Molecular determinants of virus-like nanoparticle assembly in vitro and in animal cell culture

Tese de doutoramento, Ciências Biotecnológicas (Engenharia Bioquímica), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Influência de um extrato aquoso de Coriandrum sativum na marcação in vitro de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e de sua associação com vibração gerada por plataforma oscilante na biodistribuição do radiofármaco Na99mTcO4 e na concentração de biomarcadores em ratos Wistar

Coriandrum sativum, conhecido popularmente como coentro, é um vegetal usado na alimentação humana. Também é utilizado como planta medicinal para tratamento de diabetes, complicações gastrintestinais, e como um antiedêmico, antisséptico e emenagogo. Em investigações acerca dos efeitos do extrato de plantas, é importante a determinação de alguns parâmetros físico-químicos. Diversos modelos experimentais têm sido usados, inclusive com o emprego de radionuclídeos. Em procedimentos da Medicina Nuclear que auxiliam o diagnóstico de doenças, o tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais utilizado. Hemácias marcadas com 99mTc estão entre as várias estruturas celulares que podem ser marcadas com este radionuclídeo e usadas como radiofármaco. Para a marcação com 99mTc é necessária a presença de um agente redutor, e o mais utilizado é o cloreto estanoso (SnCl2). As terapias com drogas e condições de dieta além de doenças podem alterar a marcação de constituintes sanguíneos, bem como a biodistribuição de diferentes radiofármacos. A exposição às vibrações geradas por plataforma oscilatória produz exercícios de corpo inteiro. O objetivo deste estudo foi caracterizar a preparação de um extrato do Coriandrum sativum, através de parâmetros físico-químicos, verificar os efeitos desse produto natural na radiomarcação de constituintes sanguíneos e em associação à vibração gerada pela plataforma na biodistribuição de Na99mTcO4 e na concentração de alguns biomarcadores. O extrato de coentro teve a o pico de absorbância em 480 nm. O extrato de coentro foi inversamente correlacionado com a concentração na condutividade elétrica. Foi encontrado o maior valor de pH na menor concentração do extrato (0,5 mg/mL). Não houve uma alteração significativa na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc. E a associação do extrato de coentro e vibração gerada por plataforma com frequência de 12 Hz teve efeito no baço, como observado na fixação do radiofármaco nesse órgão e ação em alguns órgãos alternando a concentração de alguns biomarcadores. Em conclusão, parâmetros físico-químicos podem ser úteis para caracterizar o extrato estudado. Provavelmente, as propriedades redox associadas com substâncias desse extrato podem ser os responsáveis pela ausência do efeito na radiomarcação de constituintes sanguíneos. A determinação da captação do Na99mTcO4 em diferentes órgãos permite verificar que o extrato de coentro sozinho não foi capaz de interferir na biodistribuição do radiofármaco. Contudo o tratamento de animais com vibração gerada pela plataforma alterou significativamente a fixação do pertecnetato de sódio no baço e a concentração do colesterol, triglicerídeo, CK e bilirrubina.

Resistência adesiva de sistemas autocondicionante e convencional frente a diferentes substratos e associação ao laser Nd:YAG: estudo in vitro

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Avaliação in vitro da associação do efeito antimicrobiano do ozônio associado a veículos e curativos de demora em diferentes períodos de tempo de armazenagem

Pós-graduação em Odontologia - FOAR

Avaliação in vitro do pH do hidróxido de cálcio usado como medicação intracanal em associação com clorexidina e racealfatocoferol

