Fast Structure-Based Assignment of 15N HSQC Spectra of Selectively 15N-Labeled Paramagnetic Proteins

A novel strategy for fast NMR resonance assignment of N-15 HSQC spectra of proteins is presented. It requires the structure coordinates of the protein, a paramagnetic center, and one or more residue-selectively N-15-labeled samples. Comparison of sensitive undecoupled N-15 HSQC spectra recorded of paramagnetic and diamagnetic samples yields data for every cross-peak on pseudocontact shift, paramagnetic relaxation enhancement, cross-correlation between Curie-spin and dipole-dipole relaxation, and residual dipolar coupling. Comparison of these four different paramagnetic quantities with predictions from the three-dimensional structure simultaneously yields the resonance assignment and the anisotropy of the susceptibility tensor of the paramagnetic center. The method is demonstrated with the 30 kDa complex between the N-terminal domain of the epsilon subunit and the theta subunit of Escherichia Coll DNA polymerase III. The program PLATYPUS was developed to perform the assignment, provide a measure of reliability of the assignment, and determine the susceptibility tensor anisotropy.

Nitrogen fertilizer (15N) leaching in a central pivot fertigated coffee crop

Nitrogen has a complex dynamics in the soil-plant-atmosphere system. N fertilizers are subject to chemical and microbial transformations in soils that can result in significant losses. Considering the cost of fertilizers, the adoption of good management practices like fertigation could improve the N use efficiency by crops. Water balances (WB) were applied to evaluate fertilizer N leaching using 15N labeled urea in west Bahia, Brazil. Three scenarios (2008/2009) were established: i) rainfall + irrigation the full year, ii) rainfall only; and iii) rainfall + irrigation only in the dry season. The water excess was considered equal to the deep drainage for the very flat area (runoff = 0) with a water table located several meters below soil surface (capillary rise = 0). The control volume for water balance calculations was the 0 - 1 m soil layer, considering that it involves the active root system. The water drained below 1 m was used to estimate fertilizer N leaching losses. WB calculations used the mathematic model of Penman-Monteith for evapotranspiration, considering the crop coefficient equal to unity. The high N application rate associated to the high rainfall plus irrigation was found to be the main cause for leaching, which values were 14.7 and 104.5 kg ha-1 for the rates 400 and 800 kg ha-1 of N, corresponding to 3.7 and 13.1 % of the applied fertilizer, respectively.

DESTINO DE FERTILIZANTES NITROGENADOS (15N) EM UM LATOSSOLO AMARELO CULTIVADO COM FEIJÃO CAUPI (Vigna unguiculata L.)

O trabalho foi realizado com o objetivo de estudar o destino de duas formas de fertilizantes nitrogenados enriquecidos com 15N em um latossolo amarelo da Amazônia Central, cultivado com feijão caupi (Vigna unguiculata L.). A aplicação de 30 kg/ha de Ν não mostrou efeito significativo na produção. O balanço do nitrogênio aplicado no final do período da cultura mostrou que a remoção do Ν dos fertilizantes pelos grãos foi, respectivamente, 23 e 25%, com aplicação de sulfato de amônio e uréia; 35% do Ν do sulfato de amônio e 39% da uréia, permaneceram no solo na camada de 0-30 cm. As perdas variaram de 36 a 42% para uréia e sulfato de amônio, respectivamente. Aproximadamente 15% do Ν dos fertilizantes, foi determinado nos horizontes mais profundos, indicando que as perdas de Ν nesse solo são provavelmente devidas à lixiviação e a outros processos não determinados neste trabalho.

