DEK oncogene expression during normal hematopoiesis and in Acute Myeloid Leukemia (AML)

DEK is important in regulating cellular processes including proliferation, differentiation and maintenance of stem cell phenotype. The translocation t(6;9) in Acute Myeloid Leukemia (AML), which fuses DEK with NUP214, confers a poor prognosis and a higher risk of relapse. The over-expression of DEK in AML has been reported, but different studies have shown diminished levels in pediatric and promyelocytic leukemias. This study has characterized DEK expression, in silico, using a large multi-center cohort of leukemic and normal control cases. Overall, DEK was under-expressed in AML compared to normal bone marrow (NBM). Studying specific subtypes of AML confirmed either no significant change or a significant reduction in DEK expression compared to NBM. Importantly, the similarity of DEK expression between AML and NBM was confirmed using immunohistochemistry analysis of tissue mircorarrays. In addition, stratification of AML patients based on median DEK expression levels indicated that DEK showed no effect on the overall survival of patients. DEK expression during normal hematopoiesis did reveal a relationship with specific cell types implicating a distinct function during myeloid differentiation. Whilst DEK may play a potential role in hematopoiesis, it remains to be established whether it is important for leukemagenesis, except when involved in the t(6;9) translocation.

Vosaroxin and vosaroxin plus low-dose Ara-C (LDAC) vs low-dose Ara-C alone in older patients with acute myeloid leukemia

The development of new treatments for older patients with acute myeloid leukemia is an active area, but has met with limited success. Vosaroxin, a quinolone-derived intercalating agent has several properties that could prove beneficial. Initial clinical studies showed it to be well-tolerated in older patients with relapsed/refractory disease. In vitro data suggested synergy with cytarabine (Ara-C). To evaluate vosaroxin, we performed 2 randomized comparisons within the "Pick a Winner" program. A total of 104 patients were randomized to vosaroxin vs low-dose Ara-C (LDAC) and 104 to vosaroxin + LDAC vs LDAC. When comparing vosaroxin with LDAC, neither response rate (complete recovery [CR]/complete recovery with incomplete count recovery [CRi], 26% vs 30%; odds ratio [OR], 1.16 (0.49-2.72); P = .7) nor 12-month survival (12% vs 31%; hazard ratio [HR], 1.94 [1.26-3.00]; P = .003) showed benefit for vosaroxin. Likewise, in the vosaroxin + LDAC vs LDAC comparison, neither response rate (CR/CRi, 38% vs 34%; OR, 0.83 [0.37-1.84]; P = .6) nor survival (33% vs 37%; HR, 1.30 [0.81-2.07]; P = .3) was improved. A major reason for this lack of benefit was excess early mortality in the vosaroxin + LDAC arm, most obviously in the second month following randomization. At its first interim analysis, the Data Monitoring and Ethics Committee recommended closure of the vosaroxin-containing trial arms because a clinically relevant benefit was unlikely.

Downregulation of the Wnt inhibitor CXXC5 predicts a better prognosis in acute myeloid leukemia

The gene CXXC5 on 5q31 is frequently deleted in acute myeloid leukemia (AML) with del(5q), suggesting that inactivation of CXXC5 might play a role in leukemogenesis. Here, we investigated the functional and prognostic implications of CXXC5 expression in AML. CXXC5 mRNA was downregulated in AML with MLL rearrangements, t(8;21) and GATA2 mutations. As a mechanism of CXXC5 inactivation, we found evidence for epigenetic silencing by promoter methylation. Patients with CXXC5 expression below the median level had a lower relapse rate (45% vs 59%; P = .007) and a better overall survival (OS, 46% vs 28%; P < .001) and event-free survival (EFS, 36% vs 21%; P < .001) at 5 years, independent of cytogenetic risk groups and known molecular risk factors. In gene-expression profiling, lower CXXC5 expression was associated with upregulation of cell-cycling genes and codownregulation of genes implicated in leukemogenesis (WT1, GATA2, MLL, DNMT3B, RUNX1). Functional analyses demonstrated CXXC5 to inhibit leukemic cell proliferation and Wnt signaling and to affect the p53-dependent DNA damage response. In conclusion, our data suggest a tumor suppressor function of CXXC5 in AML. Inactivation of CXXC5 is associated with different leukemic pathways and defines an AML subgroup with better outcome.

