994 resultados para signalisation cellulaire
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Lubiquitin-fold modifier (UFM1) fait partie de la classe 1 de la famille de protine ubiquitin-like (Ubl). UFM1 et Ub ont trs peu dhomologie de squence, mais partagent des similarits remarquables au niveau de leur structure tertiaire. Tout comme lUb et la majorit des autres Ubls, UFM1 se lie de faon covalente ses substrats par lintermdiaire dune cascade enzymatique. Il est de plus en plus frquemment rapport que les protines Ubls sont impliques dans des maladies humaines. Le gne Ufm1 est surexprim chez des souris de type MCP dveloppant une ischmie myocardique et dans les lots de Langerhans de patients atteints du diabte de type 2. UFM1 et ses enzymes spcifiques, UBA5, UFL1 et UFC1, sont conservs chez les mtazoaires et les plantes suggrant un rle important pour les organismes multicellulaires. Le Caenorhabditis elegans est le modle animal le plus simple utilis en biologie. Sa morphologie, ses phnotypes visibles et ses lignes cellulaires ont t dcrits de faon dtaille. De plus, son cycle de vie court permet de rapidement observer les effets de certains gnes sur la longvit. Ce modle nous permet de facilement manipuler lexpression du gne Ufm1 et de mieux connatre ses fonctions. En diminuant lexpression du gne ufm-1 chez le C.elegans, par la technique de lARN interfrence par alimentation, nous navons observ aucun problme morphologique grave. Les vers ressemblaient aux vers sauvages et possdaient un nombre de progniture normal. Cependant, les vers sauvage exposs lARNi dufm-1 vivent significativement moins longtemps que les contrles et ce, de faon indpendante de la voie de signalisation de linsuline/IGF. Chez le C. elegans la longvit et la rsistance au stress cellulaire sont intimement lies. Nous navons remarqu aucun effet dufm-1 sur le stress thermal, osmotique ou oxydatif, mais il est requis pour la protection contre le stress prototoxique. Il est galement ncessaire au maintien de lintgrit neuronale au cours du vieillissement des animaux. Lensemble de nos donnes nous renseigne sur les fonctions putatives du gne Ufm1.
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Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rle crucial dans lorganisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus rcemment, le rle des centrosomes dans la rgulation de lentre en mitose a t mis en vidence. Les centrosomes semblent galement contribuer lactivation du point de contrle en G2/M en rponse aux lsions de lADN en servant de point de rencontre pour les rgulateurs du cycle cellulaire et les gnes de rponse aux dommages lADN. Lamplification du nombre de centrosomes est une caractristique des cellules tumorales mais de faon intressante, elle constitue aussi une rponse des cellules aux dommages lADN. Les mcanismes qui rgulent lhomostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rle des centrosomes dans la rgulation du point de contrle en G2/M en rponse aux dommages lADN, le recrutement et/ou lactivation au niveau des centrosomes des kinases impliques dans les voies de signalisation de ce point de contrle ont t tudis par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos rsultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En rponse lactivation du point de contrle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqus dans la rgulation de ce point de contrle, une analyse comparative des protomes de centrosomes purifis a galement t ralise par spectromtrie de masse. Pour tudier plus particulirement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons dvelopper des outils molculaires qui serviront dterminer le rle de la sous population de CHK2 localise aux centrosomes 1) dans la rgulation de lentre en mitose au cours dun cycle normal 2) dans lactivation et la stabilit du point de contrle en G2/M en rponse aux lsions lADN et 3) dans lhomostasie et la dynamiques des centrosomes en rponse aux dommages lADN. Cette tude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la rponse cellulaire au stress gnotoxiques anti-cancereux et de rvler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2.
