The t-SNAREs syntaxin 1 and SNAP-25 are present on organelles that participate in synaptic vesicle recycling

Syntaxin 1 and synaptosome-associated protein of 25 kD (SNAP-25) are neuronal plasmalemma proteins that appear to be essential for exocytosis of synaptic vesicles (SVs). Both proteins form a complex with synaptobrevin, an intrinsic membrane protein of SVs. This binding is thought to be responsible for vesicle docking and apparently precedes membrane fusion. According to the current concept, syntaxin 1 and SNAP-25 are members of larger protein families, collectively designated as target-SNAP receptors (t-SNAREs), whose specific localization to subcellular membranes define where transport vesicles bind and fuse. Here we demonstrate that major pools of syntaxin 1 and SNAP-25 recycle with SVs. Both proteins cofractionate with SVs and clathrin-coated vesicles upon subcellular fractionation. Using recombinant proteins as standards for quantitation, we found that syntaxin 1 and SNAP-25 each comprise approximately 3% of the total protein in highly purified SVs. Thus, both proteins are significant components of SVs although less abundant than synaptobrevin (8.7% of the total protein). Immunoisolation of vesicles using synaptophysin and syntaxin specific antibodies revealed that most SVs contain syntaxin 1. The widespread distribution of both syntaxin 1 and SNAP-25 on SVs was further confirmed by immunogold electron microscopy. Botulinum neurotoxin C1, a toxin that blocks exocytosis by proteolyzing syntaxin 1, preferentially cleaves vesicular syntaxin 1. We conclude that t-SNAREs participate in SV recycling in what may be functionally distinct forms.

Eficiência de índices fenotípicos de comprimento de raiz seminal na avaliação de plantas individuais de milho quanto à tolerância ao alumínio

O objetivo deste trabalho foi testar a eficiência do comprimento relativo de raiz seminal (CRRS) e do comprimento líquido de raiz seminal (CLRS) como indicadores fenotípicos quanto à tolerância ao alumínio na avaliação de plantas individuais de milho. Plântulas de genótipos tolerantes e suscetíveis ao Al foram submetidas a solução nutritiva contendo nível tóxico deste elemento, por um período de sete dias, após o qual, determinaram-se os valores de CRRS e CLRS. Os resultados obtidos quando se utilizaram valores médios para CRRS e CLRS mostraram que ambos os índices foram capazes de discriminar com eficiência os materiais tolerantes dos suscetíveis. Entretanto, quando foram utilizados os valores de CRRS e CLRS obtidos a partir de plantas individuais, observou-se a existência de plantas tolerantes com valores típicos de plantas suscetíveis, o que indica que a avaliação fenotípica de plantas individuais pelos dois índices está sujeita a erros significativos, principalmente na caracterização de plantas suscetíveis. Portanto, em estudos para mapeamento de "quantitative trait loci" (QTLs) ligados à tolerância ao Al, nos quais utilizam-se estes índices fenotípicos, o mais apropriado é avaliar famílias F3, onde é possível obter valores médios para CRRS e CLRS e utilizar estas médias para representar os valores fenotípicos das respectivas plantas F2.

SDF 1-alpha (CXCL12) triggers glutamate exocytosis from astrocytes on a millisecond time scale: Imaging analysis at the single-vesicle level with TIRF microscopy

Chemokines are small chemotactic molecules widely expressed throughout the central nervous system. A number of papers, during the past few years, have suggested that they have physiological functions in addition to their roles in neuroinflammatory diseases. In this context, the best evidence concerns the CXC-chemokine stromal cell-derived factor (SDF-1alpha or CXCL12) and its receptor CXCR4, whose signalling cascade is also implicated in the glutamate release process from astrocytes. Recently, astrocytic synaptic like microvesicles (SLMVs) that express vesicular glutamate transporters (VGLUTs) and are able to release glutamate by Ca(2+)-dependent regulated exocytosis, have been described both in tissue and in cultured astrocytes. Here, in order to elucidate whether SDF-1alpha/CXCR4 system can participate to the brain fast communication systems, we investigated whether the activation of CXCR4 receptor triggers glutamate exocytosis in astrocytes. By using total internal reflection (TIRF) microscopy and the membrane-fluorescent styryl dye FM4-64, we adapted an imaging methodology recently developed to measure exocytosis and recycling in synaptic terminals, and monitored the CXCR4-mediated exocytosis of SLMVs in astrocytes. We analyzed the co-localization of VGLUT with the FM dye at single-vesicle level, and observed the kinetics of the FM dye release during single fusion events. We found that the activation of CXCR4 receptors triggered a burst of exocytosis on a millisecond time scale that involved the release of Ca(2+) from internal stores. These results support the idea that astrocytes can respond to external stimuli and communicate with the neighboring cells via fast release of glutamate.

