Design e sintesi di nuove sonde luminescenti per il "targeting" dell'avidina

Recent studies on the use of bio-conjugating organometallic probes report on the possibility to use biotinylated-derivatives to selectively coordinate to a specific protein, avidin. In the present thesis, the synthesis of four new bifunctional ligands is described. The ligands contain both a pyridine triazolic unit able to coordinate a transition metal, and a biotin fragment able to bond avidin: the two functionalities are linked together by an appropriate aromatic linker (amide or ester). The obtained ligands were then employed to form luminescent Ir(III) complexes, that have been fully characterized also by a photophysical point of view both in organic and in aqueous solvent. Therefore, titrations of solutions of avidin with aqueous solutions of Ir(III)-complexes have been performed in order to estimate the luminescence variations of the complexes in the presence or in the absence of bio-conjugation.

Nuovi complessi alchinil tetrazolici di iridio(III) e renio(I): Sintesi, reattivit�� e propriet�� fotofisiche.

In this experimental thesis, two luminescent Ir(III) and Re(I) complexes which have a terminal alkynyl group on the tetrazole ligand were prepared. The aim was to use them as building blocks, in order to synthesize more complex structures. We explored two simple reactions: the first one was a coupling, for the formation of Ir(III)/Au(III) and Re(I)/Au(III) hetero binuclear complexes, and the second was a 1,3-dipolar Cu(I)-catalyzed ���Click��� cycloaddition, between the terminal alkyne and azide. The synthesized products were characterized through photophysical analysis, evaluating how the photoemissive properties of these substrates were affected by the formation of more complex structures. In questo lavoro di tesi sperimentale sono stati preparati due complessi luminescenti di Ir(III) e Re(I) che presentano un alchino terminale sul legante tetrazolico. Lo scopo �� stato quello di utilizzarli come building blocks per la sintesi di strutture pi�� complesse. Sono state esplorate due semplici reazioni: la prima di coupling, per la formazione di complessi etero binucleari Ir(III)/Au(III) e Re(I)/Au(III), e la seconda di ���click���, ossia una cicloaddizione 1,3-dipolare Cu(I) catalizzata tra l���alchino terminale e un���azide. I prodotti sintetizzati sono stati caratterizzati attraverso analisi fotofisiche, valutando come le propriet�� fotoemissive di questi substrati siano influenzate in seguito alla formazione di strutture pi�� complesse.

Studio della funzionalizzazione di materiali polimerici con complessi di iridio luminescenti

Sono stati sintetizzati materiali polimerici contenenti complessi di iridio luminescenti. In particolare �� stato messa a punto una via sintetica per la funzionalizzazione del gruppo terminale di catene metacriliche ottenute mediante ATRP.

Sintesi di complessi luminescenti anionici di Ir(III)

Negli ultimi anni si �� osservato un crescente sviluppo della ricerca nel campo dei materiali luminescenti per le loro diverse applicazioni reali e potenziali, fra cui l���impiego in dispositivi elettroluminescenti, quali OLEDs (Organic Light-Emitting Diodes) e LECs (Light-Emitting Electrochemical Cells). In modo particolare, si rivolge grande attenzione ai complessi ciclometallati di Ir(III) grazie alle peculiari caratteristiche che li contraddistinguono fra i materiali luminescenti, come l'emissione fosforescente, alte rese quantiche di emissione, lunghi tempi di vita e buona stabilit�� nei dispositivi. Oltre a tali caratteristiche uno dei principali vantaggi presentati dai complessi di Ir(III) �� la possibilit�� di modulare la lunghezza d'onda di emissione modificando la struttura dei leganti ciclometallanti e ancillari. Considerata la versatilit�� di questi sistemi e la loro conseguente rilevanza, diverse sono state le strategie applicate per l'ottenimento di complessi di Ir(III) generalmente neutri e cationici; al contrario pochi esempi di complessi di Ir(III) anionici sono attualmente riportati in letteratura. Lo scopo del mio lavoro di tesi �� stato quindi quello di sintetizzare tre nuovi complessi anionici luminescenti di Ir(III) con tre diversi leganti ciclometallanti. Il piano di lavoro �� stato suddiviso in stadi successivi, partendo dalla sintesi dei tre leganti ciclometallanti, impiegati poi nella preparazione dei dimeri di Ir(III) precursori dei miei complessi; infine facendo reagire questi ultimi con un legante ancillare bisanionico, derivato dal di(1H-tetrazol-5-il)metano, si �� giunti all'ottenimento di tre complessi anionici luminescenti di Ir(III). Dopo questa prima parte, il lavoro di tesi �� proseguito con la caratterizzazione spettroscopica dei tre complessi anionici e la determinazione delle loro propriet�� fotofisiche tramite la registrazione di spettri di assorbimento, di emissione e la determinazione delle rese quantiche di emissione e dei tempi di vita. Infine si �� preparato un ���soft salt��� costituito da un complesso anionico e uno cationico di Ir(III) le cui caratteristiche sono tutt'ora oggetto di studio del gruppo di ricerca presso il quale ho svolto il mio lavoro di tesi.

