Estirpes de Bacillus thuringiensis efetivas contra insetos das ordens Lepidoptera, Coleoptera e Diptera

O objetivo deste trabalho foi selecionar entre 300 estirpes de Bacillus thuringiensis as efetivas simultaneamente contra larvas de Spodoptera frugiperda J.E. Smith e Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae), Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), Aedes aegypti Linnaeus e Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae). Foram selecionadas duas estirpes de B. thuringiensis, denominadas S234 e S997, que apresentaram atividade contra as três ordens de insetos. As estirpes foram caracterizadas por métodos morfológicos, bioquímicos e moleculares. As mesmas apresentaram duas proteínas principais de 130 e 65 kDa, produtos de reação em cadeia da polimerase de tamanho esperado para a detecção dos genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B e cry2 e cristais bipiramidais, cubóides e esféricos.

Fatores de risco na transmissão do lentivírus caprino pelo sêmen

O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença do DNA pró-viral do lentivírus caprino (LVC) em ejaculados de machos infectados naturalmente, e verificar a influência da lavagem do sêmen e da presença de inflamação testicular sobre a carga viral. Foram realizadas oito coletas de sêmen de sete reprodutores soropositivos para o LVC: quatro antes dos animais sofrerem dano testicular e quatro depois. Entre as coletas realizadas na mesma semana, em uma, o ejaculado era lavado, para retirada do plasma seminal, e na outra, não. O DNA pró-viral do LVC foi identificado pela reação em cadeia da polimerase Nested (PCR Nested), e pelo isolamento viral. O vírus foi isolado em 7,1% das amostras. A PCR identificou o DNA pró-viral em 35,7% do total das amostras: 17,9% nas amostras lavadas e 53,6% das amostras de sêmen integrais. O dano ao testículo permite maior fluxo do vírus para o sêmen, pois antes do dano, 21,4% das amostras foram positivas e pós-dano, 50%. A transmissão do LVC pelo sêmen de reprodutores caprinos é potencializada pela presença de inflamações testiculares e pelo fato de o sêmen criopreservado conter o LVC na forma infectante.

Polimorfismo da beta-lactoglobulina não afeta as características físico-químicas e a estabilidade do leite bovino

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do polimorfismo genético da beta-lactoglobulina, da raça e da sazonalidade sobre as características físico-químicas e estabilidade do leite bovino. Foram selecionados 5 rebanhos da raça Holandesa e 6 da Girolando. Amostras de leite e sangue foram coletadas de 660 vacas Holandesas e 293 Girolandos, num total de 953 amostras, obtidas em duas coletas na estação seca e duas na estação chuvosa. As amostras de leite foram submetidas à análise de acidez titulável, pH, crioscopia, e ao teste de estabilidade ao etanol (70, 76, 80 e 84ºGL). As amostras de sangue foram submetidas à reação em cadeia de polimerase, para determinação do polimorfismo da beta-lactoglobulina em ambas as raças estudadas. Não houve efeito do polimorfismo da beta-lactoglobulina sobre as características físico-químicas do leite. Observou-se efeito de raça (Holandesa e Girolando, respectivamente) sobre a acidez titulável (16,16 e 17,07°D), e da sazonalidade (estações chuvosa e seca, respectivamente) sobre a crioscopia (-0,5411 e -0,5376°H). Nas condições do estudo, observou-se efeito de raça e sazonalidade sobre a estabilidade do leite, com maior instabilidade do leite de Girolando, durante a estação seca. Não houve efeito do polimorfismo da beta-lactoglobulina sobre essa característica.

Caracterização de rizóbios indicados para produção de inoculantes por meio de sequenciamento parcial do 16S rRNA

O objetivo deste trabalho foi confrontar as sequências parciais do gene 16S rRNA de estirpes padrão de rizóbios com as de estirpes recomendadas para a produção de inoculantes no Brasil, com vistas à verificação da confiabilidade do sequenciamento parcial desse gene para a identificação rápida de estirpes. Foram realizados sequenciamentos através de reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores relativos à região codificadora do gene 16S rRNA entre as bactérias estudadas. Os resultados foram analisados pela consulta de similaridade de nucleotídeos aos do "Basic Local Alignment Search Tool" (Blastn) e por meio da interpretação de árvores filogenéticas geradas usando ferramentas de bioinformática. A classificação taxonômica das estirpes Semia recomendadas para inoculação de leguminosas com base em propriedades morfológicas e especificidade hospedeira não foi confirmada em todas as estirpes. A maioria das estirpes estudadas, consultadas no Blastn, é consistente com a classificação proposta pela construção de árvores filogenéticas das sequências destas estirpes, com base na similaridade pelo sequenciamento parcial do gene considerado.