Germinação de sementes de jenipapo: temperatura, substrato e morfologia do desenvolvimento pós-seminal

O presente trabalho teve como objetivos definir o tipo de substrato e a temperatura mais adequados à germinação de sementes de jenipapo (Genipa americana L.), conhecer a morfologia das sementes e seu desenvolvimento pós-seminal, caracterizando as plântulas normais, o tipo de germinação e os padrões de anormalidade. Para tanto, realizou-se um experimento colocando-se as sementes sobre os seguintes substratos: papel, vermiculita e solo, nas temperaturas constantes de 20°C, 25°C, 30°C, e 35°C e alternada de 20°C-30°C. O delineamento estatístico empregado foi o inteiramente casualizado (5 x 3), com quatro repetições de 50 sementes. Foram analisados os parâmetros germinação normal (%) e velocidade de germinação. Os melhores resultados foram obtidos nas temperaturas constantes de 25°C, 30°C e 35°C, e nos substratos vermiculita e solo.

Disturbed local auxin homeostasis enhances cellular anisotropy and reveals alternative wiring of auxin-ethylene crosstalk in Brachypodium distachyon seminal roots.

Observations gained from model organisms are essential, yet it remains unclear to which degree they are applicable to distant relatives. For example, in the dicotyledon Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), auxin biosynthesis via indole-3-pyruvic acid (IPA) is essential for root development and requires redundant TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS 1 (TAA1) and TAA1-RELATED (TAR) genes. A promoter T-DNA insertion in the monocotyledon Brachypodium distachyon (Brachypodium) TAR2-LIKE gene (BdTAR2L) severely down-regulates expression, suggesting reduced tryptophan aminotransferase activity in this mutant, which thus represents a hypomorphic Bdtar2l allele (Bdtar2l(hypo) ). Counterintuitive however, Bdtar2l(hypo) mutants display dramatically elongated seminal roots because of enhanced cell elongation. This phenotype is also observed in another, stronger Bdtar2l allele and can be mimicked by treating wild type with L-kynerunine, a specific TAA1/TAR inhibitor. Surprisingly, L-kynerunine-treated as well as Bdtar2l roots display elevated rather than reduced auxin levels. This does not appear to result from compensation by alternative auxin biosynthesis pathways. Rather, expression of YUCCA genes, which are rate-limiting for conversion of IPA to auxin, is increased in Bdtar2l mutants. Consistent with suppression of Bdtar2l(hypo) root phenotypes upon application of the ethylene precursor 1-aminocyclopropane-1-carboxylic-acid (ACC), BdYUCCA genes are down-regulated upon ACC treatment. Moreover, they are up-regulated in a downstream ethylene-signaling component homolog mutant, Bd ethylene insensitive 2-like 1, which also displays a Bdtar2l root phenotype. In summary, Bdtar2l phenotypes contrast with gradually reduced root growth and auxin levels described for Arabidopsis taa1/tar mutants. This could be explained if in Brachypodium, ethylene inhibits the rate-limiting step of auxin biosynthesis in an IPA-dependent manner to confer auxin levels that are sub-optimal for root cell elongation, as suggested by our observations. Thus, our results reveal a delicate homeostasis of local auxin and ethylene activity to control cell elongation in Brachypodium roots and suggest alternative wiring of auxin-ethylene crosstalk as compared to Arabidopsis.

Substrato, temperatura de germinação e desenvolvimento pós-seminal de sementes de Dalbergia nigra

O objetivo deste trabalho foi definir o tipo de substrato e a temperatura mais adequada à germinação de sementes de Dalbergia nigra (Vell.) Fr. All. Ex Benth (jacarandá-da-bahia), e conhecer a morfologia de seu desenvolvimento pós-seminal e caracterizar as plântulas normais, o tipo de germinação e os padrões de anormalidade. As sementes foram semeadas nos substratos sobre papel, rolo de papel e sobre vermiculita, nas temperaturas constantes de 20, 25, 30 e 35°C e alternadas de 20-30°C e 20-35°C. O delineamento estatístico empregado foi o inteiramente casualizado (6x3), com quatro repetições de 50 sementes. Foram analisados os seguintes parâmetros: porcentagem de germinação normal (plântulas normais) e velocidade de emergência de plântulas. Os melhores resultados foram verificados nas temperaturas de 25°C e 20-30°C, nos substratos sobre vermiculita e rolo de papel. Plântulas normais foram caracterizadas como faneroepígeas em relação ao tipo de germinação.