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Le diabte auto-immun rsulte de la destruction des cellules bta pancratiques scrtrices dinsuline par les lymphocytes T du systme immunitaire. Il sensuit une dficience hormonale qui peut tre comble par des injections quotidiennes dinsuline dorigine exogne, toutefois il demeure ce jour impossible de gurir les patients atteints de la maladie. De faon gnrale, un systme immunitaire sain reconnat une multitude dantignes diffrents et assure ainsi notre dfense lgard de diffrents pathognes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons gntiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent sactiver de faon aberrante suite la reconnaissance dantignes provenant du soi. Cest ce bris de tolrance qui mne au dveloppement de pathologies auto-immunes telles que le diabte auto-immun. Afin de limiter lauto-immunit, des mcanismes de slection stricts permettent dliminer la majorit des lymphocytes T prsentant une forte affinit envers des antignes du soi lors de leur dveloppement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes russissent toutefois chapper lapoptose et migrent en priphrie afin dy circuler en qute dun antigne spcifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mcanismes priphriques assurent le maintien de la tolrance immunitaire en faisant obstacle lactivation et la prolifration des lymphocytes T auto-ractifs. Lune des avenues afin dinhiber le dveloppement de rponses immunitaires aberrantes est la gnration de lymphocytes T rgulateurs. Ces cellules, dorigine thymique ou priphrique, peuvent arborer diffrents phnotypes et agissent via de multiples mcanismes afin dinactiver et/ou liminer les cellules impliques dans lapparition de pathologies auto-immunes. Lutilisation de modles murins transgniques a permis la mise en vidence dune population peu caractrise de lymphocytes T au potentiel rgulateur. En effet, la proportion de ces cellules T nexprimant pas les corcepteurs CD4 et CD8 (double ngatives, DN) a t inversement corrle la prdisposition lauto-immunit chez ces ii souris. Lobjectif principal de cette thse est de dmontrer la fonction immuno-rgulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs gntiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observ que les lymphocytes T DN exercent une activit cytotoxique lgard des lymphocytes B de faon spcifique lantigne, via la libration de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons tabli quun unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin dinhiber le dveloppement du diabte auto-immun chez des htes transgniques prdisposs la maladie. Le recours des souris dficientes pour lexpression du gne CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prdisposition au diabte auto-immun Idd13, qui contient le gne Sirp, a t identifi pour son rle dans la rgulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse gntique a rvl que dautres intervalles gntiques sont impliqus dans le contrle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situ en rgion proximale du chromosome 12 a t valid grce la cration de souris congniques. Grce aux rsultats prsents dans cette thse, notre comprhension de la biologie ainsi que de la rgulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la cration de thrapies cellulaires novatrices permettant de prvenir et de gurir diverses pathologies auto-immunes.
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Candida albicans est une levure pathogne qui, ltat commensal, colonise les muqueuses de la cavit orale et du tractus gastro-intestinal. De nature opportuniste, C. albicans cause de nombreuses infections, allant des candidoses superficielles (muguet buccal, vulvo-vaginite) aux candidoses systmiques svres. C. albicans a la capacit de se dvelopper sous diverses morphologies, telles que les formes levures, pseudohyphes et hyphes. Des stimuli environnementaux mimant les conditions retrouves chez lhte (temprature de 37C, pH neutre, prsence de srum) induisent la transition levure--hyphe (i.e. morphogense ou filamentation). Cette transition morphologique contribue la pathognicit de C. albicans, du fait que des souches prsentant un dfaut de filamentation sont avirulentes. Non seulement la morphogense est un facteur de virulence, mais elle constituerait aussi une cible pour le dveloppement dantifongiques. En effet, il a dj t dmontr que linhibition de la transition levure--hyphe attnuait la virulence de C. albicans lors dinfections systmiques. Par ailleurs, des tudes ont dmontr que de nombreuses molcules pouvaient moduler la morphogense. Parmi ces molcules, certains acides gras, dont lacide linolique conjugu (CLA), inhibent la formation dhyphes. Ainsi, le CLA possderait des proprits thrapeutiques, du fait quil interfre avec un dterminant de pathognicit de C. albicans. Par contre, avant dvaluer son potentiel thrapeutique dans un contexte clinique, il est essentiel dtudier son mode daction. Ce projet vise caractriser lactivit anti-filamentation des acides gras et du CLA et dterminer le mcanisme par lequel ces molcules inhibent la morphogense chez C. albicans. Des analyses transcriptomiques globales ont t effectues afin dobtenir le profil transcriptionnel de la rponse de C. albicans au CLA. Lacide gras a entran une baisse des niveaux dexpression de gnes encodant des protines hyphes-spcifiques et des rgulateurs de morphogense, dont RAS1. Ce gne code pour la GTPase Ras1p, une protine membranaire de signalisation qui joue un rle important dans la transition levure--hyphe. Des analyses de PCR quantitatif ont confirm que le CLA inhibait linduction de RAS1. De plus, le CLA a non seulement caus une baisse des niveaux cellulaires de Ras1p, mais a aussi entran sa dlocalisation de la membrane plasmique. En affectant les niveaux et la localisation cellulaire de Ras1p, le CLA nuit lactivation de la voie de signalisation Ras1p-dpendante, inhibant ainsi la morphogense. Il est possible que le CLA altre la structure de la membrane plasmique et affecte indirectement la localisation membranaire de Ras1p. Ces travaux ont permis de mettre en vidence le mode daction du CLA. Le potentiel thrapeutique du CLA pourrait maintenant tre valu dans un contexte dinfection, permettant ainsi de vrifier quune telle approche constitue vritablement une stratgie pour le traitement des candidoses.