Variabilidade genética de Sugarcane mosaic virus, causando mosaico em milho no Brasil

O objetivo deste trabalho foi caracterizar biológica e molecularmente três isolados de Sugarcane mosaic virus (SCMV) de lavouras de milho, analisá-los filogeneticamente e discriminar polimorfismos do genoma. Plantas com sintomas de mosaico e nanismo foram coletadas em lavouras de milho, no Estado de São Paulo e no Município de Rio Verde, GO, e seus extratos foliares foram inoculados em plantas indicadoras e submetidos à análise sorológica com antissoros contra o SCMV, contra o Maize dwarf mosaic virus (MDMV) e contra o Johnsongrass mosaic virus (JGMV). Mudas de sorgo 'Rio' e 'TX 2786' apresentaram sintomas de mosaico após a inoculação dos três isolados, e o DAS-ELISA confirmou a infecção pelo SCMV. O RNA total foi extraído e usado para amplificação por transcriptase reversa seguida de reação em cadeia de polimerase (RT-PCR). Fragmentos específicos foram amplificados, submetidos à análise por polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) e sequenciados. Foi possível discriminar os genótipos de SCMV isolados de milho de outros isolados brasileiros do vírus. Alinhamentos múltiplos e análises dos perfis filogenéticos corroboram esses dados e mostram diversidade nas sequências de nucleotídeos que codificam para a proteína capsidial, o que explica o agrupamento separado desses isolados e sugere sua classificação como estirpes distintas, em lugar de simples isolados geográficos.

Fluxo gênico em milho geneticamente modificado com resistência a insetos

O objetivo deste trabalho foi estimar o fluxo gênico em milho transgênico com resistência a insetos, em lavouras comerciais. Amostras de grãos foram coletadas em lavouras com milho convencional e transgênico, nos municípios de: Itumirim, Uberlândia, Paracatu e Tupaciguara, MG; Itapetininga e Pedrinhas, SP; e Assaí e Ponta Grossa, PR. As amostras foram coletadas em lavouras de milho convencional, a partir de 5 m de distância da fonte com o milho transgênico. Foram coletadas dez espigas de plantas individuais por ponto, em quatro repetições, no total de 40 espigas para cada distância amostrada. As análises de fluxo gênico foram realizadas por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Em média, 82% da fecundação cruzada ocorreu nos primeiros 30 m. Em Itapetininga, SP, foram observadas as maiores taxas de fecundação cruzada - acima de 10% até a distância de 50 m -, porém, inferiores a 1% na distância de 100 m. O isolamento de 20 m, com dez linhas de bordadura, não é suficiente para garantir taxas de fecundação cruzada inferiores a 1%.

Utilização de marcador molecular SCAR na identificação de Fusarium subglutinans, agente causal da malformação da mangueira

O gênero Fusarium é responsável por doenças em diversas plantas economicamente importantes. Entre estas doenças, destaca-se a malformação da mangueira, causada pelo fungo Fusarium subglutinans. O objetivo deste trabalho foi desenvolver oligonucleotídeos iniciadores para reação em cadeia da polimerase (PCR), específicos para o fungo F. subglutinans da mangueira. A amplificação de DNA de oito Fusarium spp. de diferentes hospedeiros, usando o oligonucleotídeo randômico UBC-41 (TTAACCGGGG), produziu um fragmento de aproximadamente 1.300 pb somente para o fungo da mangueira. Tendo em vista que padrões de bandeamento por RAPD não são considerados confiáveis devido à baixa reprodutibilidade dos resultados, o fragmento diferencial foi eluído do gel de agarose, purificado, clonado e seqüenciado. As seqüências nucleotídicas foram utilizadas para identificar e sintetizar quatro pares de oligonucleotídeos específicos, denominados Fs 5, Fs 13, Fs 14 e Fs 15. DNAs de Fusarium spp. de outros hospedeiros (alho, amendoim, cana-de-açúcar, ciclâmen, ervilha, melão e trigo), da planta de mangueira cv. Tommy Atkins sadia e de outros cinco isolados de F. subglutinans de mangueira sintomática, foram submetidos à amplificação com os pares de oligonucleotídeos. Fragmentos amplificados foram visualizados somente para F. subglutinans de mangueira, demonstrando assim a especificidade dos oligonucleotídeos SCAR desenhados.

