Caracterização molecular de isolados de Enterobacteriaceae produtores de beta-lactamases de espectro alargado (ESBLs) provenientes de suiniculturas de produção intensiva e extensiva de Portugal

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Mastites ovinas: Epidemiologia, factores de virulência e antigénios imunorrelevantes de agentes etiológicos

O presente trabalho teve como objectivo o estudo da prevalência de mastites ovinas em explorações do Alentejo e a identificação dos agentes etiológicos, seus factores de virulência e epitopos imunorrelevantes. A prevalência de mastite clínica e subclínica foi 1,7% e 32,2%, respectivamente. O agente etiológico mais prevalente foi Staphylococcus epidermidis (N=115), tendo sido também identificados Staphylococcus aureus (N=27) e Streptococcus agalactiae (N=17). A pesquisa de factores de virulência permitiu identificar os padrões de susceptibilidade (N=404) e as Concentrações Inibitórias Mínimas de princípios activos (N=130). De 109 isolados de Staphylococcus epidermidis; oito revelaram capacidade para produzir biofilme in vitro. Os isolados estudados aderiam e eram internalizados por células epiteliais mamárias (N=12). A pesquisa de cinco superantigénios resultou negativa (N=27). Foram estudados os perfis proteicos de Staphylococcus epidermidis, tendo sido identificados os epitopos imunorrelevantes, reconhecidos por imunoglobulinas séricas e mamárias. Verificou-se uma resposta imunológica local específica nos animais infectados./SUMMARY - OVINE MASTITIS: EPIDEMIOLOGY, VIRULENCE FACTORS AND IMMUNORELEVANT ANTIGENES OF AETIOLOGICAL MICRORGANISMS The present work aimed at investigating the prevaleance of ovine mastitis in farms from Aletenjo and the identification of causative microrganisms, their virulence factors and immunorelevant epitopes. The preva lence of clinical and subclinical mastitis was 1.7% and 32.2%,respect ively. The most preva lent aet iologica l agent was Staphylococcus epidermidis (N=115); Staphylococcus aureus (N=27) and Streptococcus agalactiae (N=17) were also identified. The investigation of virulence factors allowed the identification of susceptibility patterns (N=404) and drug Minimal Inhibitory Concentrations (N=130). From 109 Staphylococcus epidermidis isolates; eight showed the ability to produce biofilm in vitro. The isolates studied adhered and were internalised by mammary epithelial cells (N=12). None of the five superantigens studied was detected (N=27). The protein profile of Staphylococcus epidermidis was determined, and the immunorelevant epitopes, recognised by blood and milk immunoglobulins, were identified. It was possible to detect a specific local immune response in infected animals.

Estratégias para a valorização do coberto vegetal da Ilha de Porto Santo

No presente trabalho desenvolveram-se estudos visando a valorização do coberto vegetal da Ilha de Porto Santo, através de duas metodologias de investigação complementares: a) preservação e reintrodução na Ilha de uma espécie endémica e em risco do Arquipélago da Madeira (Olea maderensis) e de uma espécie naturalizada (Olea europaea ssp. europaea var. sylvestris), recorrendo para o efeito a técnicas de biotecnologia (micropropagação); b) análise da percepção da comunidade local e visitante sobre o fenómeno da desertificação e a valorização do coberto vegetal bem como a sua aceitação relativamente à aplicação de técnicas de biotecnologia (para micropropagar e reintroduzir espécies de oliveira na Ilha) para minimização do processo de desertificação. A dissertação estrutura-se em quatro partes principais. A Parte I caracteriza a Ilha de Porto Santo em termos geográficos, geológicos, climáticos, sócio-economicos e do uso do solo. Enquadra, ainda, o problema da desertificação, através da caracterização/evolução do coberto vegetal ao longo dos anos. Finalmente apresentam-se os objectivos gerais deste estudo. A Parte II centra-se no desenvolvimento de metodologias no âmbito da biotecnologia vegetal para propagação de espécies de O. maderensis e O. europaea ssp. europaea var. sylvestris. em larga escala. Esta parte está dividida em seis capítulos. O Capítulo II.1 aborda a distribuição geográfica das espécies de oliveira e faz uma revisão bibliográfica dos aspectos mais importantes da micropropagação de oliveira (O. europaea L.), principalmente através da micropropagação por estimulação de gomos axilares. No final deste capítulo apresentam-se os objectivos específicos desta investigação. No Capítulo II.2 faz-se a caracterização genética de genótipos de O. maderensis do Arquipélago da Madeira através da análise da ploidia e do conteúdo em DNA por citometria de fluxo (FCM) e através da detecção de polimorfismos por análise de microssatélites (SSR). Nesta análise usaram-se ainda outros genótipos, nomeadamente: O. europaea ssp. europaea var. sylvestris, O. cerasiformes e O. europaea ssp. europaea var. europaea. Este estudo contribuiu para uma melhor caracterização desta espécie e permitiu a detecção de um nível de ploidia novo no género Olea (tetraploidia). O Capítulo II.3 descreve a optimização das condições de cultura in vitro (e.g. desinfecção, meio de cultura e enraizamento) para propagar e preservar a O. maderensis. Avalia-se ainda a “performance” dos rebentos in vitro (taxas de crescimento, avaliação da aparência das folhas e estudos fisiológicos), de modo a confirmar a optimização das condições de propagação. Neste capítulo define-se um meio novo (OMG) para propagação desta espécie endémica. O Capítulo II.4 descreve dois protocolos de micropropagação e aclimatização de ambas as espécies (O. maderensis e O. europaea ssp. europaea var. sylvestris) e a qualidade das plantas (“true-to-type”) é avaliada através da possível ocorrência de variabilidade genética através de FCM (ploidia) e SSRs. O Capítulo II.5 descreve um protocolo eficiente de aclimatização ao campo de O. maderensis e avalia a “performance” das plantas micropropagadas no campo através da análise de parâmetros fisiológicos durante o processo. O Capítulo II.6 apresenta os estudos em curso relativamente às plantas de O. maderensis em aclimatização no campo, bem como a introdução de plantas micropropagadas num outro local da Ilha com um maior grau de degradação dos solos. Estas estratégias estão a ser aplicadas juntamente com a DRFRAM, no âmbito de programas de florestação em curso. Finalmente é realçada a necessidade de estudos semelhantes com outras espécies nativas. Na Parte III, são apresentados os estudos sobre a percepção da comunidade local relativamente à valorização do coberto vegetal para a minimização dos processos de degradação dos solos/desertificação. A introdução faz o enquadramento teórico sobre o fenómeno da desertificação, particularmente na Ilha de Porto Santo e sobre a percepção social da desertificação. São ainda apresentados os objectivos específicos desta investigação. A metodologia adoptada recorreu à aplicação de inquéritos por questionário à população residente e aos visitantes da Ilha de Porto Santo e ainda a realização de inquéritos por entrevista a algumas entidades e especialistas. Estes estudos permitiram verificar que existe uma nítida consciência da situação de risco da ilha, das medidas tomadas e a tomar e da premência da resolução do problema. Face ao recurso de estratégias alternativas envolvendo biotecnologia, e apesar de existir algum desconhecimento, concluiu-se ainda que a população manifesta aceitação, desde que essas estratégias valorizem o coberto vegetal e, assim, ajudem a combater a degradação biofísica dos solos. Finalmente são apresentadas as conclusões e algumas recomendações. Na Parte IV apresentam-se as conclusões gerais e perspectivas futuras, onde o potencial ambiental destas oliveiras bravas micropropagadas é destacado, bem como é considerado o alargamento da aplicação destas estratégias a outras espécies indígenas em risco, nesta Ilha (e noutros locais). São ainda resumidas as principais visões da população e das entidades e dos especialistas que poderão contribuir para apoiar a elaboração de medidas de mitigação e prevenção no combate ao processo de degradação dos solos/desertificação em curso.