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Des tudes de liaison et dassociation gntiques ont permis didentifier certains des facteurs de risque gntiques aux maladies inflammatoires de lintestin (MII) dans la rgion chromosomique 3p21. Dans cette rgion, le polymorphisme nuclotidique simple (SNP) codant non-synonyme du gne MST1, rs3197999, encodant pour la mutation R689C, a t associ et rpliqu la fois la colite ulcreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC). Un autre SNP, corrl des SNP codants non-synonymes du gne MST1R, a galement t associ la MC. Afin de dterminer si dautres variantes des gnes MST1 et MST1R sont associs la CU, nous avons test pour association des SNP de ces gnes. Seul un proxy de R689C a montr un signal dassociation significatif aux MII, ce qui suggre que R689C est la variante causale aux MII dans le gne MST1. En cherchant dterminer si la rgion 3p21 contenait plusieurs signaux dassociation mutuellement indpendants, trois SNP ont t identifis comme possible facteurs de risque indpendants, et ont t gnotyps dans des cas de CU et de MC et des tmoins, puis nos rsultats dassociation ont t combins ceux provenant de trois autres cohortes indpendantes. Les trois SNP, R689C (MST1), rs6802890 et rs7629936 (CDHR4), sont associs aux MII, mais une tude dassociation conditionnelle suggre quil existe en fait deux signaux dassociation mutuellement indpendants dans la rgion 3p21. Le signal principal provient de R689C, une mutation de la protine MSP. Cette protine a un rle dans linflammation chez les macrophages murins, et la migration, la cicatrisation et la survie chez les cellules pithliales. Dans cette tude, le rle de la MSP a t investigu dans des modles de macrophages humains et de cellules pithliales de clon, et seule la phosphorylation dAKT, un acteur dans la voie de signalisation de la survie cellulaire, a t module par la MSP dans nos modles. Ce projet a donc permis dapporter des connaissances sur les facteurs de risques gntiques aux MII dans la rgion 3p21, en identifiant 2 signaux dassociation indpendants, et en nous informant sur le rle de MST1, duquel provient le signal dassociation principal, chez les cellules humaines.
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Rsum Langiogense est lun des processus les plus importants pour le maintien de lhomostasie de loxygne dans les tissus. Le facteur de croissance de lendothlium vasculaire, VEGF, joue un rle primordial dans la rponse angiognique. Ce facteur de croissance mne lactivation du rcepteur de type 2 du facteur de croissance de lendothlium vasculaire, VEGFR-2. Suite une activation du VEGFR-2, plusieurs cascades de signalisation sont actives dans les cellules endothliales. Afin dattnuer cette signalisation, le VEGFR-2 est multi-ubiquitin sur des rsidus lysine et de cette manire, il est amen aux voies de dgradation, principalement dans les lysosomes. Cette ubiquitination est induite par lassociation de lubiquitine ligase (E3) c-Cbl un rsidu tyrosine phosphoryl du domaine C-terminal du rcepteur. Dans cette tude, nous avons identifi la tyrosine 1319 comme tant ncessaire pour lassociation de c-Cbl au VEGFR-2 et son ubiquitination. Nos rsultats dmontrent aussi que dans des cellules endothliales aortiques bovines, BAEC, la surexpression du rcepteur mutant Y1319F ralentit la dgradation du VEGFR-2 et induit une activation plus forte et prolonge de la synthtase endothliale du monoxyde dazote (eNOS). Ces rsultats nous permettent de mieux comprendre le droulement de la rgulation de la signalisation du VEGFR-2 au niveau intracellulaire. Mots-cls: [Angiogense, VEGFR-2, VEGF, c-Cbl, Ubiquitination, Tyrosine 1319, Dgradation]
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Les rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifie des familles de protines localises la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux lintrieur des cellules. Dintenses recherches effectues au cours des trente dernires annes ont men lidentification de dizaines de protines interagissant avec les RCPGs et contrlant la signalisation, la dsensibilisation, linternalisation et la dgradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus rgulant lactivit des rcepteurs partir de la membrane plasmique, les mcanismes molculaires contrlant la biosynthse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu la surface cellulaire sont trs peu caractriss. Une meilleure comprhension de ces processus ncessite lidentification de la machinerie protique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protomique bas sur le transfert dnergie de rsonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure dinteractions protiques dans les cellules vivantes, a men lidentification de plusieurs nouvelles protines localises dans la voie de scrtion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protines tant localises dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthse, du repliement adquat et du transport la membrane plasmique des rcepteurs, il est trs probable quelles soient impliques dans le contrle de lexpression des RCPGs la surface cellulaire. La caractrisation de lhomologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intracteur des RCPGs identifi dans le crible, a dmontr que cette protine localise dans les compartiments prcoces de la voie de scrtion (RE et ERGIC) interagit de faon slective avec les RCPGs. De plus, la suppression de lexpression endogne de cette protine pralablement non-caractrise, diminue le transport la membrane plasmique dun rcepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement lexport des RCPGs du RE. Ceci est support par lobservation que la surexpression de CNIH4 de faibles niveaux favorise la maturation dun rcepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons galement pu dmontrer que CNIH4 est associe la protine Sec23, une des composantes de lenveloppe des vsicules COPII qui sont responsables du transport des protines du RE vers le Golgi, suggrant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des rcepteurs dans ces vsicules. La surexpression de CNIH4 de trs hauts niveaux provoque galement la rtention intracellulaire des rcepteurs. Cet effet dominant ngatif pourrait tre caus par la titration dun autre facteur dexport des RCPGs. Une deuxime tude a permis de rvler que la protine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intracteur des RCPGs galement identifi dans le crible, interagit slectivement avec les rcepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protine aux fonctions prcdemment inconnues, rtablit le transport normal dun rcepteur en prsence de CNIH4 surexprime. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacit de CNIH4 augmenter la maturation dun rcepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggrant que ces deux protines forment un complexe rgulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thse, de nouvelles protines interagissant avec les RCPGs et contrlant leur expression la membrane plasmique ont donc t identifies, permettant une meilleure comprhension des mcanismes rgulant le transport des rcepteurs du RE la surface cellulaire.
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Les polymorphonuclaires neutrophiles (PMNs) reprsentent une arme primordiale dans la dfense contre divers agents pathognes; notamment les bactries, les champignons, les cellules tumorales de mme que les cellules infectes par des virus. Cependant, certaines pathologies relies linflammation chronique soulvent limplication des neutrophiles notamment dans larthrite rhumatode. La rponse inflammatoire persistante gnre par lactivation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite la scrtion non contrle de leurs produits cytotoxiques. Mme si lactivation chronique des neutrophiles est nfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait savrer un bon outil en cas de neutropnie, comme cest souvent le cas les patients ayant reu des traitements de chimiothrapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mcanisme daction impliqu dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isols par Lagraoui (1999), le milieu conditionn concentr (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% 9.5 vs 68% 2.5, p<0.01). Suivant le squenage du MCC paralllement au facteur semi-pur actif, deux protines ont t identifies la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : lalbumine et la ftuine. Notre projet vise donc comparer les effets de lalbumine et de la ftuine ceux du GM-CSF dans loptique dune thrapie alternative au GM-CSF en tant quadjuvant de chimiothrapie. La prsence dalbumine, de ftuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubs 24 heures avec la Mutamycin induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport la Mutamycin (Ctrl : 43% 10; A : 74% 3; F : (82% 6 et GM : 74% 7; p<0.01). Leffet de lalbumine dpend de la voie de la kinase PI3 mais galement celle la kinase ERK, alors que celle de la ftuine dpend de la kinase PI3. Similairement lEPO, lalbumine et la ftuine supporte la diffrentiation des HSCs en prcurseurs rythrocytaires de type BFU-E. Dans un modle murin de chiomioprotection, lalbumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrle des leukocytes de la rate (66 8 x106c/ml vs 81 16 x106c/ml) et du sang (3.6 0.4 x106c/ml vs 5.7 2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, lalbumine et la ftuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalit et mcansimes daction. Cependant, vu leur manque de spcificit, lapplication thrapeutique en tant quadjuvant de chiomiothrapie de lalbumine et la ftuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dgnratives et les vnements ischmiques pourraient savrer de bonnes cibles thrapeutiques, principalement pour lalbumine.