Objective: The aim of this study was to evaluate the pH of calcium hydroxide (CalenTM) when associated or not with chlorhexidine 0.4%, and when associated with chlorhexidine with the addition of 20% or 10% of alphatocopherol (AchéTM), assessed in several periods of time. Methods: Fourty dentine tubes 20 mm, properly standardized, were made from bovine anterior teeth roots. Following, a perforation was achieved in the roots distal face at 7 mm from the cervical radicular line by using a #1/2 carbide bur. After complete root sealing is made, except in the perforation local, the radicular canals were filled with one of the following associations: Group I – Calen®; Group II – Calen™ with chlorehxidine at 0.4%; Group III – Calen™ with chlorhexidine at 0.4% with the addition of 20% (weight) of alhatocopherol compound and Group IV – Calen™ with chlorhexidine at 0.4% with the addition of 10% (weight) alphatocopherol. After cervical sealing is accomplished, the roots were immersed in water MiliQ and the pH, assessed in 24h, 7, 14, 21, 28 and 45 days. Results and Conclusion: In all periods tested, the pH of the calcium hydroxide (Calen™) was similar to the pH of the calcium hydroxide (Calen™) associated with chlorhexidine 0.4% and 10% alphatocopherol (p > 0.05). The association of 20% alphatocopherol obtained the pH lower than the association with 10% (p < 0.05). The pH of the association with chlorhexidine was similar to the pure calcium hydrocide (Calen™) after the 14th day (p > 0.05) only. Therefore, on the 45th day, this difference was significant again (p < 0.05).

Estudo in vitro do efeito antibacteriano de cimentos de ionômero de vidro incorporados com diacetato de clorexidina

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar in vitro o efeito da ação antibacteriana de cimentos de ionômero de vidro (CIVs) convencionais incorporados com diacetato de clorexidina (DCHX) sobre o Streptococcus mutans. Foram testados os CIVs Maxxion R e Vitro Fil R com a incorporação dos percentuais de 0,5%, 1% e 2% de DCHX através de difusão em ágar e pela exaustão do DCHX por até 40 dias, a fim de observar a longevidade de sua ação inibitória. Foi também avaliado o efeito do fluoreto de sódio na ação antibacteriana do DCHX. Para determinar a diferença entre a média dos halos de inibição Os resultados foram analisados por análise de variância e pelo teste Student-Newman-Keuls (SNK). Todos os corpos de prova com DCHX apresentaram halo para os CIVs variando de 2,29mm a 6,82mm para o Maxxion R e de 1,73mm a 8,97mm para o Vitro Fil R. A capacidade de inibição foi proporcional à concentração de DCHX. Através do teste SNK apenas os grupos Vitro Fil R 0,5% e1% não variaram significativamente entre si. O 15o dia foi o de maior atividade antibacteriana para ambos os CIVs. Os grupos Maxxion R 1% e 2% foram os que menos apresentaram diferenças ao longo do tempo. Não houve crescimento de S mutans para os períodos de 7 e 15 dias de exaustão, sendo verificado o crescimento de colônias apenas na superfície do meio após o período de 96hs de incubação. Não foi observado efeito antagônico na capacidade antibacteriana do DCHX na presença de fluoreto de sódio. A incorporação de DCHX aos CIVs Maxxion R e Vitro Fil R, nas concentrações testadas e por um período de até 40 dias, apresentam resultados positivos no controle bacteriano de S mutans. Dentro das limitações deste estudo é lícito concluir que: efeito da inibição ao S mutans é dependente da concentração do DCHX; o fluoreto por si só não é capaz de inibir o crescimento de S mutans; a associação do DCHX com os CIVs não alterou a capacidade da ação antibacteriana da CHX; a ação antibacteriana da CHX incorporada aos CIVs se mantém eficaz por 15 dias, independente do CIV testado.

Estabelecimento de culturas de raízes in vitro e avaliação da produção de metabólitos secundários de Cleome spinosa Jacq. (Cleomaceae)