Efeitos genotóxicos e bioquímicos de xenobióticos em animais aquáticos

No presente trabalho, foi estudado um largo espectro de efeitos genotóxicos e bioquímicos na tainha-garrento (Liza aurata). Nos Capítulos II e III são descritos os efeitos de exposição de curta duração ao fenantreno, um hidrocarboneto aromático policíclico (HAP). A exposição de curta duração (16 horas) demonstrou a capacidade deste composto induzir a actividade da enzima de fase I da biotransformação, etoxiresorufina O-desetilase (EROD), provocar decréscimos de integridade no ADN hepático e aumento de anomalias nucleares eritrocíticas (ANE). Em termos de respostas de stresse, os níveis plasmáticos de cortisol e glucose aumentaram face à exposição a este HAP. A exposição ao fenantreno induziu o decréscimo da glutationa peroxidase (GPx) nas guelras, enquanto que no fígado a actividade da GPx aumentou. No rim, a actividade da glutationa S-transferase (GST) foi inibida. Nas guelras, verificou-se um aumento da catalase. O fenantreno demonstrou igualmente a capacidade de induzir um aumento dos níveis de glutationa nas guelras e fígado. Estas respostas demonstraram a sensibilidade de L. aurata, a este HAP, realçando a especificidade das respostas em termos de órgãos. Apesar dos aumentos das defesas antioxidantes, o potencial tóxico deste composto foi demonstrado pelo aumento da peroxidação lipídica nos três órgãos. Nos capítulos seguintes, são descritas as respostas de L. aurata capturada na Ria de Aveiro, em locais com diferentes perfis de contaminação, inicialmente no Outono de 2005 (Capítulos III a IX) e posteriormente analisando respostas sazonais (Capítulos X e XI). A análise de respostas de stresse (cortisol, glucose e lactato) revelou que L. aurata capturada em Vagos (local contaminado por HAPs) apresentava níveis baixos de cortisol, enquanto que no Laranjo (local contaminado por mercúrio) apresentavam elevados níveis de glucose e lactato. Relativamente às hormonas do eixo hipotálamo – hipófise – tiróide (HHT), foram observados elevados níveis plasmáticos da hormona estimuladora da tiróide (TSH) nos organismos capturados no Laranjo, baixos níveis de tiroxina (T4) nos organismos da Barra (local sujeito a tráfego naval) e baixos níveis de triiodotironina (T3) no Rio Novo do Príncipe (próximo de um antigo efluente de pasta de papel), Laranjo e Vagos. A avaliação das defesas antioxidantes, dano oxidativo e genotóxico nas guelras, rim e fígado revelou diferenças significativas nas respostas dos órgãos. L. aurata capturada na Barra apresentou dano oxidativo nas guelras (Capítulo V). No rim foi detectada uma diminuição da integridade do ADN no Rio Novo do Príncipe e Vagos (Capítulo VI), enquanto que no fígado foi observado dano lipídico na Gafanha e Vagos (Capítulo VIII). O dano não esteve sempre associado a um decréscimo das defesas. As análises da água e do sedimento da Ria de Aveiro (Outono de 2005) revelaram elevadas concentrações de metais (Cd, Hg, Cu e Zn),principalmente, no Laranjo e Rio Novo do Príncipe. L. aurata capturada nestes locais apresentou os níveis mais elevados de metalotioninas hepáticas (Capítulo VII) que parecem responsáveis pela inexistência de danos no fígado (Capítulo VIII). O dano oxidativo no ADN, avaliado através da quantificação dos níveis plasmáticos de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OHdG) e o dano clastogénico/aneugénico, avaliado através da quantificação da frequência de ANE, foram estudados, no Outono de 2005, em duas espécies de peixes (L. aurata e Dicentrarchus labrax - robalo) (Capítulo IX). Os resultados revelaram grande sensibilidade de D. labrax em termos de dano oxidativo no ADN na Gafanha, Rio Novo do Príncipe e Vagos, enquanto que L. aurata apresentou dano oxidativo apenas no Laranjo. O aumento da frequência de ANE apenas foi detectado em L. aurata, em Vagos, não se tendo detectado correlação entre estes dois parâmetros. O estudo sazonal (Maio de 2006 a Março de 2007) do dano oxidativo no ADN e frequência de ANE em L. aurata (Capítulo X) demonstrou a variação destes parâmetros com a estação do ano, apesar de não se ter verificado correlação com os parâmetros hidrológicos determinados. No entanto, no local de referência não se verificaram diferenças sazonais, o que sugere que estes biomarcadores reflectem variações de biodisponibilidade de contaminantes. A análise global dos resultados das diferentes estações do ano revelou que L. aurata capturada no Rio Novo do Príncipe e em Vagos apresentou maior susceptibilidade a dano oxidativo no ADN. No entanto, apenas L. aurata capturada em Vagos apresentou frequência de ANE superior à do local de referência. Os dados do estudo sazonal revelaram uma correlação entre dano oxidativo e ANE, sugerindo o stresse oxidativo como um possível mecanismo envolvido na formação de anomalias. A integridade do ADN das guelras, rim, fígado e sangue de L. aurata foi igualmente estudada ao longo de um ano (Capítulo XI), tendo-se verificado uma grande variabilidade ao longo deste período. Não foi demonstrada sensibilidade a um perfil de contaminação específico, tendo-se verificando variabilidade sazonal no local de referência. Globalmente, os resultados demonstraram a importância da utilização de uma bateria de biomarcadores na monitorização ambiental e a especificidade da resposta dos diferentes órgãos de L. aurata.