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La voie de la polarit planaire cellulaire (PCP), aussi connue sous le nom de la voie non-canonique du Frizzled/Dishevelled, contrle le processus morphogntique de l'extension convergente (CE) qui est essentiel pour la gastrulation et la formation du tube neural pendant l'embryogense. La signalisation du PCP a t rcemment associe avec des anomalies du tube neural (ATN) dans des modles animaux et chez l'humain. Prickle1 est une protine centrale de la voie PCP, exprime dans la ligne primitive et le msoderme pendant l'embryogense de la souris. La perte ou le gain de fonction de Prickle1 mne des mouvements de CE fautifs chez le poisson zbre et la grenouille. PRICKLE1 interagit directement avec deux autres membres de la voie PCP, Dishevelled et Strabismus/Vang. Dans notre tude, nous avons investigu le rle de PRICKLE1 dans l'tiologie des ATN dans une cohorte de 810 patients par le re-squenage de son cadre de lecture et des jonctions exon-intron. Le potentiel pathognique des mutations ainsi identifies a t valu par des mthodes bioinformatiques, suivi par une validation fonctionnelle in vivo dans un systme poisson zbre. Nous avons identifi dans notre cohorte un total de 9 nouvelles mutations dont sept: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys et p.Ser739Phe, p.Val550Met et p.Asp771Asn qui affectent des acides amins conservs. Ces mutations ont t prdites in silico daffecter la fonction de la protine et sont absentes dans une large cohorte de contrles de mme origine ethnique. La co-injection de ces variantes avec le gne prickle1a de type sauvage chez lembryon de poisson zbre a dmontr quune mutation, p.Arg682Cys, modifie dans un sens ngatif le phnotype du dfaut de la CE produit par pk1 de type sauvage. Notre tude dmontre que PK1 peut agir comme facteur prdisposant pour les ATN chez lhumain et largit encore plus nos connaissances sur le rle des gnes de la PCP dans la pathogense de ces malformations.
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La rgulation de lapoptose est importante dans le maintient de lhomostasie cellulaire et lintgrit du matriel gntique. Lapoptose est un mcanisme cellulaire qui limine les cellules endommages. Le bon fonctionnement de cette voie biologique est crucial pour contrer la propagation des cellules avec leurs anomalies gntiques. La drgulation des gnes codants pour des composantes de la voie intrinsque de lapoptose est frquemment observe chez divers types de cancers, incluant la leucmie. Nous proposons que des polymorphismes fonctionnels localiss dans la rgion rgulatrice (rSNP) des gnes impliqus dans la voie dapoptose intrinsque auraient un impact significatif dans loncogense en modifiant le taux dexpression de ces gnes. Dans cette tude, nous avons valid, laide dune combinaison dapproches in silico et in vitro, limpact fonctionnel de la variabilit gntique sous la forme dhaplotypes (rHAPs), au niveau du promoteur proximal, de 11 gnes codant pour des composantes de la voie intrinsque de lapoptose. Pour ce faire, nous avons sous-clon les rHAPs majeurs dans un vecteur contenant le gne rapporteur lucifrase (pGL3b). Ces constructions furent utilises dans des essais de transfections transitoires dans 3 lignes cellulaires (Hela, Jeg3 et Jurkat). Nous avons observ quau moins 2 rHAPs influencent significativement lactivit transcriptionelle de faon allle spcifique. Ces rHAPs sont associs aux gnes YWHAB et YWHAQ. Les analyses de retard sur gel dlectrophorse (EMSA) ont permis didentifier 2 sites de liaison ADN-protine diffrentielles dans les rHAPs du gne YWHAB. La variabilit du niveau dexpression des gnes tudis pourrait contribuer la susceptibilit interindividuelle de dvelopper un cancer, tel que la leucmie de lenfant.