Biotecnología de la Reproducción Porcina: Estado actual y futuro de las técnicas de análisis seminal

Estat actual i futur de les tècniques d'anàlisi seminal

Caracterização morfológica de frutos e sementes e desenvolvimento pós-seminal de Tamarindus indica L. - Leguminosae: caesalpinioideae

O tamarindeiro (Tamarindus indica L.) pertence à família Leguminosae e é uma árvore frutífera, nativa da África tropical, de onde se dispersou por todas as regiões tropicais do mundo. A caracterização morfológica de frutos e sementes é importante para identificação das espécies, bem como serve de base para estudos que visem a maiores conhecimentos ligados à germinação e vigor. Este trabalho teve por objetivo descrever a morfologia de frutos, sementes e plântulas, bem como caracterizar o processo germinativo de Tamarindus indica L. Para o estudo do fruto, foram observados tipo, cor, dimensões, textura e consistência do pericarpo e deiscência e número de sementes por fruto. Os aspectos observados nas sementes foram: cor, dimensões, textura e consistência dos tegumentos; e forma, borda, posição do hilo e de outras estruturas presentes e características do embrião. O estádio de plântula foi considerado quando os protófilos já estavam totalmente formados. Os elementos vegetativos descritos e ilustrados foram radícula, coleto, hipocótilo, cotilédones, epicótilo, protófilos e caule. O fruto de Tamarindus indica é um legume indeiscente medindo aproximadamente 7,3 a 9,2 cm e contendo de 1 a 11 sementes. O eixo embrionário encontra-se inserido nos cotilédones, sendo axial e invaginado. A germinação da semente é do tipo epígea. A plântula apresenta protófilos compostos de seis a nove pares de folíolos pequenos opostos e glabros.

A análise seminal deve ser requisitada para homens com histórico de fertilidade prévia?

OBJETIVOS: determinar se a história prévia de fertilidade pode predizer o atual status de fertilidade de um paciente masculino examinado por infertilidade do casal. MÉTODOS: estudo retrospectivo envolvendo análises seminais de 183 pacientes consecutivos subférteis avaliados entre setembro de 2002 e março de 2004. Foram excluídos do estudo os pacientes que haviam se submetido a radioterapia, quimioterapia, orquiectomia ou vasectomia. Os valores médios de todas as análises foram usados em pacientes com múltiplas análises de sêmen. Pacientes com concentração espermática superior a 20x10(6) espermatozóides/mL, motilidade superior a 50% e espermatozóides com morfologia estrita superior a 14% foram considerados normais. Os pacientes foram divididos em dois grupos, segundo o status de fertilidade: infertilidade primária (118 pacientes) e infertilidade secundária (65 pacientes). Os dados foram analisados pelos testes estatísticos chi2 e teste t de Student. RESULTADOS: não houve diferença na idade média entre os pacientes com infertilidade primária, 37,3±6,3, e infertilidade secundária, 38,1±5,9; p=0,08. No grupo de pacientes com infertilidade primária, 51,9% (61 pacientes) tiveram uma concentração espermática normal, 70,3% (83 pacientes) tiveram a motilidade espermática normal e 26,37% (31 pacientes), por sua vez, morfologia normal. No grupo de pacientes com infertilidade secundária, 53,8% (35 pacientes) tiveram concentração espermática normal, 75,4% (49 pacientes) tiveram motilidade espermática normal e 32,3% (21 pacientes), morfologia normal. Nenhuma diferença significativa foi detectada na concentração espermática (21,3x10(6)/mL versus 23,1x10(6)/mL; p=0,07), motilidade (45,2 versus 48,1%; p=0,08) e morfologia (6,1 versus 6,4%; p=0,09) entre os grupos de pacientes com infertilidade primária e secundária. CONCLUSÕES: a análise seminal deve ser solicitada mesmo em casos de fertilidade masculina prévia. Os médicos não devem presumir que um paciente possui uma análise seminal normal, baseados no fato de este possuir história de estabelecimento de uma gravidez no passado.