Diversity of Aeromonas species from different environments in Portugal

Espécies de Aeromonas encontram-se distribuídas por diferentes habitats, estando especialmente relacionadas com ambientes aquáticos. O seu papel em complicações na saúde humana e animal é reconhecido. De facto, não só pelo seu potencial de virulência, mas também pelos determinantes genéticos de resistência a antibióticos que possam conter, estes organismos constituem uma preocupação na medicina humana e veterinária. Assim, é essencial o estudo da diversidade de espécies de Aeromonas bem como explorar as suas características fenotípicas e genéticas que podem conduzir a impactos negativos. A água constitui um importante veículo de transmissão de microrganismos e espécies de Aeromonas estão amplamente distribuídas em águas tratadas e não tratadas. Em Portugal é ainda comum o consumo de águas não tratadas cuja qualidade, na maioria das vezes, não é sujeita a monitorização, como acontece por exemplo, em explorações agrícolas de gestão familiar. Neste estudo, investigou-se a presença de Aeromonas em águas não tratadas para consumo. Estabeleceu-se também uma linha horizontal de colheitas de diferentes amostras de origem agrícola com o intuito de avaliar a possibilidade de a água ser uma das vias de contaminação de culturas agrícolas e animais por espécies de Aeromonas. Obtiveram-se 483 isolados que foram discriminados por RAPD-PCR. 169 estirpes distintas foram identificadas ao nível da espécie por análise filogenética baseada no gene gyrB. Verificou-se uma frequente ocorrência bem como uma diversidade considerável de espécies de Aeromonas. Em alguns casos, as relações genotípicas entre isolados de diferentes amostras eram muito próximas. Adicionalmente, a maioria das amostras continha diferentes espécies e estirpes distintas da mesma espécie. A. media e A. hydrophila foram as espécies mais ocorrentes. Um grupo de isolados apresentou variantes moleculares de gyrB diferente das conhecidas até agora, o que indica que poderão constituir espécies não descritas. O perfil de susceptibilidade da colecção de Aeromonas a diferentes antibióticos foi estabelecido, constituindo um perfil típico do género, com algumas excepções. Estirpes multirresistentes foram encontradas. A presença de genes tet e bla foi investigada por estudos de PCR, hibridação e, em alguns casos, de sequenciação. Como era esperado, cphA/imiS foi o mais detectado. A detecção de integrões fez-se por PCR e hibridação e a sua caracterização foi feita por sequenciação de DNA; a sua ocorrência foi reduzida. A maioria das estirpes sintetizou enzimas extracelulares com actividade lipolítica e proteolítica que potencialmente contribuem para virulência. A análise por PCR e hibridação permitiram a detecção de vários determinantes genéticos que codificam moléculas possivelmente envolvidas em processos patogénicos. Diversas espécies de Aeromonas apresentando características relacionadas com resistência a antibióticos e potencialmente de virulência estão frequentemente presentes em produtos para consumo humano e animal em Portugal. ABSTRACT: Aeromonas spp. are present in a wide range of ecological niches, being mainly related to aquatic environments. Their role in human and animal health complications is recognised. In fact, not only for their putative virulence but also for the antibiotic resistance genetic determinants Aeromonas may harbour, these organisms constitute an issue of concern in human and veterinary medicine. Thus, it is essential to get knowledge on Aeromonas sp. diversity and on their genotypic and phenotypic characteristics that may lead to negative impacts. Water constitutes a good contamination route for microorganisms and Aeromonas are widespread in untreated and treated waters from different sources. In Portugal there is still an extensive use of untreated water which is not regularly monitored for quality. This is often the case in family smallholding farms. In this study untreated drinking and mineral waters were assessed for their content in Aeromonas spp. Furthermore, a sampling scheme was designed to investigate the occurrence and diversity of Aeromonas sp. in different agricultural correlated sources and to assess the possibility of water being the transmission vehicle between those sources. 483 isolates were obtained and discriminated by RAPD-PCR. Identification at the species level for 169 distinct strains was done by gyrB based phylogenetic analysis. Results demonstrated the frequent occurrence and considerable diversity of Aeromonas spp. In some cases, genotypic close relations were found between isolates from different sources. Also, most samples contained different species and distinct strains of the same species. A. media and A. hydrophila were the most occurring. A group of isolates displayed gyrB gene sequences distinct from the previously known, indicating that they may constitute representatives of non-described species. The antibiotic susceptibility profile of the aeromonads collection was established and constituted a typical profile of the genus, although few exceptions. Multiresistance patterns were found. The presence of tet and bla genes was investigated by PCR, hybridisation and, in some cases, sequencing analysis. As expected, cphA/imiS was the most detected. Integrons were screened by PCR and hybridisation and characterised by DNA sequencing; low occurrence was recorded. The bulk of strains was able to produce extracellular enzymes with lipolytic and proteolytic activities, which may contribute to virulence. PCR and hybridisation surveys allowed the detection of distinct genetic determinants coding for molecules putatively involved in pathogenic processes. Diverse Aeromonas sp. presenting distinct antibiotic resistance features and putative virulence traits are frequently present in many sources for human and animal consumption in Portugal.

