RW1 under environmental stresses

Sphingomonas wittichii is a gram-negative Alpha-proteobacterium, capable of degrading xenobiotic compounds such as dibenzofuran (DBF), dibenzo-p-dioxin, carbazole, 2-hydroxybiphenyl or nitro diphenyl ether herbicides. The metabolism of strain RW1 has been the subject of previous studies and a number of genes involved in DBF degradation have been characterized. It is known that RW1 posseses a unique initial DBF dioxygenase (encoded by the dxnAl gene) that catalyzes the first step in the degradation pathway. None of the organisms known to be able to degrade DBF have a similar dioxygenase, the closest match being the DBF dioxygenase from Rhodococcus sp. with an overall amino acid similarity of 45%. Genes participating in the conversion of the metabolite salicylate via the ortho-cleavage pathway to TCA cycle intermediates were identified as well. Apart from this scarce information, however, there is a lack of global knowledge on the genes that are involved in DBF degradation by strain RW1 and the influence of environmental stresses on DBF-dependent global gene expression. A global analysis is necessary, because it may help to better understand the behaviour of the strain under field conditions and suggest improvements for the current bioaugmentation practice. Chapter 2 describes the results of whole-genome analysis to characterize the genes involved in DBF degradation by RW1. Micro-array analysis allowed us to detect differences in gene transcription when strain RW1 was exposed to DBF. This was complemented by ultra-high throughput sequencing of mutants no longer capable of growing on salicylate and DBF. Some of the genes of the ortho-cleavage pathway were induced 2 to 4 times in the presence of DBF, as well as the initial DBF dioxygenase. However two gene clusters, named 4925 and 5102 were induced up to 19 times in response to DBF induction. The cluster 4925 is putatively participating in a meta-cleavage pathway while the cluster 5102 might be part of a gentisate pathway. The three pathways, ortho-cleavage, meta-cleavage and gentisate pathway seem to be active in parallel when strain RW1 is exposed to DBF, presenting evidence for a redundancy of genes for DBF degradation in the genome of RW1. Chapter 3 focuses on exploiting genetic tools to construct bioreporters representative for DBF degradation in RW1. A set of basic tools for genetic manipulation in Sphingomonas wittichii RW1 was tested and optimized. Both plasmids and mini-transposons were evaluated for their ability to be maintained in RW1 with or without antibiotic selection pressure, and for their ability to lead to fluorescent protein expression in strain RW1 from a constitutive promoter. Putative promoter regions of three of the previously found DBF-induced genes (Swit_4925, Swit_5102 and Swit_4897-dxnAl) were then used to construct eg/^-bioreporters in RW1. Chapter 4 describes the use of the constructed RW1-based bioreporter strains for examining the expression of the DBF degradation pathway genes under microcosm conditions. The bioreporter strains were first exposed to different carbon sources in liquid culture to calibrate the egfp induction. Contrary to our expectations from micro-array analysis only the construct with the promoter from gene cluster 4925 responded to DBF, whereas the other two constructs did not show specific induction with DBF. The response from the bioreporters was subsequently tested for sensitivity to water stress, given that this could have an important impact in soils. Exposure to liquid cultures with decreasing water potential, achieved by NaCl or PEG addition to the growth media, showed that eGFP expression in RW1 from the promoter regions 4925 and 5102 was not directly influenced by water stress, but only through an overall reduction in growth rate. In contrast, expression of eGFP from the dxnAl or an uspA promoter was also directly dependent on the extent of water stress. The RW1 with the 4925 construct was subsequently used in soil microcosms to evaluate DBF bioavailability to the cells in presence or absence of native microbiota or other contaminated material. We found that RW1 could grow on DBF added to soil, but bioreporter expression suggested that competition with native microbiota for DBF intermediates may limit its ability to proliferate to a maximum. Chapter 5 describes the results from the experiments carried out to more specifically detect genes of RW1 that might be implicated in water stress resistance. Hereto we created transposon mutagenesis libraries in RW1, either with a classical mini-Tn5 or with a variant that would express egfp when the transposon would insert in a gene induced under water stress. Classical mutant libraries were screened by replica plating under high and low water stress conditions (achieved by adding NaCl to the agar medium). In addition, we screened for smaller microcolonies formed by mutants in agarose beads that could be analized with flow cytometry. A number of mutants impaired to grow on NaCl-supplemented media were recovered and the transposon insertion sites sequenced. In a second procedure we screened by flow cytometry for mutants with a higher eGFP production after exposure to growth medium with higher NaCl concentrations. Mutants from both libraries rarely overlapped. Discovered gene functions of the transposon insertions pointed to compatible solute synthesis (glutamate and proline), cell membrane synthesis and modification of cell membrane composition. The results obtained in the present study give us a more complete picture of the mechanisms of DBF degradation by S. wittichii RW1, how it reacts to different DBF availability and how the DBF catabolic activity may be affected by the conditions found in contaminated environments. - Sphingomonas wittichii est une alpha-protéobactérie gram-négative, capable de dégrader des composés xénobiotiques tels que le dibenzofurane (DBF), la dibenzo-p-dioxine, le carbazole, le 2-hydroxybiphényle ou les herbicides dérivés du nitro-diphényléther. Le métabolisme de la souche RW1 a fait l'objet d'études antérieures et un certain nombre de gènes impliqués dans la dégradation du DBF ont été caractérisés. Il est connu