Obtenção de gametas seguros por meio de associação de técnicas de processamento seminal para casais sorodiscordantes para HIV

RESUMO OBJETIVO: o objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros laboratoriais e clínicos de pacientes submetidos à reprodução humana assistida, associando técnicas de processamento seminal para eliminação de partículas virais da amostra de sêmen em casais nos quais o homem é infectado pelo vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV). MÉTODOS: foram avaliados 11 ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) realizados em casais nos quais os homens eram infectados pelo HIV (Grupo HIV), e 35 ciclos de ICSI nos quais se utilizaram espermatozóides doados (Grupo Controle). As amostras de sêmen dos doadores foram submetidas à análise seminal completa, processamento seminal (lavagem) e criopreservação. Os homens do Grupo HIV receberam antibioticoterapia prévia e realizou-se análise seminal, lavagem e gradiente descontínuo de densidade antes da criopreservação. As amostras foram avaliadas para carga viral e a ICSI foi realizada quando não houve detecção do HIV. RESULTADOS: quanto aos resultados da análise seminal, os grupos se mostraram comparáveis em relação à concentração e motilidade progressiva dos espermatozóides. Entretanto, a porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais foi maior no Grupo Controle (14,3%) comparado ao HIV (5,8%; p=0,002). Na avaliação dos parâmetros embrionários, as taxas de fertilização normal (Controle: 74,7% e HIV: 71,7; p=0,838) e de bons embriões (Controle: 42,4% e HIV: 65,1%; p=0,312) foram semelhantes. Por outro lado, o Grupo Controle apresentou melhores resultados clínicos que o HIV (gestação continuada: 52,9 e 12,5%; p=0,054; implantação: 42,6 e 10,4%; p=0,059, respectivamente), apesar de as diferenças não serem estatisticamente significantes. Após o nascimento, não houve soroconversão das mães e das crianças nascidas. CONCLUSÕES: a associação de técnicas de processamento seminal para eliminação do HIV de amostras seminais não interferiu nos parâmetros laboratoriais de ciclos de reprodução humana assistida. Por outro lado, demonstrou excelentes resultados na obtenção de gametas seguros para casais sorodiscordantes.

Interferência da idade sobre a qualidade seminal

OBJETIVO: avaliar a influência da idade sobre a qualidade seminal de homens com quadro de infertilidade conjugal submetidos a análises espermáticas em um serviço de reprodução humana. MÉTODOS: estudo retrospectivo, no qual foram avaliados os espermogramas de todos os homens em processo de investigação para infertilidade conjugal no período de Setembro de 2002 a Dezembro de 2004, em um serviço de reprodução assistida do nordeste do Brasil. Foram incluídos 531 indivíduos submetidos a 531 avaliações espermáticas. Foram analisados os seguintes parâmetros: volume, concentração, motilidade e morfologia espermática. O total de investigados foi dividido em grupos, de acordo com resultados obtidos de cada variável estudada. Os grupos referentes ao volume seminal foram: hipoespermia, normoespermia e hiperespermia. Os grupos referentes à concentração espermática foram: azoospermia, oligoospermia, normospermia e poliespermia. Os grupos referentes à motilidade foram: motilidade normal e astenospermia. Os grupos referentes à morfologia foram: morfologia normal e teratospermia. As médias das idades dos pacientes entre os grupos com parâmetros normais foram comparadas com as de grupos alterados, sendo utilizado o teste t. Para análise estatística, foi utilizado o programa XLSTAT (p<0,05). RESULTADOS: os indivíduos estudados tinham média de idade de 37±7,9 anos, com um volume seminal médio de 3±1,4 mL, uma concentração espermática de 61,4±66,4 espermatozóides por mL de sêmen, motilidade progressiva de 44,7±19,4% do total de espermatozóides e morfologia normal de 11,2±6,6% dos espermatozóides. As médias de idade entre os grupos foram semelhantes, exceto a média dos indivíduos com hipoespermia, que foi significativamente maior que a dos homens com normoespermia (39,6±10,3 versus 36,5±7,3, p=0,001). CONCLUSÕES: a idade interfere, de forma inversamente proporcional, sobre o volume do ejaculado, porém não exerce influência na concentração, motilidade e morfologia espermática.

Estrutura do tegumento seminal de quatro espécies de Leguminosae (Caesalpinioideae), ocorrentes numa área de caatinga (PE ­ Brasil)

Neste estudo observou-se que os tegumentos seminais de Caesalpinia ferrea, C. pyramidalis, Senna martiana e S. spectabilis var. excelsa estão compostos de um estrato de macrosclereídes, revestido por cutícula e subcutícula, seguido por uma camada de osteosclereídes, parênquima esclerificado e camada interna também de osteosclereídes. A impermeabilidade dos tegumentos seminais, possivelmente, se restringe à região das macroesclereídes.