Efeito de diferentes épocas e modos de aplicação do nitrogênio na produção do milho, na quantidade de proteína, na eficiência do fertilizante, e na diagnose foliar, utilizando o sulfato de amônio-15N

O experimento foi conduzido em um solo podzólico de Lins e Marília - variação Lins, barro arenoso, localizado no Município de Monte Azul Paulista, do Estado de São Paulo. O híbrido duplo H-6999B foi utilizado. O experimento constou de 8 tratamentos com 6 repetições. A quantidade de nitrogênio aplicado na forma de sulfato de amônio -15N, foi de 100 Kg/ha, e as de fósforo e de potássio foram de 100 Kg P3O5/ha e de 50Kg K2O/ha nas formas de superfosfato simples e de cloreto de potássio, respectivamente. Em relação aos modos de aplicação, os dados mostraram que não houve diferença significativa entre eles, embora as parcelas que receberam o nitrogênio a) em faixa, b) em faixa mais aplicação lateral e c) incorporado mais faixa e mais aplicação lateral, deram produções maiores (7.100 Kg/ha em média). Estes dados foram corroborados pela percentagem do nitrogênio na planta proveniente do fertilizante. A aplicação lateral do nitrogênio, 40 dias após a semeadura, acusou a maior quantidade de proteína (377 Kg/ha) e maior eficiência no aproveitamento do fertilizante e na sua conversão em proteína. Correlação positiva (r = 0,691) foi encontrada entre a produção e a concentração de nitrogênio na folha escolhida para fins de diagnose do estado nutricional da planta de milho.

Adubacão foliar de mudas de café (Coffea arabica, L., var. Mundo Nôvo) com três fontes de nitrogênio - 15N

O presente trabalho foi conduzido com a finalidade de se avaliar o efeito da aplicação foliar no nitrogênio em mudas de café (Coffea arabica L, var. Mundo Nôvo). Para isso, três fontes de fertilizantes nitrogenados - NaNO3, (NH4)2SO4 e (NH2)2CO - enriquecidos com 0,7, 0,6 e 0,4% de átomos de 15N em excesso, respectivamente, foram utilizados, aplicando-as de vários modos: 1) aplicação da dose total de cada fonte de nitrogênio ao solo; 2) aplicação da dose total de cada fonte exclusivamente foliar e 3) aplicação da metade desta dose total ao solo e da outra metade por via foliar, além das correspondentes testemunhas. O desenho experimental foi de blocos ao acaso, com 14 tratamentos e 3 repetições, com parte dos tratamentos em arranjo fatorial. As mudas de café, de 6 meses de idade foram cultivadas em casa de vegetação, durante um período de 7 meses. A seguir, as palantas foram separadas em frações raiz, caule e folha. Sobre estas frações, secas em estufa, pesadas e moídas, procedeu-se às análises químicas do nitrogênio e à determinação da relação isotópica 14N/15N. A produção de matéria seca, a quantidade de nitrogênio absorvido, aquela proveniente do solo e do fertilizante, por cada tratamento, em cada fração e na planta toda. foram utilizados para avaliar o efeito da adubação foliar ds fontes de nitrogênio. Pra a aplicação foliar do nitrogênio, foi construído um sistema espacial de pulverização. De acordo com os resultados obtidos são apresentadas, a continuação, as seguintes inferências. De maneira geral, a aplicação das três fontes de nitrogênio ao solo, seguida pela aplicação combinada ao solo e à folha, deram maior produção de matéria seca, não havendo diferença entre as fontes. Em relação a absorção do nitrogênio total, foi verificada uma maior absorção com a aplicação ao solo das três fontes de nitrogênio. No que diz respeito ao nitrogênio nas plantulas provenientes do fertilizante, a aplicação ao solo foi superior a aplicação foliar, para as três fontes. A porcentagem da eficiência do nitrogênio foi de 39%. Na aplicação foliar, a eficiência do nitrogênio foi 12,8%, 9,7% e 8,6% para nitrato de sódio, a uréia e o sulfato de amônio respectivamente. Na aplicação combinada, metade solo mais metade folha, a eficiência foi de 33,5%, 23,3% e 22,7% para o nitrato de sódio, o sulfato de amônio e a uréia, respectivamente. É difícil, no presente trabalho, explicar a pouca absorção do nitrogênio aplicada por pulverização foliar, destacando-se o nitrato de sódio em relação Ys outras fontes.