Selective induction of apoptosis by the pyrrolo-1,5-benzoxazepine 7-[[dimethylcarbamoyl]oxy]-6-(2-naphthyl)pyrrolo-[2,1-d] (1,5)-benzoxazepine (PBOX-6) in Leukemia cells occurs via the c-Jun NH2-terminal kinase-dependent phosphorylation and inactivation of Bcl-2 and Bcl-XL

Overexpression of the Bcl-2 proto-oncogene in tumor cells confers resistance against chemotherapeutic drugs. In this study, we describe how the novel pyrrolo-1,5-benzoxazepine compound 7-[[dimethylcarbamoyl]oxy]-6-(2-naphthyl)pyrrolo-[2,1-d] (1,5)-benzoxazepine (PBOX-6) selectively induces apoptosis in Bcl-2-overexpressing cancer cells, whereas it shows no cytotoxic effect on normal peripheral blood mononuclear cells. PBOX-6 overcomes Bcl-2-mediated resistance to apoptosis in chronic myelogenous leukemia (CML) K562 cells by the time- and dose-dependent phosphorylation and inactivation of antiapoptotic Bcl-2 family members Bcl-2 and Bcl-XL. PBOX-6 also induces Bcl-2 phosphorylation and apoptosis in wild-type T leukemia CEM cells and cells overexpressing Bcl-2. This is in contrast to chemotherapeutic agents such as etoposide, actinomycin D, and ultraviolet irradiation, whereby overexpression of Bcl-2 confers resistance against apoptosis. In addition, PBOX-6 induces Bcl-2 phosphorylation and apoptosis in wild-type Jurkat acute lymphoblastic leukemia cells and cells overexpressing Bcl-2. However, Jurkat cells containing a Bcl-2 triple mutant, whereby the principal Bcl-2 phosphorylation sites are mutated to alanine, demonstrate resistance against Bcl-2 phosphorylation and apoptosis. PBOX-6 also induces the early and transient activation of c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) in CEM cells. Inhibition of JNK activity prevents Bcl-2 phosphorylation and apoptosis, implicating JNK in the upstream signaling pathway leading to Bcl-2 phosphorylation. Collectively, these findings identify Bcl-2 phosphorylation and inactivation as a critical step in the apoptotic pathway induced by PBOX-6 and highlight its potential as an effective antileukemic agent.

Identification and validation of the dopamine agonist bromocriptine as a novel therapy for high-risk myelodysplastic syndromes and secondary acute myeloid leukemia

Myelodysplastic syndromes (MDS) represent a broad spectrum of diseases characterized by their clinical manifestation as one or more cytopenias, or a reduction in circulating blood cells. MDS is predominantly a disease of the elderly, with a median age in the UK of around 75. Approximately one third of MDS patients will develop secondary acute myeloid leukemia (sAML) that has a very poor prognosis. Unfortunately, most standard cytotoxic agents are often too toxic for older patients. This means there is a pressing unmet need for novel therapies that have fewer side effects to assist this vulnerable group. This challenge was tackled using bioinformatic analysis of available transcriptomic data to establish a gene-based signature of the development and progression of MDS. This signature was then used to identify novel therapeutic compounds via statistically-significant connectivity mapping. This approach suggested re-purposing an existing and widely-prescribed drug, bromocriptine as a novel potential therapy in these disease settings. This drug has shown selectivity for leukemic cells as well as synergy with current therapies.

GEP analysis validates high risk MDS and acute myeloid leukemia post MDS mice models and highlights novel dysregulated pathways

BACKGROUND: In spite of the recent discovery of genetic mutations in most myelodysplasic (MDS) patients, the pathophysiology of these disorders still remains poorly understood, and only few in vivo models are available to help unravel the disease.

METHODS: We performed global specific gene expression profiling and functional pathway analysis in purified Sca1+ cells of two MDS transgenic mouse models that mimic human high-risk MDS (HR-MDS) and acute myeloid leukemia (AML) post MDS, with NRASD12 and BCL2 transgenes under the control of different promoters MRP8NRASD12/tethBCL-2 or MRP8[NRASD12/hBCL-2], respectively.

RESULTS: Analysis of dysregulated genes that were unique to the diseased HR-MDS and AML post MDS mice and not their founder mice pointed first to pathways that had previously been reported in MDS patients, including DNA replication/damage/repair, cell cycle, apoptosis, immune responses, and canonical Wnt pathways, further validating these models at the gene expression level. Interestingly, pathways not previously reported in MDS were discovered. These included dysregulated genes of noncanonical Wnt pathways and energy and lipid metabolisms. These dysregulated genes were not only confirmed in a different independent set of BM and spleen Sca1+ cells from the MDS mice but also in MDS CD34+ BM patient samples.

CONCLUSIONS: These two MDS models may thus provide useful preclinical models to target pathways previously identified in MDS patients and to unravel novel pathways highlighted by this study.

