Adaptabilidade diferencial das variantes moleculares slow e fast da esterase-5 de Drosophila mulleri

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Sistemas aquosos bifásicos: fundamentos e aplicações para partição/purificação de proteínas

By the year 2005 the world biochemical market will reach an estimated $ 100 billion and separation processes are a vital link between lab discoveries and the fulfillment of this commercialization potential. The practical application of aqueous two-phase systems (ATPS) to extraction processes has been exploited for several years for the recovery of biological products. Unfortunately, this has not resulted in an extensive presence of the technique in commercial processes. In this paper a critical overview of the fundamental thermodynamic properties related to formation of aqueous two-phase systems and their application to extraction and purification of bioparticules is presented.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE COM CORANTE RED A versus TROCA IÔNICA-PERMEABILIDADE EM GEL: COMPARAÇÃO DA PRATICIDADE NA PURIFICAÇÃO DE ENTEROTOXINA ESTAFILOCÓCICA A

Culture supernatant of Staphylococcus aureus 722 in 3% triptone plus 1% yeast extract was used for EEA purification, proceeding comparison between dye ligand Red A affinity chromatography and classic chromatography. The capture of SEA with Amberlite CG-50 allowed rapid enterotoxin concentration from the culture supernatant. However, the ratio of 15 mg of the resin to a total of 150 mg of the toxin satured the resin, giving only 10 to 30% of SEA recuperation from the supernatant. The elution of concentrated material throught the Red A column resulted in a recovery of 60,87% of the toxin, and required 76 hours, indicating advantage on classic chromatography. Ion exchange column plus gel filtration recovered only 6,5 % of the SEA, and required 114 hours to conclude the procedure. The eletrophoresis of purified SEA indicated high grade of toxin obtained from Red A column, with 90 % of purity, compared to 60 % of classic column.

Cromatografia preparativa: caracterização e purificação de produtos e impurezas com aplicação na indústria de APIs

Neste trabalho efectuou-se o desenvolvimento de métodos de purificação de princípios activos farmacêuticos utilizando a cromatografia preparativa em coluna (eluição batch). Por motivos de confidencialidade as amostras tiveram a denominação de Amostra Projecto A, Amostra Projecto B, Amostra Projecto C e Amostra 2 - Projecto A. Estudou-se a performance de coluna para cada projecto utilizando colunas pré-preparadas e colunas preparadas com a tecnologia DAC (Dynamical Axial Compression). Elaborou-se o procedimento experimental de enchimento de colunas preparativas sob compressão axial. As impurezas isoladas por cromatografia preparativa foram sujeitas a caracterização HPLC e LC-MS. Com colunas pré-preparadas, obteve-se para a amostra do projecto A um rendimento de 70,59% e relativamente à amostra projecto B obteve-se u, rendimento de 15,39%. Relativamente à impureza isolada da amostra do projecto A, o estudo por HPLC revelou 98,69% de pureza, quanto à impureza da amostra projecto B obteve-se 88,80% de pureza. A impureza da amostra do projecto A exibiu por LC-MS a massa de 467,15 enquanto que a impureza da amostra do projecto B obteve 503,31. O enchimento de colunas preparativas sob pressão axial dinâmica foi realizado numa coluna de dimensão 260 X 25 mm, onde 76,60% da coluna foi compactada com o material de enchimento SepTech ST150-C18, 10 µm. A coluna foi testada com a impureza isolada do projecto A. Isolou-se o pico referente à impureza, e por LC-MS verificou-se que a impureza foi isolada eficientemente com 97,20& de pureza e massa 467,15 como indicado anteriormente. Em relação à preparação de colunas com a tecnologia DAC concluímos que, neste caso, é mais vantajoso realizar o enchimento das colunas do que efectuar a compra de colunas pré-preparadas. Com estes resultados pode-se concluir que a cromatografia preparativa é um método eficaz no isolamento de impurezas de APIs (Active Pharmaceutical Ingredients) face a métodos de purificação clássicos que foram realizados previamente noutros estudos. Com futuros desenvolvimentos e investimentos, facilmente poderá tornar-se num método de purificação indispensável na Indústria de Química Fina.