Caracterização molecular dos alelos-S de incompatibilidade gametofítica em Prunus salicina Lindl.

Pomares comerciais de ameixeira-japonesa devem conter pelo menos duas cultivares para obter boa fertilização, devido à presença do sistema de incompatibilidade gametofítica, que inibe a autofecundação da grande maioria das cultivares. No presente trabalho, buscou-se identificar e caracterizar molecularmente os alelos-S de 11 cultivares de ameixeira-japonesa (Prunus salicina Lindl.) e verificar a compatibilidade entre os genótipos avaliados. As cultivares Santa Rosa, Santa Rita, Reubennel, Pluma 7, América, Rosa Mineira, Amarelinha, The First, Gulfblaze (Clone São Paulo), Gulfblaze (Clone Guaiba) e Harry Pickstone foram analisadas por meio de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com três pares de iniciadores específicos para alelos-S. As condições da PCR utilizadas, bem como as combinações de iniciadores, permitiram a identificação de alelos-S nas cultivares de P. salicina estudadas, bem como a indicação dos polinizadores mais compatíveis com algumas das principais cultivares utilizadas na produção de frutas. O sequenciamento de alguns dos alelos-S amplificados revelou elevada similaridade com sequências de nucleotídeos já identificados em outros trabalhos com Prunus spp.. Entretanto, a obtenção de sequências completas de maior número de alelos-S faz-se necessária para o estabelecimento de uma relação de identidade precisa entre os mesmos.

Padrão de integração de pAN7-1 em mutantes de Magnaporthe grisea com patogenicidade alterada em arroz

Ensaios foram conduzidos para verificar a presença, o número de cópias e de sítios de integração de pAN7-1 no genoma de mutantes de M. grisea I-22 com patogenicidade alterada em arroz. Foram analisados T41, T93, T251 (gerados por mutagênese REMI) e T108 (oriundo de mutagênese convencional), os quais exibiram diferentes fenótipos mutantes. O DNA total desses mutantes foi submetido à reação em cadeia de polimerase (PCR) e às análises de hibridização com o vetor (Southern blot). A presença de pAN7-1 no genoma de todos os mutantes foi confirmada por PCR. Segundo as análises de Southern blot, T41 exibiu duas integrações do vetor, ambas na forma de cópia única. No genoma de T93 também foram detectados dois sítios de inserção de pAN7-1, um dos quais envolvendo múltiplas cópias do vetor. Os resultados indicaram a presença de apenas uma cópia do vetor em um único sítio nos genomas de T108 e T251. O padrão de integração em T251 foi o único a sugerir a ocorrência de evento REMI. As diferenças quanto ao tamanho dos fragmentos com homologia a pAN7-1 refletiram a possível aleatoriedade dos eventos de integração no genoma de M. grisea. Os resultados evidenciaram o potencial de REMI para a mutagênese insercional de M. grisea, quando conduzida com pAN7-1 e HindIII

Avaliação da expressão do gene MGMT nos tecidos normal e neoplásico de doentes com câncer colorretal