Geochemical study of the rehabilitation of a shallow anoxic reservoir, in volcanic terrains, under semi-arid climate, in Cape Verde Archipelago

Poilão dam reservoir (Cape Verde Archipelago) is in critical conditions, owing the excessive silting up, the high concentration of nitrates and the pronounced anoxia all over the lake. Considering that the most suitable remediation strategy is the removal of the bottom sediments where nutrients are preferentially concentrated, we have done a geochemical study, in order of evaluating their suitability to agricultural use. Analyses indicate that sediments are rich in a few key nutrients, when compared with parent soils. Thus, adding suitable sediments to nearby degraded soils can improve food crops for smallholder farmers living in close proximity to this system.

Active corrosion protection of AA2024 by sol-gel coatings with corrosion inhibitors

A indústria aeronáutica utiliza ligas de alumínio de alta resistência para o fabrico dos elementos estruturais dos aviões. As ligas usadas possuem excelentes propriedades mecânicas mas apresentam simultaneamente uma grande tendência para a corrosão. Por esta razão essas ligas necessitam de protecção anticorrosiva eficaz para poderem ser utilizadas com segurança. Até à data, os sistemas anticorrosivos mais eficazes para ligas de alumínio contêm crómio hexavalente na sua composição, sejam pré-tratamentos, camadas de conversão ou pigmentos anticorrosivos. O reconhecimento dos efeitos carcinogénicos do crómio hexavalente levou ao aparecimento de legislação banindo o uso desta forma de crómio pela indústria. Esta decisão trouxe a necessidade de encontrar alternativas ambientalmente inócuas mas igualmente eficazes. O principal objectivo do presente trabalho é o desenvolvimento de prétratamentos anticorrosivos activos para a liga de alumínio 2024, baseados em revestimentos híbridos produzidos pelo método sol-gel. Estes revestimentos deverão possuir boa aderência ao substrato metálico, boas propriedades barreira e capacidade anticorrosiva activa. A protecção activa pode ser alcançada através da incorporação de inibidores anticorrosivos no prétratamento. O objectivo foi atingido através de uma sucessão de etapas. Primeiro investigou-se em detalhe a corrosão localizada (por picada) da liga de alumínio 2024. Os resultados obtidos permitiram uma melhor compreensão da susceptibilidade desta liga a processos de corrosão localizada. Estudaram-se também vários possíveis inibidores de corrosão usando técnicas electroquímicas e microestruturais. Numa segunda etapa desenvolveram-se revestimentos anticorrosivos híbridos orgânico-inorgânico baseados no método sol-gel. Compostos derivados de titania e zirconia foram combinados com siloxanos organofuncionais a fim de obter-se boa aderência entre o revestimento e o substrato metálico assim como boas propriedades barreira. Testes industriais mostraram que estes novos revestimentos são compatíveis com os esquemas de pintura convencionais actualmente em uso. A estabilidade e o prazo de validade das formulações foram optimizados modificando a temperatura de armazenamento e a quantidade de água usada durante a síntese. As formulações sol-gel foram dopadas com os inibidores seleccionados durante a primeira etapa e as propriedades anticorrosivas passivas e activas dos revestimentos obtidos foram estudadas numa terceira etapa do trabalho. Os resultados comprovam a influência dos inibidores nas propriedades anticorrosivas dos revestimentos sol-gel. Em alguns casos a acção activa dos inibidores combinou-se com a protecção passiva dada pelo revestimento mas noutros casos terá ocorrido interacção química entre o inibidor e a matriz de sol-gel, de onde resultou a perda de propriedades protectoras do sistema combinado. Atendendo aos problemas provocados pela adição directa dos inibidores na formulação sol-gel procurou-se, numa quarta etapa, formas alternativas de incorporação. Na primeira, produziu-se uma camada de titania nanoporosa na superfície da liga metálica que serviu de reservatório para os inibidores. O revestimento sol-gel foi aplicado por cima da camada nanoporosa. Os inibidores armazenados nos poros actuam quando o substrato fica exposto ao ambiente agressivo. Numa segunda, os inibidores foram armazenados em nano-reservatórios de sílica ou em nanoargilas (halloysite), os quais foram revestidos por polielectrólitos montados camada a camada. A terceira alternativa consistiu no uso de nano-fios de molibdato de cério amorfo como inibidores anticorrosivos nanoparticulados. Os nano-reservatórios foram incorporados durante a síntese do sol-gel. Qualquer das abordagens permitiu eliminar o efeito negativo do inibidor sobre a estabilidade da matriz do sol-gel. Os revestimentos sol-gel desenvolvidos neste trabalho apresentaram protecção anticorrosiva activa e capacidade de auto-reparação. Os resultados obtidos mostraram o elevado potencial destes revestimentos para a protecção anticorrosiva da liga de alumínio 2024.