Superprodução, purificação e caracterização parcial de complexos proteína-polissacáridos inovadores a partir de estirpes de basidiomicetos

O presente trabalho teve como objectivo o estudo de meios de cultura, tendo em vista a superprodução de complexos proteína-polissacáridos, intracelulares e extracelulares, a partir dos basidiomicetos Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes. O meio de cultura suplementado com soro de leite apresentou diversas vantagens para a obtenção dessas macromoléculas biológicas, face aos restantes meios analisados, pelo que foi seleccionado para a produção em fermentador de laboratório em regime descontínuo. O crescimento da cultura foi efectuado a 28°C, 200 rpm e durante 10 dias, e as produtividades de complexos proteína-polissacáridos obtidas para o Pleurotus ostreatus foram de 0,008 ± 8,12 x 10-5 g/(L.dia) e de 0,324 ± 0,005 g/(L.dia), para os complexos precipitados a partir da biomassa e do caldo de fermentação, respectivamente. Posteriormente, os complexos intracelulares e extracelulares foram purificados por cromatografia de filtração em gel e parcialmente caracterizados, revelando concentrações de polissacáridos superiores à concentração proteica, pseudo-actividade de superóxido dismutase, e valores de Mr entre 64 e 9 000kDa. As amostras de complexos proteína-polissacáridos foram caracterizadas por HPLC e apresentaram picos de UV e IR com tempos de retenção de aproximadamente 6 e 12 minutos, respectivamente. Após hidrólise ácida, os complexos heteropolissacáridos obtidos apresentaram na sua constituição glucose, ramnose e arabinose. Adicionalmente, a análise dos complexos proteína-polissacáridos por FT-IR revelou bandas de absorção características destas macromoleculas biológicas, designadamente, a 846,5; 1032,3; 1186,4; 1471,0; 1648,8; 2739,6 e 3419,3 cm-1 para o Pleurotus ostreatus e 862,3; 1044,1; 1474,9; 1644,8; 2372,0; 2992,5; e 3415,4 cm-1 para Lentinula edodes.

Pesquisa de péptidos em Macroalgas dos Açores com potencial atividade inibitória da Enzima Conversora da Angiotensina I (ECA): Extração, purificação, caracterização e avaliação da sua atividade anti-hipertensiva

Jornadas "Ciência nos Açores – que futuro? Tema Ciências Naturais e Ambiente", Ponta Delgada, 7-8 de Junho de 2013.

Potencial da diversidade microbiana dos Açores na saúde : screening, purificação e caracterização de uma enzima trombolítica

Dissertação de Mestrado, Mestrado em Ciências Biomédicas, 8 de Maio de 2015, Universidade dos Açores.

Processos de purificação/ valorização do glicerol proveniente da produção de biodiesel

Mestrado em Engenharia Química - Ramo optimização energética na indústria química

Expressão e purificação da proteína E3 do vírus chikungunya (CHIKV)

RESUMO: O vírus chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA, com invólucro, da família Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribuído por largas regiões de África e Ásia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhança de sintomas com outras doenças como a dengue e a malária e a persistência de IgM específicas, dificultam o diagnóstico da infeção por CHIKV. A deteção no sangue de E3, uma glicoproteína viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimático poderá melhorar o diagnóstico nos países onde as técnicas de biologia molecular são de difícil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnóstico, esta deverá ser expressa em quantidade, purificada e usada para produção de anticorpos específicos. Para expressar E3 numa forma solúvel, suscetível de ser purificada num único passo cromatográfico sem proteases, recorreu-se à estratégia da fusão com o domínio de ligação à quitina (CBD)-inteína (IMPACT™ System, NEB). A sequência codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma proteína de fusão insolúvel de 64 kDa. A expressão a 12ºC induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-inteína-E3. A aplicação de lisados celulares em colunas de quitina originou a retenção de CBD-inteína-E3 na matriz. Porém, a autoclivagem da inteína na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a proteína E3 separada não eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de níquel permitiram a eluição de uma proteína de 9 kDa, compatível com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da proteína de 9 kDa será confirmada pela indução de anticorpos com esta preparação e reatividade daqueles com células infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT™ System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12ºC and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30ºC, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.