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Doctorat ralis en cotutelle avec le laboratoire de Franois Payre au Centre de Biologie du Dveloppement Toulouse, France (Universit de Toulouse III - Paul Sabatier)
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La progression dun individu au travers dun environnement diversifi dpend des informations visuelles qui lui permettent dvaluer la taille, la forme ou mme la distance et le temps de contact avec les obstacles dans son chemin. Il peut ainsi planifier en avance les modifications ncessaires de son patron locomoteur afin dviter ou enjamber ces entraves. Ce concept est aussi applicable lorsque le sujet doit atteindre une cible, comme un prdateur tentant dattraper sa proie en pleine course. Les structures neurales impliques dans la gense des modifications volontaires de mouvements locomoteurs ont t largement tudies, mais relativement peu dinformation est prsentement disponible sur les processus intgrant linformation visuelle afin de planifier ces mouvements. De nombreux travaux chez le primate suggrent que le cortex parital postrieur (CPP) semble jouer un rle important dans la prparation et lexcution de mouvements datteinte visuellement guids. Dans cette thse, nous avons investigu la proposition que le CPP participe similairement dans la planification et le contrle de la locomotion sous guidage visuel chez le chat. Dans notre premire tude, nous avons examin ltendue des connexions cortico-corticales entre le CPP et les aires motrices plus frontales, particulirement le cortex moteur, laide dinjections de traceurs fluorescents rtrogrades. Nous avons cartographi la surface du cortex moteur de chats anesthsis afin didentifier les reprsentations somatotopiques distales et proximales du membre antrieur dans la partie rostrale du cortex moteur, la reprsentation du membre antrieur situe dans la partie caudale de laire motrice, et enfin la reprsentation du membre postrieur. Linjection de diffrents traceurs rtrogrades dans deux rgions motrices slectionnes par chat nous a permis de visualiser la densit des projections divergentes et convergentes paritales, diriges vers ces sites moteurs. Notre analyse a rvl une organisation topographique distincte de connexions du CPP avec toutes les rgions motrices identifies. En particulier, nous avons not que la reprsentation caudale du membre antrieur reoit majoritairement des projections du ct rostral du sillon parital, tandis que la partie caudale du CPP projette fortement vers la reprsentation rostrale du membre antrieur. Cette dernire observation est particulirement intressante, parce que le ct caudal du sillon parital reoit de nombreux inputs visuels et sa cible principale, la rgion motrice rostrale, est bien connue pour tre implique dans les fonctions motrices volontaires. Ainsi, cette tude anatomique suggre que le CPP, au travers de connexions tendues avec les diffrentes rgions somatotopiques du cortex moteur, pourrait participer llaboration dun substrat neural idal pour des processus tels que la coordination inter-membre, intra-membre et aussi la modulation de mouvements volontaires sous guidage visuel. Notre deuxime tude a test lhypothse que le CPP participe dans la modulation et la planification de la locomotion visuellement guide chez le chat. En nous rfrant la cartographie corticale obtenue dans nos travaux anatomiques, nous avons enregistr lactivit de neurones paritaux, situs dans les portions des aires 5a et 5b qui ont de fortes connexions avec les rgions motrices impliques dans les mouvements de la patte antrieure. Ces enregistrements ont t effectus pendant une tche de locomotion qui requiert lenjambement dobstacles de diffrentes tailles. En dissociant la vitesse des obstacles de celle du tapis sur lequel le chat marche, notre protocole exprimental nous a aussi permit de mettre plus demphase sur limportance de linformation visuelle et de la sparer de linflux proprioceptif gnr pendant la locomotion. Nos enregistrements ont rvl deux groupes de cellules paritales actives en relation avec lenjambement de lobstacle: une population, principalement situe dans laire 5a, qui dcharge seulement pendant le passage du membre au dessus delentrave (cellules spcifiques au mouvement) et une autre, surtout localise dans laire 5b, qui est active au moins un cycle de marche avant lenjambement (cellules anticipatrices). De plus, nous avons observ que lactivit de ces groupes neuronaux, particulirement les cellules anticipatrices, tait amplifie lorsque la vitesse des obstacles tait dissocie de celle du tapis roulant, dmontrant limportance grandissante de la vision lorsque la tche devient plus difficile. Enfin, un grand nombre des cellules actives spcifiquement pendant lenjambement dmontraient une corrlation soutenue de leur activit avec le membre controlatral, mme sil ne menait pas dans le mouvement (cellules unilatrales). Inversement, nous avons not que la majorit des cellules anticipatrices avaient plutt tendance maintenir leur dcharge en phase avec lactivit musculaire du premier membre enjamber lobstacle, indpendamment de sa position par rapport au site denregistrement (cellules bilatrales). Nous suggrons que cette disparit additionnelle dmontre une fonction diversifie de lactivit du CPP. Par exemple, les cellules unilatrales pourraient moduler le mouvement du membre controlatral au-dessus de lobstacle, quil mne ou suive dans lordre denjambement, tandis que les neurones bilatraux sembleraient plutt spcifier le type de mouvement volontaire requis pour viter lentrave. Ensembles, nos observations indiquent que le CPP a le potentiel de moduler lactivit des centres moteurs au travers de rseaux corticaux tendus et contribue diffrents aspects de la locomotion sous guidage visuel, notamment linitiation et lajustement de mouvements volontaires des membres antrieurs, mais aussi la planification de ces actions afin dadapter la progression de lindividu au travers dun environnement complexe.