OBJETIVO: Avaliar a expressão tecidual do gene de reparo MGMT comparando a mucosa cólica normal e neoplásica em doentes com câncer colorretal. MÉTODOS: Foram estudados 44 portadores de adenocarcinoma colorretal confirmado por estudo histopatológico. Foram excluídos doentes suspeitos de pertencerem a famílias com câncer colorretal hereditário (HNPCC e PAF) e os portadores de câncer do reto médio e inferior submetidos a tratamento quimioradioterápico neoadjuvante. A expressão do gene MGMT foi avaliada pela técnica da reação de polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR). A comparação dos resultados encontrados para expressão do gene MGMT entre tecidos normais e neoplásicos foi feita pelo teste t de Student pareado, adotando-se nível de significância de 5% (p <0,05). RESULTADOS: A expressão tecidual do gene MGMT em todos os doentes foi menor no tecido neoplásico quando comparada a do tecido normal (p=0,002). CONCLUSÃO: O gene de reparo MGMT encontra-se menos expresso no tecido neoplásico quando comparados aos tecidos normais em portadores de CCR esporádico.

Análise da diversidade da microbiota intestinal de ratos submetidos à ressecção da valva ileocecal e criação de esfíncter artificial

OBJETIVO: analisar através de biologia molecular a diversidade da microbiota da junção ileocecal antes e após a ressecção da válvula ileocecal e reconstrução do trânsito com e sem a criação de "neoesfíncter". MÉTODOS: Os animais foram distribuídos em dois grupos: Grupo A (n=7) com ressecção da válvula ileocecal e anastomose ileocólica término-terminal em plano único, e Grupo B (n=7) com ressecção da válvula ileocecal e anastomose ileocólica término-terminal em plano único e confecção do esfíncter artificial. Reoperados com 20 dias coletou-se novamente conteúdo intraluminar do íleo e do cólon. Das amostras coletadas, extraiu-se DNA para reação de PCR-DGGE. Os padrões de bandas eletroforéticas , gerados na reação, foram submetidos ao programa Bionumerics para análise da similaridade e da diversidade da microbiota. RESULTADOS: a diversidade da microbiota foi maior e em mais amostras do íleo do que as do cólon. O grupo com a válvula apresentou os maiores valores e variações no cólon de 2,11 a 2,93. Em três animais de cada grupo estabeleceu-se comparação da similaridade e não se assemelharam ao controle. CONCLUSÃO: a ressecção da válvula ileocecal levou à mudanças da microbiota ileal e, com a criação de novo esfíncter, as variações foram maiores.

Freqüência de mutação no códon 12 do gene K-ras no carcinoma ductal invasivo de mama

Objetivo: pesquisar a freqüência de mutação pontual no códon 12 do gene K-ras, em espécimes cirúrgicos de pacientes portadoras de carcinoma ductal invasivo de mama. Material e Métodos: foram utilizados cortes de 50 espécimes cirúrgicos incluídos em blocos de parafina, de pacientes portadoras de carcinoma ductal invasivo de mama, com graus histológicos II e III. Os cortes destinados ao estudo foram desparafinizados e submetidos a extração do DNA, por meio do emprego da proteinase K. Para a amplificação do fragmento a ser analisado, utilizou-se a reação em cadeia da polimerase, seguida por clivagem com o emprego de enzima de restrição de comprimento variável (RFLP). A verificação da presença de mutação nas amostras foi feita com o emprego de eletroforese em gel de agarose, com marcador de peso molecular "Ladder 123" (GIBCO-BRL), e a documentação dos resultados, mediante fotografia, utilizando-se luz ultravioleta transmitida. Resultados: em cinco dos 50 carcinomas ductais invasivos de mama estudados (10%) constatou-se a presença de mutação no códon 12 do gene K-ras, sendo todas elas polimórficas para esse caráter. As afetadas pelos tumores, que apresentavam a referida mutação, encontravam-se na pós-menopausa. Em quatro dos cinco casos em que se constatou a mutação, o grau histológico dos tumores era II e no caso restante III.