Mercury in feral fish: distribution, accumulation and toxicity

O principal objectivo desta dissertação foi estudar a acumulação de mercúrio em vários tecidos de peixes marinhos, a sua relação com factores biológicos e as respectivas respostas bioquímicas. O trabalho realizado permitiu obter novos conhecimentos sobre a acumulação de mercúrio em peixes, possibilitando avaliar a influência da biodisponibilidade do elemento e as suas possíveis implicações no ambiente. O trabalho foi desenvolvido na Ria de Aveiro (Portugal), uma zona costeira onde existe um gradiente ambiental de mercúrio, o que oferece a oportunidade de estudar a sua acumulação e os seus efeitos tóxicos em condições realísticas. As amostragens foram efectuadas em dois locais considerados críticos em termos de contaminação por mercúrio – Largo do Laranjo (L1 e L2) e num local afastado da principal fonte de poluição, usado como termo de comparação (Referência; R); L1 e L2 corresponderam a locais moderadamente e altamente contaminados, respectivamente. Foram escolhidos juvenis de duas espécies ecologicamente diferentes e representativas da comunidade piscícola local, a tainha garrento (Liza aurata) e o robalo (Dicentrarchus labrax). Em cada local foram recolhidas amostras de água e de sedimento para determinação de mercúrio. Foram quantificadas as concentrações de mercúrio total (T-Hg) e orgânico (O-Hg) em vários tecidos dos peixes, escolhidos tendo em conta a sua função relativamente à toxicocinética e toxicodinâmica de metais. As respostas antioxidantes (Catalase- CAT, glutationa peroxidase- GPx, glutationa reductase- GR, glutationa –S-transferase- GST e conteúdo em glutationa total- GSHt), o dano peroxidativo (LPO) e o conteúdo em metalotioninas (MTs) foram também avaliados. A acumulação de T-Hg foi semelhante para as duas espécies de peixes estudadas, embora D. labrax tenha apresentado concentrações tendencialmente maiores. Ambas as espécies demonstraram capacidade de reflectir o grau de contaminação ambiental existente, indicando claramente que a acumulação depende da concentração ambiental. A acumulação revelou-se específica de cada tecido. O padrão da acumulação em L. aurata foi rim > fígado > músculo > cérebro > guelras > sangue e em D. labrax foi fígado > rim > músculo > cérebro ≈ guelras > sangue. Relativamente à acumulação de OHg, verificou-se que D. labrax exibiu concentrações mais elevadas que L. aurata. Todos os tecidos foram capazes de reflectir diferenças entre R e L2. Os níveis de O-Hg no fígado, músculo e nos conteúdos intestinais foram diferentes entre espécies, sendo mais elevados para D. labrax. As guelras e o intestino foram os tecidos onde se obtiveram os valores mais baixos de O-Hg e observaram-se valores idênticos para as duas espécies. Com excepção das guelras, as concentrações de O-Hg variaram em função do valor observado nos conteúdos intestinais, indicando que a alimentação é a via dominante da acumulação. As concentrações de O-Hg nos conteúdos intestinais revelaram ser uma informação relevante para prever a acumulação de O-Hg nos tecidos, pois verificou-se uma razão praticamente constante entre o teor de mercúrio no fígado, no músculo e nos conteúdos intestinais. A percentagem de O-Hg no músculo e no fígado variou de acordo com o grau de contaminação ambiental e com o tipo de assimilação preferencial do elemento (alimentação vs. água), sugerindo que o fígado exerce um papel protector em relação à acumulação de mercúrio nos outros órgãos. Ambas as espécies de peixes demonstraram ser boas sentinelas da contaminação ambiental com mercúrio (T-Hg e O-Hg), sendo o cérebro e o músculo os tecidos que melhor reflectiram o grau de acumulação com o elemento. A análise conjunta dos dados de bioacumulação e de respostas ao stress oxidativo permitiram estabelecer uma relação entre as concentrações de mercúrio nas guelras, fígado, rim e cérebro e a sua toxicidade. As respostas do cérebro aos efeitos tóxicos do mercúrio revelaram ser específicas de cada espécie. Enquanto que para o cérebro de L. aurata se verificou um decréscimo de todos os parâmetros antioxidantes estudados nos locais contaminados, sem haver evidência de qualquer mecanismo compensatório, no D. labrax observaram-se respostas ambivalentes, que indicam por um lado a activação de mecanismos adaptativos e, por outro, o decréscimo das respostas antioxidantes, ou seja, sinais de toxicidade. Embora em ambas as espécies de peixe fosse evidente uma condição pró-oxidante, o cérebro parece possuir mecanismos compensatórios eficientes, uma vez que não se verificou peroxidação lipídica. As respostas antioxidantes do cérebro de D. labrax foram comparadas em diferentes períodos do ano - quente vs. frio. O período quente mostrou ser mais crítico, uma vez que no período frio não se verificaram diferenças nas respostas entre locais, ou seja, a capacidade antioxidante do cérebro parece ser influenciada pelos factores ambientais. As guelras revelaram susceptibilidade à contaminação por mercúrio, uma vez que se verificou uma tendência para o decréscimo da actividade de CAT em L2 e ausência de indução em L1. O fígado e o rim demonstraram mecanismos adaptativos face ao grau de contaminação moderada (L1), evidenciados pelo aumento de CAT. O rim também demonstrou adaptabilidade face ao grau elevado de contaminação (L2), uma vez que se verificou um aumento GST. Embora o grau de susceptibilidade tenha sido diferente entre os órgãos, não se verificou peroxidação lipídica em nenhum. A determinação do conteúdo em MTs em D. labrax e em L. aurata revelou que este parâmetro depende não só da espécie, mas também do tecido em causa. Assim, em D. labrax foi observado um decréscimo de MTs no cérebro, bem como a incapacidade de síntese de MTs no sangue, guelras, fígado, rim e músculo. Em L. aurata observou-se um aumento do conteúdo em MTs no fígado e no músculo. Estes resultados indicam que a aplicabilidade das MTs como biomarcador de exposição ao mercúrio parece ser incerta, revelando limitações na capacidade de reflectir os níveis de exposição ao metal e por consequência o grau de acumulação. Este trabalho comprova a necessidade de se integrarem estudos de bioacumulação com biomarcadores de efeitos, de modo a reduzir os riscos de interpretações erróneas, uma vez que as respostas nem sempre ocorrem para os níveis mais altos de contaminação ambiental com mercúrio.