Resumo:
L'axe hypothalamo-hypophyso-surrnalien (HPA) permet de maintenir l'homostasie de l'organisme face divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthse et la libration de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires peroivent ce signal et en raction, produisent et scrtent l'ACTH. Ceci induit la synthse des glucocorticodes (Gc) par le cortex surrnalien; ces strodes mettent le systme mtabolique en tat dalerte pour la rponse au stress et lagression. Les Gc ont le rle essentiel de contrler les dfenses de l'organisme, en plus d'exercer une rtro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un prcurseur: la pro-opiomlanocortine (POMC). cause de sa position critique dans la normalisation de l'homostasie, le contrle transcriptionnel du gne Pomc a fait l'objet d'tudes approfondies au cours des dernires dcennies. Nous savons maintenant que la rgion promotrice du gne Pomc permet une expression cible dans les cellules POMC hypophysaires. L'tude du locus Pomc par des technologies gnomiques m'a permis de dcouvrir un nouvel lment de rgulation qui est conserv travers l'volution des mammifres. La caractrisation de cet enhancer a dmontr qu'il dirige une expression restreinte l'hypophyse, et plus particulirement dans les cellules corticotropes. De faon intressante, l'activit de cet lment dpend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimre du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est galement limite aux cellules POMC de l'hypophyse. La dcouverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension la rgulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la raction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse gnomique des sites lis ii par ces deux facteurs nous a rvl une interrelation complexe et a permis de dfinir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec lADN au niveau des squences rgulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des rsultats transcriptionnels diffrents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protine:protine (tethering) sur Stat3 tant li l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une rponse inne de dfense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mcanisme de dfense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux prsents dans cette thse dfinissent les mcanismes transcriptionnels engags dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulirement, ces mcanismes ont t dcrits au niveau de la rponse globale des corticotropes et du gne Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adquatement ces mcanismes afin de faire face aux stress et d'viter des drglements comme les maladies inflammatoires et mtaboliques.
Resumo:
Les mlanomes malins (MM) constituent le deuxime type de cancer le plus frquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi quun des rares cancers dont lincidence augmente annuellement. moins que les MM ne soient exciss temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est trs rfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que lexposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits gnotoxiques, est une dterminante majeure dans lacquisition de MM. cet effet, la rparation par excision de nuclotides (NER) est la ligne de dfense principale contre le dveloppement des mlanomes puisquelle est la voie de rparation prpondrante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgr cela, la contribution potentielle de dfauts de la NER au dveloppement des MM dans la population normale nest toujours pas bien tablie. Notre laboratoire a prcdemment dvelopp une mthode base sur la cytomtrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette mthode a dj mise en vidence quune dficience de lactivit de la protine ATR peut mener une dficience de la NER exclusive la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons dmontr que plusieurs lignes cellulaires cancreuses modles comportent une dficience en NER en phase S, suggrant quune telle dficience puisse caractriser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une dficience en NER en phase S pouvait tre associe une proportion significative de mlanomes et si le tout pouvait tre attribuable une diminution de lactivit dATR. Nos objectifs ont donc t de : (i) mesurer lefficacit de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mlanocytes primaires, (ii) vrifier si le niveau dactivit dATR corrle avec lefficacit de la NER en phase S dans les lignes de MM et (iii) voir si un gne frquemment mut dans les mlanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait cooprer avec ATR pour rguler la NER en phase S dans les mlanomes. Nous avons dmontr que 13 lignes de MM sur 16 ont une capacit grandement diminue rparer les photoproduits induits par UV spcifiquement en phase S. De plus, cette dficience corrle fortement avec une rduction de lactivation dATR et, dans plusieurs lignes de MM, avec une phosphorylation dAkt plus importante. Lutilisation dARN interfrent ou dun inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus daugmenter la phosphorylation dAkt, de rduire la rparation des photoproduits et lactivation dATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) lexpression ectopique de la protine PTEN sauvage dans des lignes dficientes en PTEN (mais pas dune protine PTEN sans activit phosphatase) ou (ii) linhibition pharmacologique dAkt a permis daugmenter la rparation en phase S ainsi que lactivation dATR. En somme, cette tude dmontre quune signalisation dATR dpendante de PTEN/Akt amenant une rparation dficiente des photoproduits gnomiques causs par les UV en phase S peut tre dterminante dans le dveloppement des mlanomes induits par UV.