Desenvolvimento do rudimento seminal em Borreria verticillata (L.) G. Mey. (Rubiaceae - Rubioideae - Spermacoceae)

O uso de caracteres embriológicos tem-se mostrado promissor para relacionar subfamílias, tribos, gêneros e espécies de Rubiaceae. A partir da ginosporogênese (megasporogênese) e formação do rudimento seminal (óvulo) de Borreria verticillata (L.) G. Mey. este trabalho visa enquadrar a espécie nas propostas evolutivas já existentes para Rubiaceae, além de disponibilizar informações para a taxonomia do gênero. A espécie possui ovário ínfero, bilocular e bicarpelar, com um rudimento seminal por lóculo, que, em seu desenvolvimento completo, é anátropo, unitegumentado e tenuinucelado, disposto em placentação axial. O primórdio seminal possui três camadas: dérmica, subdérmica e central. O início da formação do rudimento se dá por divisões não preferenciais da camada central. Em seguida, células derivadas da camada dérmica originam o tegumento e a epiderme nucelar. O arquespório é composto por uma a cinco células arquesporiais e a epiderme nucelar por duas a três células. Do conjunto de células arquesporiais, de uma a três se desenvolvem em células-mãe de ginósporos (células-mãe de megásporos), cuja meiose origina uma tétrade linear, sendo funcional o ginósporo (megásporo) calazal. Comparando os resultados obtidos com a literatura especializada enquadra-se B. verticillata no tipo Mitracarpus, devido à presença de remanescentes do tegumento externo, inclusão do nucelo na calaza, ao número reduzido de células alongadas na epiderme nucelar e ao incremento das células arquesporiais.

Germinação de Pyrostegia venusta (Bignoniaceae), viabilidade de sementes e desenvolvimento pós-seminal

O efeito da luz e da temperatura na germinação de Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers foi estudado por meio de incubações isotérmicas. As sementes da espécie não são fotoblásticas, podendo germinar igualmente na presença e na ausência de luz. A temperatura mínima para a germinação está entre 10 e 15 °C e a máxima entre 35 e 40 °C. As maiores taxas de germinação foram obtidas na temperatura de 35 °C, apesar de não haver diferenças estatisticamente significativas na germinabilidade em temperaturas de 25, 30 e 35 °C. A 25 °C, a germinação tem início no 7º dia, enquanto o desenvolvimento do primeiro par foliar ocorre a partir do 22º dia de experimento. A viabilidade das sementes é mais bem mantida quando estas são armazenadas em recipientes de vidro a baixas temperaturas. A germinação em uma ampla faixa de temperatura, e a ausência de fotoblastismo permitem que a espécie germine em áreas abertas e sombreadas, propiciando sua distribuição pelas diferentes fisionomias do bioma Cerrado.

Synaptic vesicle pool size, release probability and synaptic depression are sensitive to Ca2+ buffering capacity in the developing rat calyx of Held

The calyx of Held, a specialized synaptic terminal in the medial nucleus of the trapezoid body, undergoes a series of changes during postnatal development that prepares this synapse for reliable high frequency firing. These changes reduce short-term synaptic depression during tetanic stimulation and thereby prevent action potential failures during a stimulus train. We measured presynaptic membrane capacitance changes in calyces from young postnatal day 5-7 (p5-7) or older (p10-12) rat pups to examine the effect of calcium buffer capacity on vesicle pool size and the efficiency of exocytosis. Vesicle pool size was sensitive to the choice and concentration of exogenous Ca2+ buffer, and this sensitivity was much stronger in younger animals. Pool size and exocytosis efficiency in p5-7 calyces were depressed by 0.2 mM EGTA to a greater extent than with 0.05 mM BAPTA, even though BAPTA is a 100-fold faster Ca2+ buffer. However, this was not the case for p10-12 calyces. With 5 mM EGTA, exocytosis efficiency was reduced to a much larger extent in young calyces compared to older calyces. Depression of exocytosis using pairs of 10-ms depolarizations was reduced by 0.2 mM EGTA compared to 0.05 mM BAPTA to a similar extent in both age groups. These results indicate a developmentally regulated heterogeneity in the sensitivity of different vesicle pools to Ca2+ buffer capacity. We propose that, during development, a population of vesicles that are tightly coupled to Ca2+ channels expands at the expense of vesicles more distant from Ca2+ channels.