Lichenicidin biosynthesis and search for novel antibacterial peptides

A estirpe Bacillus licheniformis I89 possui a capacidade de produzir alguns compostos com actividade antibacteriana. No presente estudo, a separação desses compostos foi realizada através da aplicação de vários procedimentos, incluindo extracção em fase sólida e cromatografia liquida de alta pressão. Dois destes compostos bioactivos constituem o lantibiótico de classe II lichenicidina e são caracterizados pela massas molecular de 3250 Da (Bliα) e 3020 Da (Bliβ). O cluster responsável pela biossíntese da lichenicidina foi heterologamente expresso em Escherichia coli, constituindo a primeira descrição da produção de um lantibiótico totalmente in vivo num hospedeiro Gram-negativo. Este sistema foi subsequentemente explorado com o objectivo de relacionar cada proteína codificada no cluster genético da lichenicidina na produção dos péptidos Bliα e Bliβ. O desenvolvimento do sistema de trans complementação possibilitou a produção de variantes destes péptidos. A análise das massas moleculares destas variantes assim como a análise dos padrões de fragmentação obtidos por MS/MS permitiu a revisão de algumas das características estruturais previamente proposta para Bliα e Bliβ. A análise dos genes hipoteticamente envolvidos na protecção da estirpe produtora contra a acção antibiótica da lichenicidina revelou, que em E. coli, a sua ausência não resulta no aumento da susceptibilidade a este composto. Verificou-se também que a presença destes genes não é essencial para a produção de lichenicidina em E. coli. Foi também confirmado experimentalmente que a membrana externa da E. coli constitui uma barreira natural para a entrada dos péptidos na célula. De facto, uma das características intrigantes da produção de lichenicidina por uma bactéria de Gram negativo reside no mecanismo de transporte dos dois péptidos através da membrana externa. Neste estudo foi demonstrado que na ausência da proteína de membrana TolC, a massa molecular de Bliα e Bliβ não foi identificada no sobrenadante de E. coli, demonstrando assim que a sua presença no ambiente extra-celular não se devia a um processo de lise bacteriana. Foi ainda avaliada a capacidade da maquinaria biossintética da lichenicidina para produzir o lantibiótico haloduracina, através do processamento de chimeras lichenicidina-haloduracina, contudo, os resultados foram negativos. Verificou-se ainda que em determinadas condições de incubação, a diferenciação da morfologia original da estirpe B. licheniformis I89 pode ocorrer. Esta dissociação implicou a transição da colónia parental e rugosa para uma colónia de aparência mais simples e suave. Desta forma, as diferenças das duas morfologias em termos de taxa de crescimento, esporulação e actividade antibiótica foram investigadas. Considerando especificamente Bliα e Bliβ verificou-se que a abundância destes péptidos nas culturas do fenótipo fino é geralmente inferior aquela identificada nas culturas do fenótipo parental. Por último, a diversidade de elementos genéticos constituintes de péptido sintetases não ribossomais (NRPS) foi investigada em lagoas no centro de Portugal e em solos provenientes de caves do sul de Portugal, revelando a presença de potenciais novas NRPS nestes ambientes.

Carcinoma da nasofaringe: aspectos epidemiológicos clínicos e moleculares

Após uma revisão de aspectos filogénicos, ontogénicos e embriológicos contribuindo para a estruturação anatómica e fisiológica da nasofaringe, é efectuada uma análise das características clínicas do carcinoma da nasofaringe numa população portuguesa, comparando-as com a literatura. É efectuada análise de taxa de incidência da doença, razão de géneros, frequência relativa dos diversos subtipos de acordo com a classificação OMS, acuidade relativa dos estadiamentos TMN e sobrevivência em função do tratamento. A relação entre carcinoma da nasofaringe e infecção pelo vírus de Epstein – Barr em Portugal é estudada através da análise de detecção de DNA de EBV em tecido tumoral da nasofaringe e sangue periférico de doentes com NPC e em indivíduos saudáveis. São também efectuados estudos caso-controlo no sentido de perspectivar a relevância de dois polimorfismos genéticos na susceptibilidade genética para a doença. Esta Dissertação pretende ainda contribuir para a compreensão dos mecanismos biológicos de CN e a sua relação com o EBV numa região não endémica de baixo risco, como é Portugal, realçando a relevância da definição de um perfil biológico preditivo para o desenvolvimento de CN na população portuguesa.