Cleome spinosa é uma espécie herbácea de uso na medicina popular, especialmente no Nordeste do Brasil. A cultura in vitro de raízes adventícias da espécie foi iniciada com segmentos radiculares (0,5 e 1,0 cm) obtidos a partir de duas fontes de explantes: plantas propagadas in vitro e plantas oriundas do processo de germinação in vitro. Os explantes foram inoculados em meio MS líquido suplementado ou não com as auxinas ANA, AIA e AIB em diferentes concentrações (0,5; 1,0; 1,5; 3,0; 5,0 mg.L-1). As culturas foram mantidas em sala de crescimento, sob agitação (100 rpm) e sob fotoperíodo de 16h ou no escuro, com subculturas a cada 45 dias. Explantes oriundos de plantas propagadas in vitro também foram cultivados em meio contendo a citocinina BAP em associação com auxinas, na presença de sorbitol (isoladamente ou em associação com sacarose), em meio MS contendo redução na concentração total de sais minerais (MS1/2 e MS1/4) e em meio sólido. Os resultados mostraram que a adição de auxinas ao meio de cultura foi essencial à multiplicação das raízes, uma vez que em meio MS0 ocorreu significativo desenvolvimento de brotos. A suplementação com ANA não foi eficiente para a produção de raízes e acarretou no calejamento dos explantes, enquanto que a presença de AIA e AIB resultaram na multiplicação das raízes. Ainda assim, independentemente das manipulações realizadas no meio de cultivo, a capacidade de multiplicação mostrou-se reduzida. Uma expressiva multiplicação de raízes foi observada em culturas iniciadas a partir de explantes oriundos de plantas obtidas por germinação in vitro. A maior produção de biomassa foi alcançada em culturas iniciadas com segmentos radiculares de plantas obtidas por germinação in vitro cultivadas em meio contendo com 3,0 mg.L-1 de AIB e mantidas no escuro. Culturas estabelecidas nas melhores condições para acúmulo de biomassa foram acompanhadas por três subculturas, sendo avaliados períodos de cultura de 45 dias e de 60 dias. Culturas mantidas a intervalos de 45 dias apresentaram maior produção de raízes durante a segunda subcultura, enquanto que para o intervalo de 60 dias, embora tenha sido observada a capacidade de multiplicação das raízes, a maior produção de biomassa ocorreu nos primeiros 60 dias de cultivo. A partir de materiais in vivo e in vitro foram realizadas extrações com solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol) e os extratos foram submetidos a avaliações cromatográficas. As análises por cromatografia em camada delgada mostraram a presença de terpenos nos extratos obtidos com hexano e diclorometano, tanto em material obtido a campo como naqueles produzidos in vitro e de compostos fenólicos nos extratos em acetato de etila obtidos a partir de material de campo. Pelas análises por cromatografia líquida associada à espectrometria de massas foi possível observar a presença de flavonoides nas culturas in vitro, não detectados no material de campo. As análises por cromatografia de fase gasosa associada à espectrometria de massas apontaram a presença de esteroides nos extratos em hexano de raízes coletadas a campo e nas culturas in vitro de raízes. Os resultados obtidos mostraram a viabilidade da produção de culturas de raízes in vitro para a espécie C. spinosa e o potencial deste material para a produção de substâncias bioativas, algumas não encontradas em material coletado a campo

Capacidade de invasão, persistência intracelular e atividade citotóxica de cepas de Aeromonas spp. em modelo celular in vitro e ex vivo