Efeitos de épocas e de modos de aplicação do sulfato de amônio- 15N e interação nitrogênio - 15N - fósforo - 32P, na quantidade e teores de N, P, K na planta e na folha do milho, na produção, na quantidade de proteína e eficiência do nitrogênio do fertilizante convertido em proteína

O experimento constou de 10 tratamentos, com 6 repetições. Em todos os tratamentos, o fósforo - 32P foi aplicado em faixa, enquanto que variam os modos de aplicação de nitrogênio - 15N, o qual foi incorporado ao solo, ou colocado na mesma faixa que o superfosfato, ou em faixa em separado, na semeadura, ou aplicado lateralmente 35, 63, 73 e 82 dias após a semeadura. A quantidade de nitrogênio foi de 80 kg/ha na forma de sulfato de amônio - N e a de fósforo de 15 kg/ha na forma de superfosfato - 32P. Verificou-se que: 1) maior produção foi obtida quando o nitrogênio e o fósforo foram misturados e aplicados em faixa na semeadura; 2) menor produção e menor quantidade de proteína foram obtidas quando o fósforo foi aplicado em faixa e o nitrogênio aplicado lateralmente 83 dias após a semeadura; 3) a aplicação do fósforo em faixa na semeadura e a aplicação do nitrogênio lateralmente, 63 dias apos a semeadura deu ensejo a maior quantidade de proteína e a maior eficiência do nitrogênio do fertilizante na sua conversão em proteína; 4) em relação a percentagem do fosforo na planta proveniente do fertilizante, a absorção de fósforo foi maior quando o nitrogênio e o fósforo foram misturados e aplicados na mesma faixa, indicando, assim, um efeito do NH* na absorção do fósforo, porem este efeito desapareceu aos 63 dias. Em relação a % NPPF, houve um efeito de curta duração do fósforo na absorção do nitrogênio; 5) o milho continua absorvendo o nitrogênio do fertilizante, mesmo quando aplicado, lateralmente, aos 73 dias e 83 dias após a semeadura, com reflexo positivo no aumento do teor e quantidade de proteína; 6) a folha do milho +2 pode ser escolhida para analises 73 dias após a semeadura como indicador do estado nutricional do milho em nitrogênio e fósforo. No caso do potássio, a folha +2 devera ser analisada 117 dias após a semeadura; 7) o super fosfato na dose utilizada constituiu um fator limitante na produção.

Efeito do déficit de água no aproveitamento do nitrogênio - 15n na cultura do trigo

Três fontes de nitrogênio - 15n foram utilizadas: sulfato de amônio, nitrato de amônio e uréia. Elas foram aplicadas no plantio de dois modos: a lanço e a seguir incorporadas ao solo, ou no sulco de plantio. Determinou-se a eficiência de utilização do nitrogênio - 15n aplicado no plantio e no perfilhamento, sendo respectivamente, em media 14 e 13% do nitrogênio aplicado e utilizados pelo trigo. Obtiveram-se valores de 16 e 12% de eficiência do nitrogênio - 15n aplicado no sulco de plantio ou a lanço e a seguir incorporado ao solo, respectivamente.

Natural abundance of stable isotopes (15N and 13C) and isotopic fractionation of sea bream muscle as markers of food and culture conditions and its relationship with metabolic and proteomic analyses

Els isòtops estables com a traçadors de la cadena alimentària, s'han utilitzat per caracteritzar la relació entre els consumidors i els seus aliments, ja que el fraccionament isotòpic implica una discriminació en contra de certs isòtops. Però les anàlisis d'isòtops estables (SIA), també es poden dur a terme en peixos cultivats amb dietes artificials, com la orada (Sparus aurata), la especie más cultivada en el Mediterráneo. Canvis en l'abundància natural d'isòtops estables (13C i 15N) en els teixits i les seves reserves poden reflectir els canvis en l'ús i reciclatge dels nutrients ja que els enzims catabòlics implicats en els processos de descarboxilació i desaminació mostren una preferència pels isòtops més lleugers. Per tant, aquestes anàlisis ens poden proporcionar informació útil sobre l'estat nutricional i metabòlic dels peixos. L'objectiu d'aquest projecte va ser determinar la capacitat dels isòtops estables per ser utilitzats com a marcadors potencials de la capacitat de creixement i condicions de cria de l'orada. En aquest sentit, les anàlisis d'isòtops estables s'han combinat amb altres metabòlics (activitats citocrom-c-oxidasa, COX, i citrat sintasa, CS) i els paràmetres de creixement (ARN/ADN). El conjunt de resultats obtinguts en els diferents estudis realitzats en aquest projecte demostra que el SIA, en combinació amb altres paràmetres metabòlics, pot servir com una eina eficaç per discriminar els peixos amb millor potencial de creixement, així com a marcador sensible de l'estat nutricional i d'engreix. D'altra banda, la combinació de l'anàlisi d'isòtops estables amb les eines emergents, com ara tècniques de proteòmica (2D-PAGE), ens proporciona nous coneixements sobre els canvis metabòlics que ocorren en els músculs dels peixos durant l‟increment del creixement muscular induït per l'exercici.

