Structural analysis of glycans and development of microarrays from Helcobacter pylori cell surface glycome

Helicobacter pylori is a bacterial pathogen that affects more than half of the world’s population with gastro-intestinal diseases and is associated with gastric cancer. The cell surface of H. pylori is decorated with lipopolysaccharides (LPSs) composed of three distinct regions: a variable polysaccharide moiety (O-chain), a structurally conserved core oligosaccharide, and a lipid A region that anchors the LPS to the cell membrane. The O-chain of H. pylori LPS, exhibits unique oligosaccharide structures, such as Lewis (Le) antigens, similar to those present in the gastric mucosa and are involved in interactions with the host. Glucan, heptoglycan, and riban domains are present in the outer core region of some H. pylori LPSs. Amylose-like glycans and mannans are also constituents of some H. pylori strains, possibly co-expressed with LPSs. The complexity of H. pylori LPSs has hampered the establishment of accurate structure-function relationships in interactions with the host, and the design of carbohydrate-based therapeutics, such as vaccines. Carbohydrate microarrays are recent powerful and sensitive tools for studying carbohydrate antigens and, since their emergence, are providing insights into the function of carbohydrates and their involvement in pathogen-host interactions. The major goals of this thesis were the structural analysis of LPSs from H. pylori strains isolated from gastric biopsies of symptomatic Portuguese patients and the construction of a novel pathogen carbohydrate microarray of these LPSs (H. pylori LPS microarray) for interaction studies with proteins. LPSs were extracted from the cell surface of five H. pylori clinical isolates and one NCTC strain (26695) by phenol/water method, fractionated by size exclusion chromatography and analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry. The oligosaccharides released after mild acid treatment of the LPS were analysed by electrospray mass spectrometry. In addition to the conserved core oligosaccharide moieties, structural analyses revealed the presence of type-2 Lex and Ley antigens and N-acetyllactosamine (LacNAc) sequences, typically found in H. pylori strains. Also, the presence of O-6 linked glucose residues, particularly in LPSs from strains 2191 and NCTC 26695, pointed out to the expression of a 6-glucan. Other structural domains, namely ribans, composed of O-2 linked ribofuranose residues were observed in the LPS of most of H. pylori clinical isolates. For the LPS from strain 14382, large amounts of O-3 linked galactose units, pointing to the occurrence of a galactan, a domain recently identified in the LPS of another H. pylori strain. A particular feature to the LPSs from strains 2191 and CI-117 was the detection of large amounts of O-4 linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) residues, suggesting the presence of chitin-like glycans, which to our knowledge have not been described for H. pylori strains. For the construction of the H. pylori LPS microarray, the structurally analysed LPSs, as well as LPS-derived oligosaccharide fractions, prepared as neoglycolipid (NGL) probes were noncovalently immobilized onto nitrocellulosecoated glass slides. These were printed together with NGLs of selected sequence defined oligosaccharides, bacterial LPSs and polysaccharides. The H. pylori LPS microarray was probed for recognition with carbohydratebinding proteins (CBPs) of known specificity. These included Le and blood group-related monoclonal antibodies (mAbs), plant lectins, a carbohydratebinding module (CBM) and the mammalian immune receptors DC-SIGN and Dectin-1. The analysis of these CBPs provided new information that complemented the structural analyses and was valuable in the quality control of the constructed microarray. Microarray analysis revealed the occurrence of type-2 Lex and Ley, but not type-1 Lea or Leb antigens, supporting the results obtained in the structural analysis. Furthermore, the H. pylori LPSs were recognised by DC-SIGN, a mammalian lectin known to interact with this bacterium through fucosylated Le epitopes expressed in its LPSs. The -fucose-specific lectin UEA-I, showed restricted binding to probes containing type-2 blood group H sequence and to the LPSs from strains CI-117 and 14382. The presence of H-type-2, as well Htype- 1 in the LPSs from these strains, was confirmed using specific mAbs. Although H-type-1 determinant has been reported for H. pylori LPSs, this is the first report of the presence of H-type-2 determinant. Microarray analysis also revealed that plant lectins known to bind 4-linked GlcNAc chitin oligosaccharide sequences bound H. pylori LPSs. STL, which exhibited restricted and strong binding to 4GlcNAc tri- and pentasaccharides, differentially recognised the LPS from the strain CI-117. The chitin sequences recognised in the LPS could be internal, as no binding was detected to this LPS with WGA, known to be specific for nonreducing terminal of 4GlcNAc sequence. Analyses of the H. pylori LPSs by SDS-PAGE and Western blot with STL provided further evidence for the presence of these novel domains in the O-chain region of this LPS. H. pylori LPS microarray was also applied to analysis of two human sera. The first was from a case infected with H. pylori (H. pylori+ CI-5) and the second was from a non-infected control.The analysis revealed a higher IgG-reactivity towards H. pylori LPSs in the H. pylori+ serum, than the control serum. A specific IgG response was observed to the LPS isolated from the CI-5 strain, which caused the infection. The present thesis has contributed to extension of current knowledge on chemical structures of LPS from H. pylori clinical isolates. Furthermore, the H. pylori LPS microarray constructed enabled the study of interactions with host proteins and showed promise as a tool in serological studies of H. pyloriinfected individuals. Thus, it is anticipated that the use of these complementary approaches may contribute to a better understanding of the molecular complexity of the LPSs and their role in pathogenesis.