As Aeromonas são consideradas patógenos em potenciais para o homem e animais e estão amplamente distribuídas no ambiente sendo a água e os alimentos importantes veículos de transmissão. Muitos estudos têm demonstrado que a patologia causada pela infecção por Aeromonas é complexa e envolvem inúmeros fatores de virulência, dentre eles a aderência, invasão, enterotoxinas, hemolisinas, exoenzimas, sideróforos, flagelos, formação de biofilme e mecanismos de secreção. No presente estudo, analisamos os mecanismos de patogênese mediados por A. caviae e A. hydrophila, avaliando a participação desses microrganismos nos processos de adesão, invasão, persistência intracelular e citotoxidade celular. Foram utilizados ensaios quantitativos in vitro para testar associação, invasão e persistência intracelular em linhagens celulares HEp-2 e/ou T84. A interação de tecidos intestinais de coelho cultivados in vitro (IVOC) com três cepas de A. caviae originárias de fezes diarréicas também foi avaliada. Observamos que 10 (62,5%) das 16 cepas de Aeromonas spp. de diferentes origens, submetidas aos testes de invasão quantitativos foram capazes de invadir células HEp-2 e T84 em 6 horas de incubação. As cepas positivas nos testes de invasão foram submetidas ao teste quantitativo de persistência em células HEp-2 e sobreviveram no ambiente intracelular por 48 e/ou 72 horas sem multiplicação. A interação de três cepas de A. caviae com a mucosa intestinal de coelho ex vivo resultou em aderência, produção de muco e alterações como, intensa vacuolização e drástica desorganização estrutural que levaram a destruição das microvilosidades intestinais. Este estudo demonstrou que subconjuntos de cepas de A. caviae e A. hydrophila de diversas origens, foram capazes de invadir, persistir ou destruir linhagens celulares in vitro. Nosso estudo também evidenciou que cepas de A. caviae causaram expressivas alterações morfológicas que resultaram na destruição de epitélios intestinais de coelho ex vivo. Finalmente, nossos resultados contribuíram para reforçar o potencial patogênico de cepas de Aeromonas, em especial, as de origem vegetal e clínica.

Characterization of the toxic potential of nanomaterials using in vitro cell models