δ 15N measurement of organic and inorganic substances by EA-IRMS: a speciation-dependent procedure

Little attention has been paid so far to the influence of the chemical nature of the substance when measuring δ 15N by elemental analysis (EA)-isotope ratio mass spectrometry (IRMS). Although the bulk nitrogen isotope analysis of organic material is not to be questioned, literature from different disciplines using IRMS provides hints that the quantitative conversion of nitrate into nitrogen presents difficulties. We observed abnormal series of δ 15N values of laboratory standards and nitrates. These unexpected results were shown to be related to the tailing of the nitrogen peak of nitrate-containing compounds. A series of experiments were set up to investigate the cause of this phenomenon, using ammonium nitrate (NH4NO3) and potassium nitrate (KNO3) samples, two organic laboratory standards as well as the international secondary reference materials IAEA-N1, IAEA-N2-two ammonium sulphates [(NH4)2SO4]-and IAEA-NO-3, a potassium nitrate. In experiment 1, we used graphite and vanadium pentoxide (V2O5) as additives to observe if they could enhance the decomposition (combustion) of nitrates. In experiment 2, we tested another elemental analyser configuration including an additional section of reduced copper in order to see whether or not the tailing could originate from an incomplete reduction process. Finally, we modified several parameters of the method and observed their influence on the peak shape, δ 15N value and nitrogen content in weight percent of nitrogen of the target substances. We found the best results using mere thermal decomposition in helium, under exclusion of any oxygen. We show that the analytical procedure used for organic samples should not be used for nitrates because of their different chemical nature. We present the best performance given one set of sample introduction parameters for the analysis of nitrates, as well as for the ammonium sulphate IAEA-N1 and IAEA-N2 reference materials. We discuss these results considering the thermochemistry of the substances and the analytical technique itself. The results emphasise the difference in chemical nature of inorganic and organic samples, which necessarily involves distinct thermochemistry when analysed by EA-IRMS. Therefore, they should not be processed using the same analytical procedure. This clearly impacts on the way international secondary reference materials should be used for the calibration of organic laboratory standards.

Utilização de isótopos estáveis de 13C e 15N na identificação de bacalhau Gadus e outras espécies de peixes salgados secos

O Brasil é dos países líderes na importação de peixes salgados e secos. Em 2008, importou da Noruega cerca de 30 mil toneladas destes produtos, a um custo de aproximadamente 190 milhões de dólares. O bacalhau é um produto salgado e seco bastante apreciado no país, mas espécies afins, de menor valor comercial, são também utilizadas na fabricação de peixes salgados secos e muitas vezes comercializadas como o bacalhau do Atlântico (Gadus morhua). A variação da razão de isótopos estáveis de carbono (13C/12C) e de nitrogênio (15N/14N) é medida com alta precisão por espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS) e nos últimos 20 anos tem aumentado significativamente a aplicação desta tecnologia na avaliação de fraudes e adulterações dos alimentos. O objetivo deste trabalho foi utilizar isótopos estáveis de 15N e 13C na identificação de bacalhau e espécies afins. Utilizando a análise isotópica, em músculos e ossos, foi possível diferenciar o bacalhau (do Atlântico e do Pacífico) de Ling, Zarbo e Saithe (p < 0,01), que são três produtos salgados e secos de menor valor comercial. Com a pele não foi possível tal distinção entre bacalhau do Pacífico e Ling (p > 0,05). A combinação de análises de valores de 15N de diferentes tecidos – músculo, pele e ossos – possibilitou a separação das espécies. A comparação gráfica de valores de 15N de músculo vs. pele, músculo vs. ossos e pele vs. ossos permite estabelecer três regiões de confiança: uma com bacalhau do Atlântico e bacalhau do Pacífico; outra com Ling e Zarbo; e finalmente, uma terceira região com o Saithe isolada de todos. Os resultados obtidos demonstram que a metodologia é viável para a distinção entre bacalhau e outros peixes salgados secos. No entanto, conclusões mais seguras serão obtidas com uma base de dados, para que, isotopicamente, se faça um histórico da origem desses peixes