Caracterização dos mecanismos de transporte epitelial no intestino da dourada, Sparus auratus

Dissertação de mest., Aquacultura e Pescas, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Univ. do Algarve, 2010

Isolamento e produção de agentes de controlo biológico das principais doenças de pós-colheita, em citrinos e pomóideas

Potenciais agentes de biocontrolo foram isolados a partir da microbiota epifítica de folhas e frutos, de citrinos e pomóideas, de diferentes pomares, durante diferentes campanhas e de distintas condições de armazenamento. A atividade antagonista de 1465 microrganismos isolados foi testada em ensaios in vivo em pomóideas face a Penicillium expansum (104 esporos/ml) e em citrinos face a P. digitatum (105 esporos/ml) em frutos feridos e inoculados artificialmente. Aproximadamente 7,6% dos isolados reduziu a severidade (diâmetro da podridão) e a incidência (% podres) em mais de 25%, menos de 3% reduziu ambos os parâmetros em mais de 50%, mas apenas 4 microrganismos preencheram os critérios de seleção, redução da incidência e severidade em mais de 75%. Dos 4 e pelos resultados obtidos em ensaios de seleção secundária e de determinação da concentração mínima eficaz, destacaram-se e selecionaram-se 2 microrganismos, uma bactéria isolada de laranjas „Valencia late‟ e identificada como pertencente ao grupo das Enterobactérias, Pantoea agglomerans PCB-1 e uma levedura isolada a partir da superfície de maças 'Bravo de Esmolfe' identificada como Metschnikowia andauensis PBC-2, com o objetivo de usar dois modelos distintos de agentes de biocontrol, uma bactéria e uma levedura. P. agglomerans é um agente de biocontrolo já conhecido. A estirpe PBC-1 isolada neste trabalho mostrou ter elevada eficácia face aos principais agentes patogénicos na póscolheita de citrinos e pomóideas. M. andauensis é uma levedura recentemente descoberta e a estirpe PBC-2 diz respeito à primeira referência desta espécie como agente de biocontrolo, a qual foi recentemente objeto de concessão de Patente de Invenção Nacional nº 105210, como uma nova estirpe desta espécie para uso como agente de biocontrolo das doenças de póscolheita de frutos. A concentração mínima eficaz dos antagonistas revelou estar dentro dos limites para o seu desenvolvimento comercial. M. andauensis PBC-2 quando aplicada à concentração de 5×106 ufc/ml, permitiu uma redução da incidência e da severidade de 62 e 70%, respetivamente, e quando aplicada a 1×107 ufc/ml, uma redução de 90% de incidência e de 95% de severidade. P. agglomerans PBC-1 aplicada a 1 × 108 ufc/ml em maçãs e em citrinos no controlo de P. expansum e P. digitatum, respetivamente, propiciaram uma redução significativa de cerca de 86% de cada um dos agentes patogénicos. O espectro de ação de M. andauensis PBC-2 foi avaliado, verificando-se o controlo efetivo face a Rhizopus stolonifer, P. expansum e Botritys cinerea, em pera 'Rocha' e em diferentes cultivares de maçã e contra P. digitatum e Penicillium italicum em clementinas e laranjas de diferentes cultivares. Durante 4 épocas, a eficácia de M. andauensis PBC-2, foi avaliada e comparada com o fungicida sintético mais usado comercialmente, Imazalil, em ensaios semicomerciais. Os resultados assemelharam-se aos obtidos com o fungicida, a redução da incidência do bolor azul foi de 90% em maças armazenadas durante 3 meses a 1±0.5 ºC, seguido de 7 dias à temperatura ambiente, para simular o tempo de prateleira. Em ensaios do estudo da dinâmica populacional, verificou-se que o agente de biocontrolo M. andauensis PBC-2 tem uma excelente capacidade colonizadora e que consegue crescer e sobreviver nas feridas, mas também na superfície dos frutos, armazenados à temperatura ambiente e em condições de frio. Pelo contrário, M. andauensis PBC- não apresentou capacidade de sobrevivência no suco gástrico simulado, começando a população a diminuir imediatamente após exposição e passadas 48 h não restava população viável. Diferentes