Aluminium toxicity in wheat and rye

Com o presente trabalho pretendeu-se determinar e compreender melhor quais os alvos do Alumínio (Al) nas plantas, e contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos de tolerância presentes em genótipos com elevado grau de tolerância ao Al. O Al é um dos maiores constituintes do solo e torna-se biodisponível em solos com baixo pH. Nesses casos, a exposição ao Al afecta negativamente o crescimento das plantas conduzindo a uma diminuição da produção. Estes factos são especialmente visíveis nos cereais, sendo a exposição ao Al uma das principais causas das quebras de produção nestas espécies. O Capítulo I consiste numa revisão geral sobre a toxicidade do Al nas plantas, apontando os seus principais alvos. Apresenta também os mecanismos de resistência, que inclui Al-destoxificação externa e interna, em diferentes espécies. O Capítulo II aborda os estudos sobre a exposição de curto prazo ao Al em duas espécies de cereais: Triticum aestivum L. e Secale cereale L., tendo-se sempre utilizado um genótipo Al-tolerante e um Al-sensível para cada espécie. Este capítulo está dividido em três estudos: no Capítulo II.1 realça-se o efeito da exposição a 185 μM de Al no equilíbrio nutricional em trigo. Verificou-se que em ambos os genótipos (sensível e tolerante) o perfil de macro e micro nutrientes se alterou, tendo uma interferência negativa, sobretudo no nível de P, Mg e K. Além disso, registaram-se diferenças na diferenciação da endoderme consoante o grau de tolerância/sensibilidade do genótipo. No Capítulo II.2 apresenta-se uma visão mais abrangente dos efeitos da exposição a 185 μM de Al em trigo, incluindo parâmetros fisiológicos, estruturais, citológicos e genotóxicos. Demonstra-se, pela primeira vez, que a progressão do ciclo celular é diferentemente regulada, dependendo da tolerância/sensibilidade do genótipo e que, mesmo em zonas já diferenciadas da raiz a exposição ao Al leva à deposição de calose. O Capítulo II.3 aborda os efeitos da exposição de 1.1 mM de Al em centeio, numa perspectiva bastante alargada. Apresenta-se o desequilíbrio nutricional, sobretudo no genótipo sensível, assim como a translocação de Al para a parte aérea nesse mesmo genótipo. Analisa-se também o comportamento de ambos os genótipos no que se refere ao ciclo celular, diferenciação da endoderme, crescimento radicular, reservas de hidratos de carbono, entre outros. Os resultados apontam para estratégias bem definidas adoptadas pelo genótipo tolerante de forma a minimizar a acção do Al no sistema radicular. O Capítulo III compreende a exposição longa ao Al. Dois genótipos de centeio com diferentes graus de tolerância ao Al foram expostos a 1.11 mM e 1.85 mM de Al durante 21 dias, tendo sido usados dois pontos de amostragem (15 e 21 dias). Este capítulo está dividido em dois estudos: No Capítulo III. 1 analisamse os mecanismos antioxidantes (folhas e raízes) como resposta à exposição ao Al, dando-se especial atenção ao ciclo do ascorbato-glutationas. A exposição ao Al levou a stress oxidativo e a alterações na actividade de enzimas antioxidantes e no conteúdo de antioxidantes não-enzimáticos. Demonstra-se que os dois órgãos apresentam respostas diferentes à exposição ao Al e que a capacidade de sobreviver em ambientes ricos em Al depende da eficácia da resposta antioxidante. Para além disso, a resposta do ciclo ascorbato-glutationas parece estar dependente do tipo de órgão, grau de tolerância e do tempo de exposição ao Al. No Capítulo III. 2 analisam-se os efeitos da exposição ao Al na fotossíntese. Verificou-se que o Al afecta negativamente a taxa fotossintética em ambos os genótipos, embora as alterações que o Al provoca nas trocas gasosas e no Ciclo de Calvin sejam dependentes do genótipo. Verificou-se também que os danos no genótipo sensível surgem mais cedo do que no genótipo tolerante, mas que ambos apresentam susceptibilidade ao Al após exposição de longo termo. Por fim, no Capítulo IV são apresentadas as conclusões da Tese de Doutoramento.

Carbapenemases of Serratia fonticola UTAD54

As carbapenemases, serínicas e metalo-β-lactamases (MBLs), formam um grupo cada vez mais importante de β-lactamases capazes de tornar as bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos, incluindo carbapenemos utilizados como antibióticos de último recurso no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes. De modo a compreender melhor a relação estrutura-função deste grupo de enzimas, prosseguimos com a caracterização bioquímica e estrutural das carbapenemases SFC-1 e Sfh-I específicas de Serratia fonticola UTAD54, uma estirpe ambiental isolada previamente de águas de consumo não tratadas no Nordeste de Portugal. Ambas as β-lactamases foram sobre-expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia líquida. A SFC-1 recombinante, uma carbapenemase serínica, hidrolisa eficientemente antibióticos β-lactâmicos de todas as classes e exibe, comparativamente a enzimas relacionadas (ex. KPC), uma maior eficiência contra a ceftazidima e uma menor susceptibilidade aos inibidores convencionais das β-lactamases. As estruturas do cristal da SFC-1 nativa e de complexos de mutantes, obtidos por mutagénese dirigida, com o meropenemo não hidrolisado e na forma de acetilenzima foram determinados por substituição molecular utilizando cristalografia de raios-X. A estrutura da SFC-1 contém todas as características conservadas do centro activo das carbapenemases de classe A. Nas estruturas dos mutantes o meropenemo aparece orientado no centro activo por Thr236 e Thr238, posicionando-o próximo da Ser130 para a transferência do protão. Nas enzimas de classe A inibidas por carbapenemos, a interacção com a Arg244 impõe uma orientação diferente do meropenemo ligado, prejudicando a transferência do protão. Estas constituem as primeiras estruturas de uma carbapenemase de classe A com um carbapenemo no centro activo e revelam que estas enzimas alteram a orientação do meropenemo ligado para promover a catálise, sem alteração significativa da estrutura geral. A Sfh-I, tal como as outras MBLs da subclasse B2, apresenta um perfil de substratos reduzido, que inclui maioritariamente os carbapenemos. A Sfh-I hidrolisa imipenemo e meropenemo com um kcat de 51 e 109 s-1 e um KM de 79 e 215 μM, respectivamente. A Sfh-I liga um equivalente de zinco, como demonstrado por espectrometria de massa. Contrariamente a enzimas da subclasse B2 previamente caracterizadas, a Sfh-I hidrolisa a cefepima, mostrando que a Sfh-I é uma MBL da subclasse B2 com propriedades únicas. Por espectroscopia de fluorescência mostrou-se que a Sfh-I é capaz de ligar até 3 equivalentes de zinco (Kd2 = 95 μM; Kd3 = 2.3 mM). A estrutura do cristal da Sfh-I, determinada por substituição molecular utilizando a CphA como modelo, é a primeira para uma MBL da subclasse B2 não ligada. Esta estrutura revela a disposição das moléculas de água no centro activo corroborando um mecanismo catalítico para as MBLs da subclasse B2 no qual a His118, em vez do Asp120 proposto anteriormente, activa a molécula de água nucleofílica.