Application of Machine Learning Techniques to Acute Myeloid Leukemia

Thesis (Master's)--University of Washington, 2016-03

Multimeric complexes of the PML-retinoic acid receptor alpha fusion protein in acute promyelocytic leukemia cells and interference with retinoid and peroxisome-proliferator signaling pathways.

The t(15;17) chromosomal translocation, specific for acute promyelocytic leukemia (APL), fuses the PML gene to the retinoic acid receptor alpha (RAR alpha) gene, resulting in expression of a PML-RAR alpha hybrid protein. In this report, we analyzed the nature of PML-RAR alpha-containing complexes in nuclear protein extracts of t(15;17)-positive cells. We show that endogenous PML-RAR alpha can bind to DNA as a homodimer, in contrast to RAR alpha that requires the retinoid X receptor (RXR) dimerization partner. In addition, these cells contain oligomeric complexes of PML-RAR alpha and endogenous RXR. Treatment with retinoic acid results in a decrease of PML-RAR alpha protein levels and, as a consequence, of DNA binding by the different complexes. Using responsive elements from various hormone signaling pathways, we show that PML-RAR alpha homodimers have altered DNA-binding characteristics when compared to RAR alpha-RXR alpha heterodimers. In transfected Drosophila SL-3 cells that are devoid of endogenous retinoid receptors PML-RAR alpha inhibits transactivation by RAR alpha-RXR alpha heterodimers in a dominant fashion. In addition, we show that both normal retinoid receptors and the PML-RAR alpha hybrid bind and activate the peroxisome proliferator-activated receptor responsive element from the Acyl-CoA oxidase gene, indicating that retinoids and peroxisome proliferator receptors may share common target genes. These properties of PML-RAR alpha may contribute to the transformed phenotype of APL cells.

Simple method for detection of MYH11 DNA rearrangements in patients with inv(16)(p13q22) and acute myeloid leukemia.

The pericentric inversion on chromosome 16 [inv(16)(p13q22)] and related t(16;16)(p13;q22) are recurrent aberrations associated with acute myeloid leukemia (AML) M4 Eo. Both abberations result in a fusion of the core binding factor beta (CBFB) and smooth muscle myosin heavy chain gene (MYH11). A selected genomic 6.9-kb BamHl probe detects MYH11 DNA rearrangements in 18 of 19 inv(16)/t(16;16) patients tested using HindIII digested DNA. The rearranged fragments were not detectable after remission in two cases tested, while they were present after relapse in one of these two cases tested.

Fonctions de l'oncoprotéine LMO2 déterminées par ses interactions protéiques

La leucémie lymphoïde représente environ 30% des cas de cancer chez l’enfant. Elle est souvent causée par des réarrangements chromosomiques impliquant des gènes encodant des facteurs de transcription, qui contrôlent des programmes génétiques complexes. Par exemple, LMO2 (LIM-only 2) est un facteur de transcription oncogénique fréquemment exprimé de façon aberrante dans les leucémies lymphoblastiques aigues des cellules T (T-ALL). Dans l’hématopoïèse normale, LMO2 est essentiel à la génération des cellules souches hématopoïétiques à l’origine de toutes les cellules sanguines. D’ailleurs, certaines cellules leucémiques possèdent des propriétés normalement réservées aux cellules souches hématopoïétiques. Ainsi, l’étude de la fonction de LMO2 dans les cellules souches hématopoïétiques peut être pertinente autant dans le contexte hématopoïétique normal que leucémique. Afin de mettre en évidence de nouvelles fonctions moléculaires pour LMO2, j’ai choisi d’identifier les protéines qui s’y associent. En plus de ses partenaires connus, j’ai identifié plusieurs protéines de transcription/remodelage de la chromatine, en accord avec son rôle transcriptionnel. Plusieurs nouvelles fonctions potentielles ont été révélées, indiquant que cette protéine adaptatrice pourrait faire partie de complexes non transcriptionnels, régulant d’autres processus cellulaires. Les oncogènes comme LMO2 pourraient être des régulateurs à large spectre. Particulièrement, j’ai identifié des interactions entre LMO2 et des protéines de réplication de l’ADN. J’ai montré que LMO2 contrôle la réplication de l’ADN dans les cellules hématopoïétiques, et possiblement durant la leucémogenèse, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Ensemble, ces études ont donc permis de révéler de nouvelles fonctions pour LMO2, et pourraient servir de paradigme pour d’autres facteurs de transcription oncogéniques, particulièrement aux autres protéines de la famille LMO, qui sont aussi des oncogènes puissants.