Os nanomateriais são estruturas com uma ou mais dimensões inferiores a 100 nanómetros. Devido à sua pequena dimensão, as nanopartículas apresentam atributos únicos, tais como a sua elevada área superficial relativamente à sua massa, reactividade ou força tênsil. Estas características influenciam grandemente algumas das propriedades dos nanomateriais, como a sua hidrofobicidade, carga ou toxicidade. As propriedades das nanopartículas tornam-nas também muito úteis para o Homem, sendo aplicadas em medicina, farmácia, electrónica, cosmética, vestuário e biotecnologia, entre outras. O aumento de produção e utilização de nanomateriais tem vindo a aumentar também a possibilidade de exposição humana a este tipo de partículas, levando a preocupações relativas ao risco de toxicidade aguda ou crónica. A exposição humana pode ocorrer por diversas vias, sendo as mais relevantes a via inalatória, ingestão ou contacto com a pele. Dependendo do material e do órgão-alvo, a exposição a nanomateriais pode conduzir a diferentes consequências biológicas: a nível dos órgãos, os nanomateriais podem levar a inflamação ou a supressão do sistema imunitário e, a nível celular e molecular, a perturbações na estrutura e integridade do genoma, assim como a interacções com moléculas biológicas e inibição da actividade proteica, entre outras consequências. Um dos nanomateriais mais utilizados são os nanotubos de carbono. Estes são constituídos por grafite cilíndrica disposta numa única camada (designados nanotubos de carbono de parede simples) ou em várias (nanotubos de carbono de parede múltipla). Os nanotubos de carbono apresentam propriedades como resistência e condutividade que os tornam muito úteis em aplicações como aparelhos electrónicos, vestuário ou biomedicina; cada vez mais, portanto, se torna provável a exposição ocupacional ou ambiental a este material. A semelhança estrutural destas partículas com fibras de amianto conduziu a questões relativas à sua segurança, pelo que já foram elaborados diversos estudos relativos aos seus efeitos biológicos. Alguns trabalhos sugerem que os nanotubos de carbono têm a capacidade de produzir toxicidade associada a lesões físicas, à produção de danos oxidativos por interacção com mecanismos celulares, ou a morte celular. Outros trabalhos defendem que estas partículas não causam toxicidade relevante. O projecto de dimensão europeia “NANoREG” surgiu da necessidade de ser desenvolvida legislação e regulamentação apoiadas em conhecimento científico e adequadas à produção e ao uso actual de nanomateriais. Este trabalho teve como objectivos principais a determinação do potencial cito- e genotóxico de um conjunto de nanotubos de carbono de parede múltipla (designados NM-400 a NM-403), e a consequente tentativa de associar este potencial às características físico-químicas dos nanomateriais. Com este objectivo, a exposição por via inalatória foi analisada, pelo uso de duas linhas celulares in vitro provenientes de tecidos do tracto respiratório: epitélio pulmonar (células A549) e epitélio brônquico (células BEAS-2B). A citotoxicidade dos nanotubos de carbono foi analisada com base em três parâmetros. Em primeiro lugar, as células foram contadas após a exposição aos nanomateriais utilizando o corante azul de tripanao para excluir as células inviáveis; a contagem foi realizada 3 e 24 horas após a exposição das células aos nanotubos. Os resultados deste ensaio apontam para a ausência de citotoxicidade após a exposição mais curta, e dados inconsistentes após a mais longa. Em segundo lugar, foi realizado o ensaio clonogénico, que se baseia na capacidade das células de se dividirem após a exposição ao agente em estudo. Este ensaio só foi realizado nas células A549 pois as BEAS-2B não permitem a formação de colónias. Os resultados apontam para uma citotoxicidade após a exposição a todos os nanomateriais, cuja intensidade se relaciona directamente com o tamanho das partículas, assim como ao seu diâmetro e área de superfície. Em terceiro lugar, foram calculados dois índices de viabilidade no ensaio dos Micronúcleos, cujo objectivo é avaliar se as células se dividiram durante a exposição aos nanomateriais em comparação com o controlo, e cujos resultados apresentam incoerências em relação aos outros já referidos. Estes dados podem ser justificados pelas diferenças existentes entre os ensaios, como o tempo de exposição ou a densidade celular. Os efeitos genotóxicos dos nanomateriais foram avaliados com recurso aos ensaios do cometa e dos micronúcleos. O primeiro detecta lesões pequenas e reversíveis nas cadeias de DNA, ao passo que o segundo detecta efeitos irreversíveis ao nível cromossómico, tais como quebras ou perdas de cromossomas. Os resultados do ensaio do cometa sugerem que nenhum dos nanomateriais testados é genotóxico, uma vez que em ambas as linhas celulares e em ambos os tempos de exposição, os resultados são negativos. O ensaio dos micronúcleos, por outro lado, aponta para existência de genotoxicidade de dois dos nanomateriais (NM-401 e NM-402) nas células A549, mas não em células BEAS-2B. Uma possível explicação para estes dados aparentemente contraditórios pode residir na hipótese de estes nanotubos de carbono serem compostos com efeitos aneugénicos, mas não clastogénicos: o ensaio dos micronúcleos permite a detecção de ambos os mecanismos de acção, ao passo que o ensaio do cometa só revela a quebra de cadeias de DNA. Outra justificação para os resultados é a possível influência da perda de viabilidade das células analisadas. Com base nos dados do ensaio clonogénico, estas partículas apresentam elevada citotoxicidade, pelo que os resultados dos ensaios de genotoxicidade, em particular do Ensaio do Cometa, poderão ser afectados por estes efeitos. O meio de cultura usado para expor as células aos nanomateriais também é um parâmetro muito relevante na sua toxicidade. Neste trabalho, foram usados meios de cultura com proteínas, que podem ser adsorvidas pelas partículas e formar uma “corona” em seu redor; este processo pode alterar propriedades importantes dos nanomateriais, entre os quais o seu potencial efeito biológico. Também o método usado para conseguir uma dispersão homogénea de nanomateriais pode conduzir a diferenças nos resultados dos ensaios de toxicidade. Neste estudo, foram observados alguns problemas relativos à perda de homogeneidade das dispersões de nanotubos de carbono, o que pode ter conduzido a que as células fossem expostas a massas de partículas de grandes dimensões conjuntamente com partículas individualizadas. O período durante o qual as células são expostas ao nanomaterial é também um aspecto essencial na produção de efeitos tóxicos. Resumindo, este projecto forneceu informações relativas à toxicidade dos nanotubos de carbono que, complementadas pelas conclusões dos restantes parceiros do projecto europeu, poderão contribuir significativamente para a avaliação de risco e criação de legislação relativamente à utilização de nanomateriais. Na linha celular BEAS-2B, nenhum destes nanomateriais parece produzir efeitos tóxicos, quer a nível de célula, quer a nível de genoma, nas condições experimentais utilizadas. Nas células A549, por outro lado, os três nanomateriais testados parecem ser acentuadamente citotóxicos, e dois deles (NM-401 e NM-402) são também genotóxicos. Em relação a perspectivas futuras, pode-se concluir que nem todos os ensaios de toxicidade existentes actualmente são adequados à análise de nanopartículas, pelo que novas metodologias devem ser desenvolvidas e complementadas por ensaios in vivo. Todos os estudos envolvendo nanomateriais deverão também descrever as características físico-químicas dos materiais usados, de forma a se poderem comparar os resultados com os de outros trabalhos.