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Une drgulation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 est observe dans plus de 30% des cancers et des mutations activatrices de RAS sont observes dans 30% 50% des adnomes colorectaux. la suite dune analyse extensive de biopsies de tumeurs colorectales humaines par micromatrices tissulaires (TMA), nous avons observ que 44% des tissus cancreux exprimaient MEK1/2 phosphoryls, contre 10% des tissus normaux. L'analyse des TMA a galement rvl que 79% des tumeurs arboraient un marquage nuclaire de MEK1/2 phosphoryls, contre 4 % pour les tissus normaux. Bien que la voie MEK/ERK1/2 soit frquemment active dans les cancers, le rle prcis des isoformes de MEK1 et de MEK2 n'a jamais t clairement tablie. De mme, l'impact de cette localisation nuclaire aberrante de phospho-MEK1/2, dans l'initiation et la progression des cancers colorectaux, est inconnu. Lors d'un premier projet, nous avons dmontr, que lexpression de MEK1 ou MEK2 activ est suffisante pour transformer in vitro des cellules intestinales pithliales de rat (IEC-6). L'expression des mutants actifs de MEK1 ou MEK2 est suffisante pour induire une drgulation de la prolifration cellulaire et engendrer la formation d'adnocarcinomes invasifs dans un modle de greffe orthotopique du clon chez la souris. Nous avons galement dmontr que l'inhibition de MEK2 par shRNA supprime compltement la prolifration des lignes humaines de cancer du clon, alors que la suppression de MEK1 a peu d'effet sur la capacit de prolifration. Le deuxime projet, nous a permis d'observer que l'expression d'un mutant nuclaire de MEK1 dans les cellules IEC-6 transforme drastiquement les cellules. Une augmentation de prolifration, une rsistance l'anoikose, un drglement du cycle cellulaire, de l'instabilit chromosomique (CIN), de la ttra/aneuplodie sont observs. La caractrisation des mcanismes responsables de cette localisation aberrante de MEK1/2 phosphoryls, a permis d'identifier la protine Sef, un rgulateur de la localisation cytoplasmique de MEK/ERK1/2. Nous avons dmontr que l'expression d'une forme oncognique de Ras (H-RasV12) inhibe l'expression de Sef, engendrant alors une accumulation nuclaire de MEK1/2 activs. Plus encore, la rexpression de Sef restaure la localisation cytoplasmique de MEK1/2 et renverse les proprits tumorigniques ainsi que l'aneuplodie induite par Ras activ. Un troisime projet, visant la caractrisation des mcanismes associs la CIN et l'aneuplode engendrs par l'activation aberrante de la voie de Ras-ERK1/2, a permis d'observer que l'hyperactivation de ERK1/2 induit des anomalies mitotiques menant la binuclation. Une localisation errone et une surexpression de la kinase Aurora A, de mme que des protines de passage du complexe chromosomique (CPC), Aurora B, Survivine et INCENP, sont observes. L'inhibition partielle de l'activation de ERK1/2 par de faible dose de PD184352, un inhibiteur de MEK1/2, est suffisante pour renverser la surexpression de ces rgulateurs mitotiques, de mme que corriger les anomalies de la mitose et rduire la ttra/aneuplodie engendre par Ras oncognique. Ainsi, nous avons dmontr, pour la premire fois, que la voie des MAP kinases ERK1/2 est implique dans la CIN, la ttraplodie et l'aneuplodie. Nos rsultats suggrent que la perte de Sef est un vnement oncognique prcoce, qui contribue la localisation nuclaire aberrante de MEK1/2 qui est observe dans les tumeurs colorectales. Cette localisation anormale de MEK1/2 est associe l'initiation de la transformation, la progression tumorale et la CIN, via l'activit soutenue de ERK1/2. Ces informations sont capitales et dmontrent limportance de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 dans le processus de tumorignse colorectale.