Culturas de células em suspensão de medicago truncatula expressando L-PGDS humana: estabelecimento de linhas transgénicas estáveis e purificação do produto recombinante

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Clonagem e purificação de fragmento da proteína capsidial de Banana streak OL virus

O objetivo deste trabalho foi clonar e induzir a expressão de fragmento da proteína capsidial de Banana streak OL virus (BSOLV-CP) em Escherichia coli, bem como purificar a proteína recombinante obtida. Empregou-se um par de iniciadores específicos para amplificar, em PCR, um fragmento de aproximadamente 390 pb, da região codificadora da porção central da BSOLV-CP. O fragmento obtido foi clonado em vetor pGEM-T Easy, subclonado em vetor pQE-30 e transformado em células de E. coli M15 (pREP4) por choque térmico. A expressão da proteína foi induzida por tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG), e a proteína recombinante BSOLV-rcCP de 14 kDa foi detectada em Western blot e Dot blot. A expressão da proteína BSOLV-rcCP abre novas possibilidades para a obtenção de antígenos para a produção de antissoros contra o BSOLV.

Avaliação de filtros domésticos comerciais para purificação de águas e retenção de contaminantes inorgânicos

Twenty domestic commercial filters, in order to determine the percentual retention of color, turbidity, dry residue, bicarbonates, carbonates, total hardness, nitrogens, iron, chlorides, fluorides, and residual chlorine (parameters of food legislation) and sulphides in thirteen water samples proceeding from springs, wells, rivers, lakes, drinking patterns and standards, before and after purification were evaluated. The results showed that purifiers presented adequate retention for nitrates (74.8 ± 16.2 %) and residual chlorine (74.0 ± 11.2) and medium retention for sulphides (61.7 ± 11.3); while porcelain plus activated carbon filters presented adequate retention for color (90.0 ± 19.7), turbidity (76.4 ± 18.4) and iron (83.5 ± 15.1). Therefore the retention of carbonates, bicarbonates, total hardness, chlorides, dry residue, fluorides, ammonium nitrogens and nitrites was less than 10%, and the values of pH didn't show significant variation, for all the filters studied.

Uma rota alternativa para a síntese de PPh2Si(CH3)3 segundo Appel; preparação e purificação dePPh2H (Ph = fenila)

The unexpected low yield in the Appel's synthesis of PPh2Si(CH3)3 can be attributed to the presence of phenyllithium and its interfering reactions. The method was carried out with hydrolysis of the products formed by the reaction of PPh3 with metallic lithium, phenyllithium and lithiumdiphenylphosphide. PPh2Si(CH3)3 was obtained by subsequent reaction of the resulting diphenylphosphin with elemental lithium and ClSi(CH3)3.

Métodos de baixo custo para purificação de reagentes e controle da contaminação para a determinação de metais traços em águas naturais

Probably one of the most difficult and challenging aspects of measuring trace metals in natural waters is to avoid contamination during sampling, manipulation and analysis. This work discusses how to avoid contamination using simple procedures, and considers alternative methods to purify deionised water and low grade reagents to enable accurate determination of trace metals in natural waters in a common laboratory. Measurements were performed by cathodic stripping voltammetry and copper was used as a model metal to test the procedures. It was possible to evaluate copper speciation in natural waters even when total dissolved copper concentration was as low as 1.5 nmol L-1. The methods' accuracy was confirmed by analysis of certified seawater.