Cultivo in vitro de raízes de tomateiro, menta e videira para produção de inóculo de fungo micorrízico arbuscular

Os Fungos Micorrízicos Arbusculares (FMAs) desempenham um papel importante na sustentabilidade dos ecossistemas, devido a importância da simbiose que formam com a maioria das plantas. A associação destes fungos com as raízes possibilita uma melhor nutrição das plantas, além de promover o crescimento e a resistência a fatores causadores de estresse. Desta forma, auxiliam no aumento da produtividade das mesmas, e na redução do uso de insumos químicos, como fertilizantes e agrotóxicos, na agricultura. Em função ao caráter de simbiontes obrigatórios, é de grande interesse o desenvolvimento de processos que permitam o isolamento, caracterização, manutenção de isolados e produção de inóculo desses fungos. Assim, com o objetivo de produzir um método de cultivo axênico, e que também possa auxiliar o estudo destes em áreas como a biologia molecular, testou-se protocolos de micropropagação para a produção in vitro de Glomus etunicatum W. N. Becker & Gerd., utilizando-se como hospedeiro raízes de tomateiro, videira e menta. Além destas culturas, que foram propagadas vegetativamente para a manutenção das culturas estoques e enraizadas in vitro com a aplicação exógena do regulador de crescimento ácido indolbutírico (AIB), trabalhou-se também com a cultura da menta, mas devido a problemas que ocorreram durante a etapa de enraizamento, não foi possível efetivar a associação do inóculo Na inoculação de esporos em raízes da videira cultivadas in vitro, não se obteve êxito. Com o cultivo in vitro de raízes de tomateiro foi possível conduzir os trabalhos até a etapa de colonização do FMA. No enraizamento in vitro das três culturas trabalhadas foi avaliado o número e o comprimento médio das raízes cultivadas nos meios de enraizamento nas doses de 0, 1,0 e 2,0 mg.L-1 de AIB. Para o tomateiro e a menta, o número e o comprimento médio de raízes por explante foram significativamente maiores com a dose de 1,0 mg.L-1 de AIB. Entretanto, para a cultura da videira, embora o uso de AIB, em ambas as doses de 1,0 e 2,0 mg.L-1 induziram um maior número de raízes, o comprimento médio de raízes foi maior quando AIB não foi adicionado no meio de enraizamento.

Efeitos in vivo do ácido metilmalônico sobre o comportamento de ratos no labirinto aquático de morris e in vitro sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo e sobre as atividades dos complexos I-IV da cadeia respiratória em homogeneizado de tecidos de ratos