Sintesi e caratterizzazione di complessi misti Ir(iii)-Eu(iii) per l'emissione di luce bianca

Diodi organici emettitori di luce bianca (WOLEDs) sono dei dispositivi promettenti per la realizzazione di sorgenti luminose a basso consumo di energia, in quanto essi combinano un���alta efficienza e bassi costi di produzione con l���interessante caratteristica di poter produrre grandi superfici che emettono luce bianca di buona qualit��. Tuttavia, la durata, le prestazioni e i costi devono ancora essere ottimizzati affinch�� i WOLEDs possano diventare commercialmente competitivi con le altre pi�� comuni fonti di illuminazione; in particolare �� necessario migliorare la stabilit�� e l���efficienza degli emettitori. Nella presente tesi viene trattata la sintesi di molecole organometalliche a singolo componente per ottenere un���elettroluminescenza di un bianco pi�� puro possibile. In particolare l���attenzione �� stata rivolta all���ottenimento di complessi eterometallici Ir-Eu. Sono stati sintetizzati tre diversi dimeri di Ir (III), con sistemi fenilpiridinici variamente fluorurati come leganti; a secondo del tipo di legante si hanno delle variazioni delle propriet�� fotofisiche del complesso di Ir (III) successivamente prodotto. In seguito sono stati sintetizzati leganti bifunzionali contenenti un���unit�� isocianuro (in grado di coordinare selettivamente l���Iridio) e un gruppo acetilacetonato (in grado di coordinare selettivamente l���Europio). Tali leganti sono stati poi impiegati per formare il complesso di Eu (III). Infine, la reazione tra i dimeri di Ir (III) e il complesso di Eu (III) ha portato alla formazione dei complessi eterometallici Ir-Eu, che sono stati poi caratterizzati sia strutturalmente che fotofisicamente. Grazie ai due diversi centri emissivi presenti nella stessa molecola si �� ottenuta una complessiva luce bianca.

Complessi metallici come ���probes��� luminescenti per avidina: design e sintesi di leganti bifunzionali piridintriazolo-biotina

Studi recenti sull���utilizzo di sonde organometalliche per bioconiugazione sfruttano la possibilit�� di interazione di queste con una proteina, l���avidina, per la sua capacit�� di coordinarsi selettivamente ad una particolare molecola organica, la biotina. In questa tesi viene descritta la sintesi di due leganti bi-funzionali contenenti sia un���unit�� capace di fungere da legante per un opportuno metallo, che un���unit�� di biotina in grado di legarsi all���avidina. La differenza fra i due leganti risiede nello spaziatore che collega le due unit�� funzionali della molecola. Una volta ottenuti i leganti progettati, sono stati sintetizzati i corrispondenti complessi di Ir (III) e Re (I). Le propriet�� fotofisiche sono state misurate sia in solvente organico che in soluzione acquosa e quindi sono state effettuate titolazioni dell���avidina con soluzioni acquose a titolo noto dei complessi sintetizzati, con il fine di comprendere come le propriet�� luminescenti dei complessi vengano influenzate dalla bio-coniugazione tra biotina ed avidina.

Progettazione e sintesi di coppie ioniche ("soft salts") basate su complessi Ir(III) tetrazolici.

In questo lavoro di tesi sperimentale si �� sintetizzata e caratterizzata la prima classe di complessi tetrazolici di Ir(III) anionici con formula generale [Ir(C^N)2(L)2]-, in cui oltre ai leganti ciclometallanti ���C^N��� quali 2-fenilpiridinato (ppy) o 2-(2,4-difluorofenil)piridinato (F2ppy), sono stati introdotti due anioni tetrazolato (L) come il 5-fenil tetrazolato (Tph) oppure 5-(4-cianofenil) tetrazolato (TphCN). I complessi di Ir(III) anionici ottenuti si sono mostrati intensamente fosforescenti, con emissioni centrate nella regione del blu o del verde (460 < ��max<520 nm). I derivati anionici sono stati poi combinati con complessi Ir(III) tetrazolici cationici in grado di fornire emissione nella regione del rosso (��max > 650 nm), formando cos�� i primi esempi di coppie ioniche (���soft salts���) a matrice puramente tetrazolica. In tutti i casi si �� osservato come il colore emesso da parte dei soft salts sia il risultato di una vera propria sintesi additiva delle emissioni derivanti da componenti ioniche con propriet�� fotoemittive differenti. La sostanziale assenza di fenomeni di energy o electron transfer tra la componente anionica e cationica e il giusto bilancio tra le emissioni blu o verdi e rosse si sono tradotte, in taluni casi, nell���ottenimento di luce bianca, con la possibilit�� di variare ulteriormente i colori emessi in seguito all���allontanamento dell���ossigeno molecolare disciolto nelle soluzioni dei soft salts stessi.