que RW1 possède une unique dioxygénase DBF initiale (codée par le gène dxnAl) qui catalyse la première étape de la voie de dégradation. Aucun des organismes connus pour être capables de dégrader le DBF n'a de dioxygénase similaire. L'enzyme la plus proche étant la DBF dioxygénase de Rhodococcus sp. avec 45% d'acides aminés conservés. Les gènes qui participent à la transformation du salicylate en métabolites intermédiaires du cycle de Krebs par la voie ort/io-cleavage ont aussi été identifiés. Outre ces informations lacunaires, il y a un manque de connaissances sur l'ensemble des gènes impliqués dans la dégradation du DBF par la souche RW1 ainsi que l'effet des stress environnementaux sur l'expression génétique globale, en présence du DBF. Une analyse globale est nécessaire, car elle peut aider à mieux comprendre le comportement de la souche dans les conditions de terrain et de proposer des améliorations pour l'utilisation de la bio-augmentation comme technique de bio-remédiation. Le chapitre 2 décrit les résultats de l'analyse du génome pour caractériser les gènes impliqués dans la dégradation du DBF par RW1. Une analyse de micro-arrays nous a permis de détecter des différences dans la transcription des gènes lorsque la souche RW1 a été exposée au DBF. L'analyse a été complétée par le criblage à ultra-haut débit de mutants qui n'étaient plus capables de croître avec le salicylate ou le DBF comme seule source de carbone. Certains des gènes de la voie ortho-cleavage, dont la DBF dioxygénase initiale, ont xî été induits 2 à 4 fois, en présence du DBF. Cependant, deux groupes de gènes, nommés 4925 et 5102 ont été induits jusqu'à 19 fois en réponse au DBF. Le cluster 4925 participe probablement dans une voie de meta-cleavage tandis que le cluster 5102 pourrait faire partie d'une voie du gentisate. Les trois voies, ortho-cleavage, meta-cleavage et la voie du gentisate semblent être activées en parallèle lorsque la souche RW1 est exposée au DBF, ce qui représente une redondance de voies pour la dégradation du DBF dans le génome de RW1. Le chapitre 3 se concentre sur l'exploitation des outils génétiques pour la construction de biorapporteurs de la dégradation du DBF par RW1. Un ensemble d'outils de base pour la manipulation génétique dans Sphingomonas wittichii RW1 a été testé et optimisé. Deux plasmides et mini-transposons ont été évalués pour leur capacité à être maintenu dans RW1 avec ou sans pression de sélection par des antibiotiques, et pour leur capacité à exprimer la protéine fluorescente verte (eGFP) dans la souche RW1. Les trois promoteurs des gènes Swit_4925, Swit_5102 et Swit_4897 (dxnAl), induits en réponse au DBF, ont ensuite été utilisés pour construire des biorapporteurs dans RW1. Le chapitre 4 décrit l'utilisation des souches biorapportrices construites pour l'analyse de l'expression des gènes de la voie de dégradation du DBF dans des microcosmes avec différents types de sols. Les souches biorapportrices ont d'abord été exposées à différentes sources de carbone en cultures liquides afin de calibrer l'induction de la eGFP. La construction avec le promoteur du gène 4925 a permis une réponse au DBF. Mais contrairement à nos attentes, basées sur les résultats de l'analyse des micro-arrays, les deux autres constructions n'ont pas montré d'induction spécifique au DBF. La réponse des biorapporteurs a ensuite été testée pour la sensibilité au stress hydrique, étant donné que cela pourrait avoir un impact important dans les microcosmes. La diminution du potentiel hydrique en culture liquide est obtenue par addition de NaCl ou de PEG au milieu de croissance. Nous avons montré que l'expression de la eGFP contrôlée par les promoteurs 4925 et 5102 n'était pas directement influencée par le stress hydrique, mais seulement par une réduction globale des taux de croissance. En revanche, l'expression de la eGFP dépendante des promoteurs dxnAl et uspA était aussi directement dépendante de l'ampleur du stress hydrique. La souche avec la construction 4925 a été utilisée par la suite dans des microcosmes avec différents types de sols pour évaluer la biodisponibilité du DBF en présence ou absence des microbes indigènes et d'autres composés contaminants. Nous avons constaté que RW1 pouvait se développer si le DBF a été ajouté au sol, mais l'expression de la eGFP par le biorapporteur suggère que la compétition avec la microbiota indigène pour les métabolites intermédiaires du DBF peut limiter sa capacité à proliférer de manière optimale. Le chapitre 5 décrit les résultats des expériences réalisées afin de détecter spécifiquement les gènes de RW1 qui pourraient être impliquées dans la résistance au stress hydrique. Ici on a crée des bibliothèques de mutants de RW1 par transposon, soit avec un mini-Tn5 classique ou avec une variante qui exprime la eGFP lorsque le transposon s'insère dans un gène induit par le stress hydrique. Les bibliothèques de mutants ont été criblées par la méthode classique de repiquage sur boîtes, dans des conditions de stress hydrique élevé (obtenu par l'addition de NaCl dans les boîtes). En outre, nous avons criblé des micro¬colonies dans des billes d'agarose qui ont pu être analysées par cytométrie de flux. Un certain nombre de mutants déficients à croître sur des milieux supplémentés avec du NaCl ont été isolés et les sites d'insertion du transposon séquencés. Dans une deuxième procédure nous avons criblé par cytométrie de flux des mutants avec une production de eGFP supérieure, après exposition à un milieu de croissance avec une concentration élevée de NaCl. Les mutants obtenus dans les deux bibliothèques n'étaient pas similaires. Les fonctions des gènes où se trouvent les insertions de transposons sont impliqués dans la synthèse de solutés compatibles (glutamate et de la proline), dans la synthèse de la membrane cellulaire et dans la modification de la composition de la membrane cellulaire. Les résultats obtenus dans la présente étude nous donnent une image plus complète des mécanismes de dégradation du DBF par S. wittichii RW1, comment cette souche réagit à la disponibilité du DBF et comment l'activité catabolique peut être affectée par les conditions rencontrées dans des environnements contaminés.