A acidemia metilmalônica é uma desordem metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) e clinicamente por deterioração neurológica progressiva e falência renal. Os avanços no tratamento dessa doença alcançados nos últimos anos possibilitaram uma diminuição significativa na mortalidade dos mesmos. Entretanto, a morbidade continua alta, pois a maioria dos pacientes afetados por acidemia metilmalônica, mesmo recebendo o melhor tratamento disponível no momento, apresenta graus variáveis de comprometimento do sistema nervoso central refletido em retardo mental e atraso no desenvolvimento psicomotor. No presente estudo investigamos os efeitos in vivo da administração crônica do MMA em ratos Wistar durante o seu desenvolvimento (do 5º ao 28º dia de vida pós-natal) sobre o comportamento dos mesmos na tarefa do labirinto aquático de Morris. A tarefa foi realizada após um período de recuperação dos animais de 30 dias com o intuito de verificar dano neurológico permanente ou de longa duração nos animais. O labirinto aquático de Morris é uma tarefa bastante útil para a avaliação de aprendizado e memória espaciais. O protocolo da tarefa foi ligeiramente modificado para servir ao propósito de nosso trabalho, ou seja, o de avaliar o efeito da administração crônica de drogas sobre o comportamento de ratos. Verificamos que a administração crônica de MMA não provocou efeito no peso corporal, velocidade de natação e na fase de aquisição da tarefa. Porém, o tratamento prejudicou o desempenho dos animais no treino reverso, o que é condizente com comportamento perseverativo. Também avaliamos o efeito do ácido ascórbico, que foi administrado isoladamente ou em combinação com o MMA para testarmos se o estresse oxidativo poderia estar relacionado com as alterações comportamentais observadas no grupo tratado com MMA. Observamos que este antioxidante preveniu as alterações comportamentais provocadas pelo MMA, indicando que o estresse oxidativo pode estar envolvido com o efeito encontrado. Passamos então a avaliar o efeito in vitro do MMA sobre parâmetros de estresse oxidativo, mais especificamente na técnica de dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), que é um parâmetro de lipoperoxidação, e sobre o potencial antioxidante total do tecido (TRAP) e a reatividade antioxidante do tecido (TAR), que são parâmetros de defesas antioxidantes teciduais. O MMA na concentração de 2,5 mM aumentou a lipoperoxidação in vitro em homogeneizado de estriado e hipocampo de ratos e diminuiu o TRAP e o TAR em homogeneizado de estriado de ratos. Tais resultados indicam fortemente que o MMA induz estresse oxidativo. Finalmente investigamos o efeito in vitro do MMA sobre a atividade enzimática dos complexos da cadeia respiratória em várias estruturas cerebrais e em órgãos periféricos em ratos de 30 dias de vida no sentido de melhor esclarecer os mecanismos fisiopatológicos dos danos teciduais desta doença. Verificamos que o MMA causou uma inibição significativa da atividade do complexo II da cadeia respiratória em estriado e hipocampo quando baixas concentrações de sucinato foram utilizadas no meio de incubação. Além disso, verificamos que este efeito inibitório do MMA sobre o complexo II ocorreu somente após exposição do homogeneizado ao ácido por pelo menos 10 minutos, além do que esta inibição não foi prevenida pela co-incubação com o inibidor da óxido nítrico sintetase Nω- nitro-L-argininametilester (L-NAME) ou por uma associação de catalase e superóxido dismutase. Estes resultados sugerem que as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio mais comuns não estão envolvidas neste efeito, tornando improvável que a inibição do complexo II da cadeia respiratória seja mediada por estresse oxidativo. O MMA também causou uma inibição do complexo II-III em estriado, hipocampo, rim, fígado e coração; e inibiu o complexo I-III em fígado e rim. O complexo IV não foi afetado pela incubação com o ácido em nenhuma das estruturas testadas. Portanto, tomados em seu conjunto, estes resultados indicam que o MMA bloqueia a cadeia respiratória. Os resultados de nosso trabalho indicam que a administração crônica de MMA em ratos em desenvolvimento provocou alterações comportamentais de longa duração provavelmente mediadas por radicais livres, pois tais alterações foram prevenidas pelo antioxidante ácido ascórbico. O MMA também induziu estresse oxidativo in vitro em estriado e hipocampo e inibiu de forma diferenciada os complexos da cadeia respiratória nos tecidos estudados, sendo que as estruturas mais vulneráveis a esta ação foram o estriado e o hipocampo. Finalmente, nossos resultados sugerem que antioxidantes podem ajudar a prevenir, ou pelo menos atenuar, os danos teciduais provocados pelo MMA na acidemia metilmalônica.