Utilização de isótopos estáveis de 13C e 15N na identificação de bacalhau Gadus e outras espécies de peixes salgados secos

O Brasil é dos países líderes na importação de peixes salgados e secos. Em 2008, importou da Noruega cerca de 30 mil toneladas destes produtos, a um custo de aproximadamente 190 milhões de dólares. O bacalhau é um produto salgado e seco bastante apreciado no país, mas espécies afins, de menor valor comercial, são também utilizadas na fabricação de peixes salgados secos e muitas vezes comercializadas como o bacalhau do Atlântico (Gadus morhua). A variação da razão de isótopos estáveis de carbono (13C/12C) e de nitrogênio (15N/14N) é medida com alta precisão por espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS) e nos últimos 20 anos tem aumentado significativamente a aplicação desta tecnologia na avaliação de fraudes e adulterações dos alimentos. O objetivo deste trabalho foi utilizar isótopos estáveis de 15N e 13C na identificação de bacalhau e espécies afins. Utilizando a análise isotópica, em músculos e ossos, foi possível diferenciar o bacalhau (do Atlântico e do Pacífico) de Ling, Zarbo e Saithe (p < 0,01), que são três produtos salgados e secos de menor valor comercial. Com a pele não foi possível tal distinção entre bacalhau do Pacífico e Ling (p > 0,05). A combinação de análises de valores de 15N de diferentes tecidos – músculo, pele e ossos – possibilitou a separação das espécies. A comparação gráfica de valores de 15N de músculo vs. pele, músculo vs. ossos e pele vs. ossos permite estabelecer três regiões de confiança: uma com bacalhau do Atlântico e bacalhau do Pacífico; outra com Ling e Zarbo; e finalmente, uma terceira região com o Saithe isolada de todos. Os resultados obtidos demonstram que a metodologia é viável para a distinção entre bacalhau e outros peixes salgados secos. No entanto, conclusões mais seguras serão obtidas com uma base de dados, para que, isotopicamente, se faça um histórico da origem desses peixes.

Destino de adubos nitrogenados marcados com 15N em amostras de dois solos da Amazônia central

Foi estudado, em condições de casa de vegetação, em Nancy (França), em 1992, o destino de duas formas de fertilizantes nitrogenados, marcados com 15N, sulfato de amônio e uréia, em amostras do horizonte A de dois principais solos da Amazônia Central, classificados como latossolo amarelo e podzólico vermelho-amarelo. A planta teste foi o "rye-grass" da Itália (Lolium multiflorum L.). Em ambos os solos, a uréia foi mais bem utilizada do que o sulfato de amônio. Entre 60 e 70% do N aplicado como uréia foi absorvido pela planta, enquanto, com a aplicação de sulfato de amônio, esses valores variaram entre 44 e 49%. O balanço do 15N no final do ciclo da cultura mostrou que a imobilização do N nos dois solos foi maior na presença de uréia que na de sulfato de amônio. As perdas, estimadas por diferença, foram mais elevadas no tratamento com sulfato de amônio. Considerando que perdas por lixiviação foram praticamente nulas com a técnica de cultivo utilizada, elas devem ter ocorrido essencialmente por via gasosa.