Dysfonction endothéliale et risque cardiovasculaire : l'exercice protège la fonction endothéliale et prévient la maladie cardiovasculaire [Endothelial dysfunction and cardiovascular risk : xercise protects endothelial function and prevents cardiovascular disease]

Objectifs : Décrire les caractéristiques de la dysfonction endothéliale associée au risque cardiovasculaire et expliciter les mécanismes biologiques par lesquels l'exercice stimule et/ou restaure la fonction endothéliale. Actualités : La fonction endothéliale, via les effets vasculoprotecteurs du monoxyde d'azote (NO), préserve la santé cardiovasculaire. Le dysfonctionnement endothélial est un facteur prédictif de la survenue des événements cardiovasculaires. L'endothélium est donc un organe cible préventif et thérapeutique prioritaire pour diminuer le risque cardiovasculaire. Perspectives : Les études épidémiologiques mettent en évidence les bienfaits de l'exercice régulier sur la fonction endothéliale, via une action endothéliale directe. L'approche expérimentale permet aujourd'hui de mieux cerner les mécanismes biologiques protecteurs de l'exercice. L'exercice, via l'élévation des forces de cisaillement, protège et/ou normalise la fonction endothéliale en augmentant la biodisponibilité en NO soit par une stimulation de la production de NO et/ou, soit par une augmentation des défenses antioxydantes et/ou une atténuation des enzymes prooxydantes. Conclusion : La connaissance des mécanismes biologiques protecteurs de l'exercice doit permettre d'encourager la pratique d'un exercice régulier par tous pour prévenir et réduire la mortalité cardiovasculaire.