Understanding the transcriptional control of EIF4E and its dysregulation in acute myeloid leukemia: role of NF-κB

EIF4E, le facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes est un oncogène puissant et qui se trouve induit dans plusieurs types de cancers, parmi lesquels les sous-types M4 et M5 de la leucémie aiguë myéloblastique (LAM). EIF4E est régulé à plusieurs niveaux cependant, la régulation transcriptionnelle de ce gène est peu connue. Mes résultats montrent que EIF4E est une cible transcriptionnelle directe du facteur nucléaire « kappa-light- chain- enhancer of activated B cells » (NF-κB).Dans les cellules hématopoïétiques primaires et les lignées cellulaires, les niveaux de EIF4E sont induits par des inducteurs de NF-κB. En effet, l’inactivation pharmaceutique ou génétique de NF-κB réprime l’activation de EIF4E. En effet, suite à l’activation de NF-κB chez l’humain, le promoteur endogène de EIF4E recrute p65 (RelA) et c-Rel aux sites évolutionnaires conservés κB in vitro et in vivo en même temps que p300 ainsi que la forme phosphorylée de Pol II. De plus, p65 est sélectivement associé au promoteur de EIF4E dans les sous-types LAM M4/M5 mais non pas dans les autres sous-types LAM ou dans les cellules hématopoïétiques primaires normales. Ceci indique que ce processus représente un facteur essentiel qui détermine l’expression différentielle de EIF4E dans la LAM. Les analyses de données d’expressions par séquençage de l’ARN provenant du « Cancer Genome Atlas » (TCGA) suggèrent que les niveaux d’ARNm de EIF4E et RELA se trouvent augmentés dans les cas LAM à pronostic intermédiaire ou faible mais non pas dans les groupes cytogénétiquement favorables. De plus, des niveaux élevés d’ARNm de EIF4E et RELA sont significativement associés avec un taux de survie relativement bas chez les patients. En effet, les sites uniques κB se trouvant dans le promoteur de EIF4E recrutent le régulateur de transcription NF-κB p65 dans 47 nouvelles cibles prévues. Finalement, 6 nouveaux facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la régulation du gène EIF4E ont été prédits par des analyses de données ChIP-Seq provenant de l’encyclopédie des éléments d’ADN (ENCODE). Collectivement, ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur le control transcriptionnel de EIF4E et offrent une nouvelle base moléculaire pour sa dérégulation dans au moins un sous-groupe de spécimens de LAM. L’étude et la compréhension de ce niveau de régulation dans le contexte de spécimens de patients s’avère important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’expression du gène EIF4E moyennant des inhibiteurs de NF-κB en combinaison avec la ribavirine.

Identification de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, un facteur de transcription fréquemment altéré dans la leucémie aiguë lymphoblastique

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Plusieurs réarrangements chromosomiques ont été associés à cette maladie, dont la translocation t(12;21), qui est observée dans 25% des cas de LAL de type pré-B. Cette translocation engendre l’expression de la protéine de fusion ETV6-AML1. Toutefois, celle-ci n’est pas suffisante pour initier seule une leucémie, ce qui suggère que des mutations additionnelles sont nécessaires à la transformation oncogénique. Or, on observe que l’allèle non-réarrangé d’ETV6 est perdu dans 75% des cas de t(12;21). Cette délétion entraîne l’inactivation complète du facteur de transcription ETV6 et l’abolition de sa fonction biologique. Puisqu’ETV6 semble jouer un rôle de suppresseur de tumeurs, nous croyons que son inactivation favoriserait le développement de la leucémie via la dérégulation de ses gènes cibles. Ce projet visait donc à identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, afin d’élucider son implication dans la leucémie. Une expérience de RNA-Seq a permis d’identifier plus de 200 gènes dont l’expression est corrélée avec celle d’ETV6 dans des cellules souches hématopoïétiques CD34+. Parmi ceux-ci, plusieurs gènes sont impliqués dans la réponse immunitaire et inflammatoire, la migration cellulaire, l’homéostasie ionique et la signalisation intracellulaire. Nous avons également mis en place une approche d’immunoprécipitation de la chromatine afin d’identifier les régions auxquelles le facteur de transcription ETV6 peut se lier. À l’aide de cette méthode, nous avons démontré une interaction entre ETV6 et SLCO2B1, un gène dont l’expression est également co-régulée avec ETV6. Finalement, notre étude suggère qu’ETV6 contribuerait à la leucémogenèse en dérégulant l’expression de certains gènes ayant des propriétés oncogéniques.