Eficiência da fertilização nitrogenada com uréia (15N) em Brachiaria brizantha cv. Marandu associada ao parcelamento de superfosfato simples e cloreto de potássio

Em pastagens, a avaliação da eficiência do processo de fertilização com N-uréia é importante em virtude das altas doses utilizadas. Vários trabalhos relatam que a aplicação de uréia associada com cloreto de potássio (KCl) e superfosfato simples (SFS) pode melhorar a sua eficiência. Na recuperação de pastagens degradadas ou em sistemas de exploração intensiva, as quantidades de KCl e SFS empregadas como fertilização corretiva são altas e aplicadas em novembro, no início da estação das águas. O parcelamento do KCl e SFS associado às coberturas nitrogenadas com uréia seria de fácil adoção sem custos adicionais. Com o objetivo de avaliar este manejo, foi desenvolvido um experimento em que se realizou o balanço anual da aplicação de 15N da uréia quando o SFS e, ou, o KCl foram parcelados, associados à aplicação da uréia em cinco coberturas, ou quando ambos foram aplicados de uma só vez, no mês de novembro. A maior produção de forragem ocorreu quando o SFS foi parcelado, seguido pelo parcelamento do KCl, da aplicação única de ambos e, finalmente, do parcelamento dos dois. A recuperação do N-uréia na parte aérea e no sistema solo-pastagem não diferiu com os tratamentos. Entretanto, a recuperação na coroa da planta e no sistema radicular diferiu entre os tratamentos e mostrou-se positivamente correlacionada com a produção de forragem. A recuperação de fertilizante na liteira foi favorecida pelo parcelamento do KCl. Apesar de não ter sido verificado aumento na recuperação total do sistema entre os tratamentos, o parcelamento do KCl e do SFS tem sido indicado por melhorar a recuperação do N-uréia em várias estruturas da planta, refletindo em maior produção da forrageira.

Recuperação do nitrogênio (15N) da uréia e da palhada por soqueira de cana-de-açúcar (Saccharum spp.)

Desenvolveu-se um experimento com vistas em avaliar a utilização do nitrogênio mineralizado da palhada (15N) e do nitrogênio da uréia (15N) aplicada em soqueira de cana-de-açúcar. O experimento foi desenvolvido em campo, num Argissolo Vermelho-Amarelo (Paleudalf), no município de Piracicaba (SP), de outubro de 1997 a agosto de 1998, e constou de quatro tratamentos: (T1) mistura de vinhaça e uréia aplicada em área total sobre o solo coberto com palhada-15N; (T2) mistura de vinhaça e uréia-15N aplicada em área total sobre o solo coberto com palhada; (T3) mistura de vinhaça e uréia-15N aplicada em área total sobre o solo sem a palhada; (T4) uréia-15N enterrada em sulcos nos dois lados das linhas da cana, com prévia aplicação de vinhaça sobre o solo sem cobertura de palhada. O delineamento experimental foi o de blocos casualizados, com quatro repetições. Comparações de componentes de produtividade da cultura, da acumulação de nitrogênio pela parte aérea e da utilização do nitrogênio da uréia-15N e do mineralizado da palhada-15N, foram realizadas entre os tratamentos. O desenvolvimento vegetal deu-se em um ciclo de 315 dias e foi semelhante nas condições com ou sem palhada de cana-de-açúcar. Do nitrogênio total acumulado na parte aérea da soqueira de cana-de-açúcar, 10 a 16 % foi absorvido do fertilizante e, em média, 4 % do N mineralizado da palhada. A eficiência de utilização do nitrogênio da uréia pela soqueira de cana-de-açúcar foi em média de 17 %, não havendo diferenças entre os tratamentos, e o da palhada foi em média de 8 %. O nitrogênio da palhada foi disponibilizado para a planta no final do ciclo da cultura.

Feasibility of in vivo 15N MRS detection of hyperpolarized 15N labeled choline in rats.

The increase of total choline in tumors has become an important biomarker in cancer diagnosis. Choline and choline metabolites can be measured in vivo and in vitro using multinuclear MRS. Recent in vivo(13)C MRS studies using labeled substrates enhanced via dynamic nuclear polarization demonstrated the tremendous potential of hyperpolarization for real-time metabolic studies. The present study demonstrates the feasibility of detecting hyperpolarized (15)N labeled choline in vivo in a rat head at 9.4 T. We furthermore report the in vitro (172 +/- 16 s) and in vivo (126 +/- 15 s) longitudinal relaxation times. We conclude that with appropriate infusion protocols it is feasible to detect hyperpolarized (15)N labeled choline in live animals.