Amniotic fluid insulin-like growth factor binding-protein 3 concentration as early indicator of fetal growth restriction

Rapport de synthèse : Introduction : La croissance foetale infra-utérine dépend d'un grand nombre de facteurs maternels, placentaires et foetaux. Une inadéquation d'un ou plusieurs de ces facteurs peut induire un retard de croissance infra-utérin (RCIU) ou au contraire une macrosomie. Les principales causes de RCIU comprennent les infections maternelles, l'éclampsie, les cardiovasculopathies maternelles, la toxicomanie, les malformations foetales et les insuffisances placentaires. Les facteurs endocriniens constituent un petit pourcentage des causes de RCIU, mais méritent que l'on s'y intéresse de plus près. Les facteurs hormonaux les plus importants pour la croissance fatale sont l'insuline et les insuline-like growth factors (IGFs) et non l'hormone de croissance (GH) qui joue un rôle majeur dans la croissance postnatale. Notre attention s'est portée sur IGF-1 qui joue un rôle important dans la croissance intrautérine. Sa biodisponibilité dépend de plusieurs protéines plasmatiques, les IGF-binding proteins (IGFBP 1 à 9). IGFBP-3 est la principale de ces IGFBPs, autant d'un point de vue quantitatif que fonctionnel. Nous avons cherché à déterminer si les concentrations d'IGF-1 et d'IGFBP-3 dans le liquide amniotique au début du deuxième trimestre étaient prédictives de la croissance infra-utérine. Les gènes codant pour IGF-1 et IGFBP-3 contenant certaines séquences polymorphiques, nous avons également étudié leur influence sur la croissance foetale. L'analyse du liquide amniotique présente l'avantage de pouvoir être effectuée dès la 14ème semaine d'aménorrhée alors que la biométrie foetale échographique ne permet pas à ce stade de déceler des anomalies de la croissance infra-utérine. Méthode : Nous avons analysé des échantillons de liquide amniotique prélevés entre la 14ème et la 18ème semaine de grossesse chez 196 patientes. Les concentrations d'IGF-1 et d'IGFBP-3 ont été dosées par ELISA, les polymorphismes analysés par PCR. Ces résultats ont été ensuite analysés en fonction du poids de naissance des nouveaux-nés, répartis en trois groupes normal pour l'âge gestationnel (AGA), petit pour l'âge gestationnel (SGA) et grand pour l'âge gestationnel (LGA). Résultats : Les concentrations d'IGFBP3 dans le liquide amniotique sont significativement plus élevées (p = 0.030) dans le groupe SGA par rapport au groupe AGA, d'autant plus quand les taux sont ajustés en fonction de paramètres tels que l'âge gestationnel lors de l'amniocentèse (ANCOVA analysis : p = 0.009). La distribution du polymorphisme VNTR (variable number of tandem repeat) dans la région promotrice d'IGF-1 au sein du groupe SGA est significativement différente de celle du groupe AGA (p = 0.029). En effet, la fréquence de l'association allélique 19CA/20CA est diminuée dans le groupe SGA. Nous n'avons pas identifié de différence de distribution des séquences polymorphiques d'IGFBP-3 entre les différents groupes. Conclusion : Une concentration élevée d'IGFBP-3 dans le liquide amniotique au début du deuxième trimestre est associée à un risque plus élevé de retard de croissance alors que l'association allélique 19CA/20CA dans la région polymorphique IGF-1 VNTR est un facteur protecteur.

Distribution profile of zwitterions and hydrolysis of esters derived from N-benzylpiperazine