Multifunctional nanoparticles for MR and fluorescence imaging

In the past few years a new generation of multifunctional nanoparticles (NPs) has been proposed for biomedical applications, whose structure is more complex than the structure of their predecessor monofunctional counterparts. The development of these novel NPs aims at enabling or improving the performance in imaging, diagnosis and therapeutic applications. The structure of such NPs comprises several components exhibiting various functionalities that enable the nanoparticles to perform multiple tasks simultaneously, such as active targeting of certain cells or compartmentalization, imaging and delivery of active drugs. This thesis presents two types of bimodal bio-imaging probes and describes their physical and chemical properties, namely their texture, structure, and 1H dynamics and relaxometry, in order to evaluate their potential as MRI contrast agents. The photoluminescence properties of these probes are studied, aiming at assessing their interest as optical contrast agents. These materials combine the properties of the trivalent lanthanide (Ln3+) complexes and nanoparticles, offering an excellent solution for bimodal imaging. The designed T1- type contrast agent are SiO2@APS/DTPA:Gd:Ln or SiO2@APS/PMN:Gd:Ln (Ln= Eu or Tb) systems, bearing the active magnetic center (Gd3+) and the optically-active ions (Eu3+ and Tb3+) on the surface of silica NPs. Concerning the relaxometry properties, moderate r1 increases and significant r2 increases are observed in the NPs presence, especially at high magnetic fields, due to susceptibility effects on r2. The Eu3+ ions reside in a single low-symmetry site, and the photoluminescence emission is not influenced by the simultaneous presence of Gd3+ and Eu3+. The presence of Tb3+, rather than Eu3+ ion, further increases r1 but decreases r2. The uptake of these NPs by living cells is fast and results in an intensity increase in the T1-weighted MRI images. The optical features of the NPs in cellular pellets are also studied and confirm the potential of these new nanoprobes as bimodal imaging agents. This thesis further reports on a T2 contrast agent consisting of core-shell NPs with a silica shell surrounding an iron oxide core. The thickness of this silica shell has a significant impact on the r2 and r2* relaxivities, and a tentative model is proposed to explain this finding. The cell viability and the mitochondrial dehydrogenase expression given by the microglial cells are also evaluated.

Soluções para a construção de habitação em adobe a custos controlados

Dados recentes mostram que o desmatamento da caatinga, um dos principais biomas brasileiros, está atingindo níveis alarmantes, principalmente devido a sua vulnerabilidade e forte tendência à desertificação. Entre os dez municípios brasileiros que mais desmataram a caatinga, segundo o Ministério do Meio Ambiente, quatro se encontram no Ceará. Estudos mostram que entre as principais causas do desmatamento está o uso da mata nativa para lenha e carvão, sobretudo para a queima de tijolos em olarias clandestinas. Procurando estudar a questão da aplicabilidade de construções sustentáveis no Nordeste Brasileiro, o presente trabalho faz um levantamento detalhado sobre construções em terra crua (adobe) na região, em especial no Estado que mais contribuiu com o desmatamento. Em assim sendo, realizou-se uma extensa pesquisa aos acervos públicos e oito expedições rodoviárias, entre 2009 e 2011, e totalizando cerca de 7.000 km rodados, às regiões norte e nordeste do Estado do Ceará. Foram coletadas amostras de terra e de adobe para ensaios nos laboratórios da Universidade Federal do Ceará (UFC) e feita ampla documentação fotográfica com aplicação de questionários em 14localidades. Foram levantados dados de vários aspectos relevantes para a pesquisa, quais sejam: composição da terra, granulometria, processos de secagem do adobe, resistência mecânica à compressão, além de aspectos ligados ao detalhamento do revestimento, traço de rebocos e detalhes de fundação. A análise dos dados coletados permitiu compreender a construção em adobe na região, no seu contexto cultural. Esta pesquisa pode ajudar na manutenção de um sistema construtivo ambiental, cultural e economicamente sustentável, através da busca por um caminho de reavaliação das possibilidades de adaptações técnicas à casa típica do semiárido cearense.

Resistance to last-resort antibiotics in natural environments

Last-resort antibiotics are the final line of action for treating serious infections caused by multiresistant strains. Over the years the prevalence of resistant bacteria has been increasing. Natural environments are reservoirs of antibiotic resistance, highly influenced by human-driven activities. The importance of aquatic systems on the evolution of antibiotic resistance is highlighted from the assumption that clinically-relevant resistance genes have originated in strains ubiquitous in these environments. We hypothesize that: a) rivers are reservoirs and disseminators of antibiotic resistance; b) anthropogenic activities potentiate dissemination of resistance to last-resort antibiotics. Hence, the main goal of the work is to compare the last-resort antibiotics resistome, in polluted and unpolluted water. Rivers from the Vouga basin, exposed to different anthropogenic impacts, were sampled. Water quality parameters were determined to classify rivers as unpolluted or polluted. Two bacterial collections were established enclosing bacteria resistant to cefotaxime (3rd generation cephalosporin) and to imipenem (carbapenem). Each collection was characterized regarding: phylogenetic diversity, antibiotic susceptibility, resistance mechanisms and mobile genetic elements. The prevalence of cefotaxime- and imipenem-resistant bacteria was higher in polluted water. Results suggested an important role in the dissemination of antibiotic resistance for Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Aeromonas. The occurrence of bacteria resistant to non-beta-lactams was higher among isolates from polluted water as also the number of multiresistant strains. Among strains resistant to cefotaxime, extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) genes were detected (predominantly blaCTX-M-like) associated to mobile genetic elements previously described in clinical strains. ESBL-producers were often multiresistant as a result of co-selection mechanisms. Culture-independent methods showed clear differences between blaCTX-M-like sequences found in unpolluted water (similar to ancestral genes) and polluted water (sequences identical to those reported in clinical settings). Carbapenem resistance was mostly related to the presence of intrinsically resistant bacteria. Yet, relevant carbapenemase genes were detected as blaOXA-48-like in Shewanella spp. (the putative origin of these genes), and blaVIM-2 in Pseudomonas spp. isolated from polluted rivers. Culture-independent methods showed an higher than the previously reported diversity of blaOXA-48-like genes in rivers. Overall, clear differences between polluted and unpolluted systems were observed, regarding prevalence, phylogenetic diversity and susceptibility profiles of resistant bacteria and occurrence of clinically relevant antibiotic resistance genes, thus validating our hypotheses. In this way, rivers act as disseminators of resistance genes, and anthropogenic activities potentiate horizontal gene transfer and promote the constitution of genetic platforms that combine several resistance determinants, leading to multiresistance phenotypes that may persist even in the absence of antibiotics.