RNF220，HCA127和ASPP2在神经系统发育中的功能研究

蛋白质降解对细胞生命活动的调节起着非常重要的作用，而泛素－蛋白酶体系统 （UPS）负责调控细胞内大部分蛋白的降解。UPS 与神经系统的功能有着密切的联系， 它可以控制神经的生长发育、调节突触的可塑性与功能，而其功能异常时会导致多种 神经退行性疾病。因此，在神经系统中研究泛素－蛋白酶体系统具有重要的生物学和 医学意义。 我们在非洲爪蟾大规模原位杂交中鉴定到一个在神经管腹侧特异表达的基因 xRNF220-like。同时我们也克隆了小鼠的mRNF220 和爪蟾的xRNF220 基因。它们都 在神经管的腹侧表达，且蛋白都具有E3 泛素连接酶的活性。为了寻找其降解的底物， 我们通过酵母双杂交技术进行筛选。我们发现mRNF220 可以与Sin3B 蛋白结合。进 一步实验发现Sin3B 受到UPS 的调控。而mRNF220 可以促进Sin3B 的泛素化修饰与 降解。在爪蟾胚胎中通过morpholino 阻断xRNF220-like 和Sin3B 的功能都可以导致 神经发育的异常。因此，在神经系统中mRNF220 可能通过控制Sin3B 的蛋白水平来 调节Sin3/HDAC 转录抑制复合体的活性，进而调节神经相关基因的表达。 我们还发现了一个可以与RNF220 及RNF220-like 结合的新基因HCA127。 HCA127 在进化上非常保守，在早期胚胎中特异地表达在神经管位置。在胚胎中阻断 其功能会影响神经的诱导与分化。生化实验表明HCA127 并不能被泛素化修饰。通 过对HCA127 进行酵母双杂交筛选我们发现它跟多个RING 泛素连接酶有相互作用， 还可以与一些泛素化通路中的调节蛋白结合，提示它可能是UPS 中的调节蛋白。将 其转染细胞发现可以降低细胞的泛素化水平。因此，HCA127 在神经系统中可能通过 调节蛋白的泛素化修饰来发挥功能。我们还对ASPP2 基因在早期发育中的功能进行了初步研究。ASPP2 可以促进p53 介导的细胞凋亡，并在体内抑制肿瘤的发生，但其在早期发育中的功能仍不清楚。我 们发现ASPP2 在神经系统有非常强的表达。阻断其功能可以导致眼睛、体轴和头部 的异常，并影响细胞增殖，还可以抑制神经分化标记基因N-tubulin 和神经嵴标记基 因Slug 的表达。我们初步揭示了ASPP2 在早期神经发育的功能。

猕猴胚胎干细胞神经分化过程中ASPP家族变化的初步研究

为研究肿瘤细胞凋亡调控因子ASPP(Apoptosis-stimulating protein of p53)家族蛋白(ASPP1,ASPP2,iASPP)在猕猴神经系统细胞早期发育过程中是否存在变化,并初步研究其变化趋势,通过体外诱导猕猴胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞模拟猕猴神经系统细胞早期发育过程,并对此过程中细胞内ASPP蛋白量进行检测,检测方法使用细胞免疫荧光和western blotting.实验初步检测出,肿瘤调控因子ASPP家族蛋白在猕猴神经系统细胞早期发育过程中在蛋白量和蛋白分子量上有变化,并且可以初步了解其变化趋势.该实验结果表明ASPP蛋白家族作为肿瘤细胞凋亡调控因子与猕猴神经系统早期发育过程有着密切的关系,这也许对将来治疗神经系统退行性疾病和肿瘤发生有一定帮助.

Role of the ASPP Family in the Regulation of p53-Mediated Apoptotic Death of Retinal Ganglion Cells after Optic Nerve Injury

Le glaucome est la première cause de cécité irréversible à travers le monde. À présent il n’existe aucun remède au glaucome, et les thérapies adoptées sont souvent inadéquates. La perte de vision causée par le glaucome est due à la mort sélective des cellules rétiniennes ganglionnaires, les neurones qui envoient de l’information visuelle de la rétine au cerveau. Le mécanisme principal menant au dommage des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome n’est pas bien compris, mais quelques responsables putatifs ont été proposés tels que l’excitotoxicité, le manque de neurotrophines, la compression mécanique, l’ischémie, les astrocytes réactifs et le stress oxidatif, parmis d’autres. Indépendamment de la cause, il est bien établi que la perte des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome est causée par la mort cellulaire programmée apoptotique. Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui déclenchent l’apoptose dans les cellules rétiniennes ganglionnaires adultes sont mal définis. Pour aborder ce point, j’ai avancé l’hypothèse centrale que l’identification de voies de signalisations moléculaires impliquées dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires offrirait des avenues thérapeutiques pour ralentir ou même prévenir la mort de celles-ci lors de neuropathies oculaires telles que le glaucome. Dans la première partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle de la famille de protéines stimulatrices d’apoptose de p53 (ASPP), protéines régulatrices de la famille p53, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. p53 est un facteur de transcription nucléaire impliqué dans des fonctions cellulaires variant de la transcription à l’apoptose. Les membres de la famille ASPP, soit ASPP1, ASPP2 et iASPP, sont des protéines de liaison de p53 qui régulent l’apoptose. Pourtant, le rôle de la famille des ASPP dans la mort des cellules rétiniennes ganglionnaires est inconnu. ASPP1 et ASPP2 étant pro-apoptotiques, l’hypothèse de cette première étude est que la baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après une blessure du nerf optique. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé de mort apoptotique neuronale induite par axotomie du nerf optique chez le rat de type Sprague Dawley. Les résultats de cette étude (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) ont démontré que p53 est impliqué dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et qu’une baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 par acide ribonucléique d’interference promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle d’iASPP, le membre anti-apoptotique de la famille des ASPP, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. L’hypothèse de cette seconde étude est que la surexpression d’iASPP promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après axotomie. Mes résultats (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) démontrent que le knockdown ciblé de iASPP exacerbe la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et que la surexpression de iASPP par virus adéno-associé promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents la perte de cellules rétiniennes ganglionnaires par apoptose et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour le traitement de maladies neurodégénératives telles que le glaucome.