Résumé Les esters sont des agents thérapeutiques largement utilisés comme médicaments et prodrogues. Leurs dégradation est chimique et enzymatique. Le Chapitre IV de cette thèse a comme objet l'hydrolyse chimique de plusieurs dérivés esters du 2,3-dimethoxyphenol. Des composés modèles ont été synthétisés dans le but de déterminer leur mécanismes de dégradation. Les profils d'ionisation et d'hydrolyse de ces composés ont permis d'identifier la présence d'une catalyse intramoléculaire basique par un atome d'azote non-protoné. Les effets électroniques exercés par les groupes phenylethenyle et phenylcyclopropyle influencent également la vitesse d'hydrolyse des esters. La résolution des problèmes liés à l'adsorption et la perméation est devenue à nos jours l'étape limitante dans la conception de nouveaux médicaments car de trop nombreux candidats prometteurs ont échoué à cause d'une mauvaise biodisponibilité. La lipophilie décrit le partage d'un médicament entre une membrane lipidique et son environnement physiologique aqueux, et de ce fait elle influence sa pharmacocinétique. Des études récents ont mis en évidence l'importance de la détermination de la lipophilie des espèces ionisées vu leur considérable impact biologique. Le Chapitre V de cette thèse est centré sur une classe particulière de composés ionisables, les zwitterions. Plusieurs methoxybenzylpiperazines de nature zwitterionique ont été étudiées. Leurs profils d'ionisation ont montré que dans un large intervalle de pH, l'espèce prédominante est le zwitterion. Les profils de lipophilie ont montré que leur lipophilie est plus élevée que celles des zwitterions courants. Une interaction électrostatique entre l'oxygène du carboxylate et l'azote protoné est responsable de ce profil et rend la plupart des zwitterions non-donneurs de liaison hydrogène. Ces deux aspects peuvent favoriser le passage de la barrière hémato-éncephalique. Les données biologiques ont par la suite confirmé cette hypothèse pour un certain nombre de composés. Résumé large public Les esters sont des composés souvent rencontrés en chimie thérapeutique. Ils sont dégradés en milieu aqueux par une réaction d'hydrolyse, avec ou sans la participation d'enzymes. Dans ce travail de thèse, une série d'esters ont été étudiés dans le but d'établir une relation entre leur structure et les mécanismes responsables de leur dégradation chimique. Il a été prouvé que la dégradation est accélérée par un atome d'azote non-protoné. D'autres mécanismes peuvent intervenir en fonction du pH du milieu. La présence d'une liaison simple ou double ou d'un groupe phenylcyclopropyle peut également influencer la vitesse de dégradation. Il est essentiel, dans la conception de nouveaux médicaments, d'optimiser les étapes qui influencent leur distribution dans le corps. Ce dernier peut être visualisé comme une série infinie de compartiments aqueux séparés par des membranes lipidiques. La lipophilie est une propriété moléculaire importante qui décrit le passage des barrières rencontrées par les médicaments. Des études récentes ont mis en évidence l'importance de déterminer la lipophilie des espèces ionisées vu leur considérable impact biologique. Dans ce travail de thèse a été étudiée une série particulière de composés ionisables , les zwitterions. Une relation a été établie entre leur structure et leur proprietés physico-chimiques. Une lipophilie plus élevée par rapport à celle des zwitterions courants a été trouvée. Une interaction entre les groupes chargés des zwitterions étudiés est responsable de ce comportement inattendu et rend la plupart d'entre eux non-donneurs de liaison hydrogène. Ces deux facteurs peuvent favoriser la pénétration cérébrale. Les données biologiques ont confirmé cette hypothèse pour un certain nombre de composés. Summary Esters are often encountered in medicinal chemistry. Their hydrolysis may be chemical as well as enzymatic. Chapter IV of this manuscript provides a mechanistic insight into the chemical hydrolysis of a particular series of basic esters derived from 2,3-dimethoxyphenol. Their ionization and pH-rate profiles allowed to identify the presence of an intramolecular base catalysis by a non-protonated nitrogen atom. Electronic effects exerted by the phenylethenyl and phenylcyclopropyl groups that are present in the structure of the esters also influenced their rate of hydrolysis. Numerous works in the literature witness of the importance of lipophilicity in determining the fate of a drug. Most published partition coefficients are those of neutral species. In contrast, no exhaustive treatment of the lipophilicity of charged molecules is available at present, and a lack of information characterizes in particular zwitterions. Chapter V of this manuscript provides an insight into the physicochemical parameters of a series of zwitterionic methoxybenzylpiperazines. Their ionization profiles showed that they exist predominantly in the zwitterionic form in a broad pH-range. An electrostatic interaction between the oxygen of the carboxylate and the protonated nitrogen atom is increases the lipophilicity of the investigated zwitterions, and prevents the majority of them to express their hydrogen-bonding capacity. These two aspects may favor the crossing of the blood-brain barrier. The available ratios PSt/PSf measured in vitro have confirmed this point for a number of compounds.

Traitments antibiotiques simplifies : l'exemple des infections des voies respiratoires supérieures

Les bénéfices d'une antibiothérapie simplifiée sont une meilleure compilance, une diminution des coûts et une diminution de la résistance. Plusieurs molécules récentes sont efficaces pour le traitement court (5 jours) de l'angine streptococcique, de l'otite et de la sinusite. Leur avantage est leur biodisponibilité ; leur inconvénient un spectre élargi. Le spectre élargi bénéficie au thérapeute et la santé publique ; il limite les procédures diagnostiques et les échecs thérapeutiques. Les victimes en sont les patients et aussi la santé publique, par l'augmentation des effets secondaires et de la résistance aux antibiotiques. Le diagnostic bactérien permet de cibler l'antibiotique et de raccourcir le traitement. Les outils de diagnostic rapide sont essentiels à cette stratégie.