Tipagem das c��lulas do infiltrado inflamat��rio peritumoral em carcinoma de c��lulas escamosas da mucosa bucal: correla����o com express��o de Ki67

O emprego de t��cnicas imunoistoqu��micas, utilizando marcadores biol��gicos como o Ki67, que permite a avalia����o do ��ndice de prolifera����o celular em neoplasias malignas, vem sendo preconizado como um importante caminho de investiga����o do comportamento biol��gico das neoplasias malignas, tendo como consequ��ncias contribui����es para o estabelecimento do progn��stico e desenvolvimento de novos protocolos terap��uticos. Neste trabalho, utiliza-se o m��todo imunoistoqu��mico da avidina-biotina-peroxidase avaliada a express��o de Ki67 no par��nquima de amostras de carcinomas de c��lulas escamosas da mucosa bucal com diferentes graus de diferencia����o histol��gica. Al��m disso, a quantifica����o da ��rea de infiltrado inflamat��rio foi avaliada. Os resultados demonstraram que a resposta imunol��gica celular �� o principal mecanismo de defesa no carcinoma de c��lulas escamosas da mucosa bucal, expressada pelo grande n��mero de linf��citos T e macr��fagos e a express��o de Ki67 est�� relacionado ao ��ndice mit��tico e, consequentemente, �� prolifera����o celular e, tamb��m, �� diferencia����o da neoplasia.

Express��o da imunorreatividade �� tirosina hidroxilase no hipot��lamo de ratos machos adultos submetidos �� manipula����o neonatal

A estimula����o neonatal tem sido utilizada como modelo experimental para examinar os mecanismos pelos quais varia����es precoces do ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a altera����es comportamentais e end��crinas est��veis. A estimula����o neonatal consiste na manipula����o dos animais por alguns minutos diariamente durante os primeiros dias de vida. Esse procedimento provoca, na vida adulta, uma s��rie de altera����es comportamentais e end��crinas que se caracterizam pela diminui����o do medo a ambientes novos e uma resposta menos acentuada da secre����o de glicocortic��ides pela supra-renal quando os animais s��o expostos a est��mulos estressantes. A dopamina �� um neurotransmissor que atua no sistema nervoso central, onde est�� envolvida na integra����o de v��rios aspectos da fun����o neuroend��crina, como, por exemplo, um regulador na secre����o de prolactina e do horm��nio liberador de corticotrofina. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da manipula����o neonatal sobre o sistema dopamin��rgico atrav��s da quantifica����o de neur��nios contendo tirosina hidroxilase, a enzima inicial e limitante da s��ntese de catacolaminas, em n��cleos hipotal��micos. Ratos machos Wistar foram divididos em dois grupos. Um grupo foi submetido �� manipula����o por um minuto, uma vez por dia, durante os dez primeiros dias de vida (grupo manipulado) e outro grupo n��o sofreu manipula����o (grupo n��o-manipulado, controle). Aos 75-80 dias, os animais foram anestesiados, perfundidos e os c��rebros processados para a detec����o imunohistoqu��mica da tirosina hidroxilase. Foi utilizado um anticorpo monoclonal contra tirosina hidroxilase e o m��todo indireto avidina-biotina-peroxidase. A quantifica����o da express��o da tirosina hidroxilase consistiu na contagem dos neur��nios imunorreativos �� tirosina hidroxilase nos n��cleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipot��lamo em cada indiv��duo. A m��dia �� EPM do n��mero de neur��nios positivos para tirosina hidroxilase de todos os indiv��duos foi comparada entre os grupos manipulado e n��o-manipulado atrav��s do teste t de Student. N��o houve diferen��a significativa no n��mero de neur��nios imunorreativos �� tirosina hidroxilase nos n��cleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipot��lamo de ratos machos adultos entre os animais do grupo manipulado e controle n��o-manipulado. O estudo mostrou que a manipula����o neonatal n��o se constituiu num est��mulo suficiente para promover altera����es no n��mero de neur��nios imunorreativos �� tirosina hidroxilase nos n��cleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipot��lamo de ratos machos adultos.