Comparação dos Métodos para Diagnóstico da Toxoplasmose Congênita

Objetivo: avaliar a eficácia da reação em cadeia da polimerase (PCR) no líquido amniótico para a detecção da contaminação fetal pelo Toxoplasma gondii em gestantes com infecção aguda e correlacionar com a técnica de inoculação e a histologia da placenta. Métodos: trinta e sete pacientes foram estudadas prospectivamente e o diagnóstico foi baseado na identificação da infecção aguda materna, seguido pela amniocentese guiada pela ultra-sonografia para obtenção de líquido amniótico para a realização de PCR e inoculação em camundongo. As pacientes foram tratadas com espiramicina durante a gestação; se a infecção fetal era demonstrada, pirimetamina e sulfadiazina eram acrescentadas ao esquema. As placentas foram encaminhadas para exame histológico. As crianças foram acompanhadas durante um período que variou de três a 23 meses para a confirmação ou exclusão da toxoplasmose congênita. Resultados: medidas de associação como sensibilidade, especificidade e valores preditivos foram calculadas para a PCR no líquido amniótico, a inoculação em camundongo e a histologia da placenta, mostrando os seguintes resultados: para a PCR, uma sensibilidade de 66,7% e especificidade de 87,1%; os respectivos valores para a inoculação em camundongo foram 50 e 100% e para a histologia da placenta foram 80 e 66,7%. Conclusões: embora a PCR não deva ser utilizada isoladamente para diagnóstico de toxoplasmose congênita, é um método promissor e necessita de maiores estudos para melhorar sua eficácia.

diagnóstico da infecção pelo HPV em lesões do colo do útero em mulheres HIV+: acuidade da histopatologia

Objetivo: comparar a acurácia do estudo histopatológico e da reação em cadeia por polimerase (PCR) no diagnóstico da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) em lesões do colo uterino de mulheres infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Métodos: foram estudadas 52 mulheres soropositivas para o HIV com lesões cervicais clinicamente suspeitas de HPV nas quais se realizou raspado ectocervical para a PCR e biópsia dirigida pela colposcopia, para o estudo histopatológico. As amostras de três pacientes se mostraram sem qualidade para a PCR, reduzindo a população estudada para 49. Resultados: a prevalência de HPV foi de 53% pela histopatologia e de 85,7% pela PCR. Dentre as 42 pacientes com HPV detectado pela PCR, 26 foram confirmadas pela histopatologia (sensibilidade = 61,9%). Esta, por sua vez, não demonstrou nenhum resultado falso-positivo (especificidade = 100%), com predição positiva de 100%. Comparando-se os dois resultados, encontrou-se para a histopatologia: valor preditivo positivo = 100% e valor preditivo negativo = 30,4%. Das 26 pacientes com histopatologia positiva para HPV, 15 (57,6%) apresentaram neoplasias intra-epiteliais cervicais (NIC). O risco relativo de uma paciente com HPV apresentar NIC foi de 13,3. Conclusão: a histopatologia mostrou 100% de acerto para o diagnóstico de HPV, o que significa dizer que, quando a biópsia for positiva o HPV certamente estará presente, confirmando a suspeita clínica. No entanto, a baixa sensibilidade retira da histopatologia o valor como exame de rastreamento nesse grupo de mulheres.

Problemas ginecológicos mais freqüentes em mulheres soropositivas para o HIV

OBJETIVO: apresentar os achados ginecológicos mais freqüentes de uma coorte de 300 mulheres infectadas pelo HIV, acompanhadas ambulatorialmente. MÉTODOS: estudo prospectivo e descritivo de mulheres HIV-soropositivas atendidas em clínica ginecológica, no período de novembro de 1996 a dezembro de 2002. As pacientes foram submetidas ao protocolo de atendimento ginecológico que incluiu anamnese, exame ginecológico, colpocitologia oncótica (Papanicolaou), pesquisa de HPV (PCR) e colposcopia. A biópsia cervical, quando necessária, foi realizada. Os dados foram armazenados e analisados no Epi-Info, versão 6.0. RESULTADOS: a idade média foi 34,5 anos. Destaca-se o pequeno número de parceiros sexuais, média de três parceiros, e a predominância do contágio heterossexual: 271 (90,6%) pacientes adquiriram o vírus por meio do contato sexual com seus parceiros. Foi alta a prevalência de neoplasias intra-epiteliais cervicais (NIC), representando 21,7% do total da amostra. Dentre as 109 pacientes submetidas a PCR encontraram-se 89 (81,7%) com algum genótipo do HPV. Esfregaço inflamatório à citologia esteve presente em 69% das pacientes. CONCLUSÕES: a infecção pelo HIV se associa com freqüência a NIC e a processos infecciosos genitais, em especial o HPV.