Caracterização físico-química e avaliação dos perfis de liberação in vitro de micropartículas revestidas com nanocápsulas poliméricas

Micropartículas nanorrevestidas foram preparadas através da secagem por aspersão empregando-se suspensões de nanocápsulas poliméricas como material de revestimento. Uma matriz 2³ foi empregada, e os fatores analisados foram o método de preparação de nanocápsulas (nanoprecipitação e emulsificação-difusão), o polímero [poli(ε-caprolactona) e Eudragit® RS100] e a forma de inclusão da indometacina nas micropartículas (nanocápsulas ou núcleo). Duas formulações adicionais foram preparadas associando a indometacina ao dióxido de silício em etapa única, empregando nanocápsulas obtidas através do método de nanoprecipitação com a poli(ε-caprolactona) e com o Eudragit® RS100. As suspensões de nanocápsulas foram caracterizadas através da medida do pH, do tamanho médio de partícula, do potencial zeta e da eficiência de encapsulação. As micropartículas nanorrevestidas foram caracterizadas quanto ao tamanho de partícula, a taxa de associação, ao rendimento, a área superficial e ao volume de poros. A análise morfológica foi realizada através da microscopia eletrônica de varredura e da microscopia óptica. Também foram determinados o tamanho médio de partícula e o potencial zeta dos pós ressuspendidos. Os perfis de dissolução foram avaliados em tampão fosfato pH 6,8 através da eficiência de dissolução, dos fatores de similaridade e de diferença, da modelagem matemática e do modelo da Lei da Potência. O conjunto dos resultados permitiu selecionar as formulações preparadas com Eudragit® RS100 como sendo as mais promissoras, porque apresentaram maior controle da liberação do fármaco. Em relação à técnica de preparação das nanocápsulas foi selecionada a nanoprecipitação, pois possibilitou a redução de tensoativos, o que torna o processo de secagem mais eficiente. Além disso, a estratégia de associação do fármaco em uma etapa demonstrou perfis de liberação mais controlados para as micropartículas nanorrevestidas. A modelagem matemática empregando a Lei da Potência permitiu a proposição de um modelo de dissolução, a desaglomeração do sistema nanorrevestido microparticulado.

Food restriction induces in vivo ventricular dysfunction in spontaneously hypertensive rats without impairment of in vitro myocardial contractility

Cardiac structures, function, and myocardial contractility are affected by food restriction (FR). There are few experiments associating undernutrition with hypertension. The aim of the present study was to analyze the effects of FR on the cardiac response to hypertension in a genetic model of hypertension, the spontaneously hypertensive rat (SHR). Five-month-old SHR were fed a control or a calorie-restricted diet for 90 days. Global left ventricle (LV) systolic function was evaluated in vivo by transthoracic echocardiogram and myocardial contractility and diastolic function were assessed in vitro in an isovolumetrically beating isolated heart (Langendorff preparation). FR reduced LV systolic function (control (mean ± SD): 58.9 ± 8.2; FR: 50.8 ± 4.8%, N = 14, P < 0.05). Myocardial contractility was preserved when assessed by the +dP/dt (control: 3493 ± 379; FR: 3555 ± 211 mmHg/s, P > 0.05), and developed pressure (in vitro) at diastolic pressure of zero (control: 152 ± 16; FR: 149 ± 15 mmHg, N = 9, P > 0.05) and 25 mmHg (control: 155 ± 9; FR: 150 ± 10 mmHg, N = 9, P > 0.05). FR also induced eccentric ventricular remodeling, and reduced myocardial elasticity (control: 10.9 ± 1.6; FR: 9.2 ± 0.9%, N = 9, P < 0.05) and LV compliance (control: 82.6 ± 16.5; FR: 68.2 ± 9.1%, N = 9, P < 0.05). We conclude that FR causes systolic ventricular dysfunction without in vitro change in myocardial contractility and diastolic dysfunction probably due to a reduction in myocardial elasticity.

In vitro cultivation of canine multipotent mesenchymal stromal cells on collagen membranes treated with hyaluronic acid for cell therapy and tissue regeneration

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)