Astrocytic and microglial response and histopathological changes in the brain of horses with experimental chronic Trypanosoma evansi infection

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Immunohistochemical characterization of mononuclear cells and MHC II expression in the brain of horses with experimental chronic Trypanosoma evansi infection

Este estudo objetivou caracterizar a resposta imune celular no sistema nervoso central (SNC) de eq��inos com infec����o cr��nica experimental por Trypanosoma evansi. Para este prop��sito, foram utilizados os m��todos histoqu��micos (HE) e imunoistoqu��micos do complexo avidina-biotina peroxidase (ABC). O fen��tipo do infiltrado celular foi caracterizado com o aux��lio de anticorpos anti - CD3, para linf��citos T e antiBLA36 para linf��citos B. Os macr��fagos foram marcados com anticorpo antiant��genos da linhagem miel��ide/histi��citos (Clone Mac387). A les��o no sistema nervoso central (SNC) dos eq��inos infectados com T. evansi foi caracterizada como meningoencefalite e meningomielite n��o supurativa. A gravidade das les��es variou em diferentes segmentos do SNC, refletindo distribui����o irregular das altera����es vasculares. A distribui����o de c��lulas T e B e ant��genos do complexo maior de histocompatibilidade classe II foram avaliados dentro do SNC de eq��inos cronicamente infectados com T. evansi. O infiltrado perivascular e men��ngeo eram constitu��dos predominantemente por c��lulas T e B. Macr��fagos foram raramente visualizados. T.evansi n��o foi identificado no par��nquima do SNC dos eq��inos.

Edema de Reinke: estudo da imunoexpress��o da fibronectina, da laminina e do col��geno IV em 60 casos por meio de t��cnicas imunoistoqu��micas

Edema de Reinke �� doen��a cr��nica da laringe na qual a camada superficial da l��mina pr��pria �� expandida por muco espesso conferindo-lhe aspecto gelatinoso. Relaciona-se ao tabagismo e acomete, preferencialmente mulheres, as quais apresentam a voz mais grave. Suas caracter��sticas histol��gicas nem sempre conseguem diferenci��-lo das demais les��es benignas da laringe, havendo necessidade de t��cnicas histol��gicas adicionais. OBJETIVOS: Estudar a imunoexpress��o da fibronectina, do col��geno IV e da laminina no edema de Reinke por meio de t��cnicas imunoistoqu��micas. Estudo prospectivo. MATERIAL E M��TODOS: Blocos histol��gicos de 60 casos cir��rgicos de edema de Reinke foram resgatados, submetidos a novos cortes e ��s rea����es imunoistoqu��micas para fibronectina, laminina e col��geno IV pelo m��todo da Avidina Biotina Peroxidase. Todos os pacientes eram fumantes e adultos, sendo 50 mulheres e 10 homens. RESULTADOS: As an��lises da imunoexpress��o da fibronectina, do col��geno IV e da laminina foram mais expressivas no endot��lio dos vasos (68,33%, 76,66%, 73,33%, respectivamente), e menos relevantes na membrana basal (25,0%, 5,0% e 3,3%, respectivamente). CONCLUS��ES: No edema de Reinke, a imunoexpress��o da fibronectina, da laminina e do col��geno IV na membrana basal n��o apresentam relev��ncia, havendo predom��nio desses anticorpos no endot��lio do vasos.

Express��o antig��nica em carcinomas do plexo cor��ide humano: relato de dois casos

Neoplasias provenientes do epit��lio de revestimento do plexo cor��ide s��o inco-muns, tendo sido descritos 6 padr��es morfol��gicos. O padr��o anapl��sico, tamb��m denominado carcinoma do plexo cor��ide, �� o de menor freq����ncia e pode dar metastases fora do SNC. A distin����o histol��gica desses tumores, particularmente da variedade anapl��sica, com outras neoplasias prim��rias e metast��ticas no SNC pode ser dif��cil. O uso de t��cnicas imunocitoquimicas em parafina tem-se mostrado ��til no esclarecimento das linhagens tumorais. Os papilomas do plexo cor��ide t��m, no entanto, sido objeto de controv��rsia, por sua complexa express��o antig��nica. Usando a t��cnica de imunoperoxidase (sistema avidina-biotina-peroxidase) pesquisaram-se, em dois casos da variedade anapl��sica, os seguintes marcadores: prote��na glial fibrilar ��cida (GFAP) com anticorpo monoclonal e policlonal; ceratinas de 40-50kDa, ceratinas de 60-70kDa (callus ceratina), enolase neuronal espec��fica (NSE) e prote��na S-100, com anticorpos monoclonais. Os dois tumores mostraram positividade para NSE, prote��na S-100 e ceratina de 40-50kDa; uma das duas neoplasias mostrou diferencia����o glial, revelando positividade para GFAP tanto com anticorpo monoclonal quanto policlonal.

S-100 dendritic cells in normal and Dermatobia hominis infested cattle skin

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)

Express��o das prote��nas osteoprotegerina, RANK e RANKL durante o processo de reparo alveolar em ratos: estudo imunoistoqu��mico

Funda����o de Amparo �� Pesquisa do Estado de S��o Paulo (FAPESP)