meios de cultura usualmente descritos na produção de leveduras foram testados na produção de M. andauensis PBC-2. Aquele que apresentou a maior população viável ao fim de 40 h de incubação foi o meio YPD, entretanto escolhido para estudos posteriores. O pH mais favorável ao crescimento foi de 6,5, não se observando diferenças significativas entre os crescimentos a 25 e 30 ºC. Estudou-se ainda o efeito da concentração das duas fontes de azoto do meio YPD e elegeu-se a combinação de 10 g/l de extrato de levedura e 20 g/l de peptona. Nos estudos de produção de biomassa dos dois potenciais agentes de biocontrolo, analisou-se o efeito da sacarose, frutose e glucose, como fontes de carbono e otimizou-se a concentração destes açúcares no crescimento em Erlenmeyer. Após 20 h de incubação a população viável de P. agglomerans PBC-1 atingiu 3.9×109, 1.5×109, 3.9×109 ufc/ml, respetivamente. No caso de M. andauensis PBC-2, foi obtida a população de 1.2×108, 5.3×108 e 1,3×108 ufc/ml, com glucose, sacarose e frutose, após 40 h. Os resultados permitem concluir que os dois agentes têm capacidade de metabolizar os açúcares testados, contudo e atendendo à produtividade de biomassa, rendimento, disponibilidade e custo, optou-se por usar a sacarose como fonte de carbono nos restantes ensaios, nomeadamente na transição de Erlenmeyer para reator biológico. Na produção de P. agglomerans PBC-1 escolheu-se o meio SAC (5 g/l sacarose e 5 g/l extrato de levedura). O meio YPS (12.5g/l sacarose, 10 g/l extrato de levedura, 20 g/l peptona) foi usado no aumento de escala de M. andauensis PBC-2. A otimização da produção em reator biológico de P. agglomerans PCB-1 foi realizada submetendo o microrganismo a diferentes condições hidrodinâmicas, testando-se arejamentos, dois tipos de turbina (hélice; rusthon) e dispersores (poroso, em L). Foram igualmente estudados, o efeito da concentração inicial do inoculo e a adição programada da fonte de carbono. Embora tenham sido testadas diferentes variações, o perfil dos diferentes parâmetros analisados foi idêntico, a população máxima viável foi de 3-5×109 ufc/ml. A diferença mais notória foi observada na fermentação com concentração inicial de 107 cfu/ml, que permitiu encurtar em cinco horas a fase lag, o que pode significar uma redução de tempo de fermentação, e consequentemente uma redução de custos. Visando a produção de biomassa a baixo custo, fator importante na implementação de um sistema de controlo biológico, estudou-se a possibilidade de utilizar subprodutos e resíduos da indústria alimentar no crescimento dos agentes de biocontrolo. Subprodutos da indústria de alfarroba e subprodutos e resíduos da indústria de sumos de citrinos foram utilizados na produção de P. agglomerans PBC-1 e de M. andauensis PBC-2, respetivamente. Desta forma, para além de uma redução dos custos de produção, pretendeu-se a valorização de um subproduto (no caso de alfarroba e do bagaço de citrinos) e mitigar os efeitos nefastos de um resíduo (licor), com elevada carga poluente, que gera graves problemas ambientais e que pode ditar o encerramento desta unidade industrial, com efeitos devastadores para a economia local. Realizaram-se extrações de subprodutos da indústria de alfarroba, a diferentes razões sólido/líquido, tempos e temperaturas, de forma a maximizar a extração de açúcares. A potencialidade de utilizar o extrato de açúcares obtido, na produção de P. agglomerans PBC-1 foi avaliada, em ensaios de crescimento em Erlenmeyer, com consequente transição para reator mecanicamente agitado. Os perfis de crescimento da cultura crescida com subprodutos da indústria de alfarroba assemelharam-se aos observados com sacarose como fonte de carbono. A biomassa viável produzida com subprodutos da indústria de alfarroba, foi de 4- 7×109 ufc/ml, o que permite concluir que é uma alternativa viável à produção deste microrganismo. A produção de M. andauensis PBC-2 com subprodutos da indústria de sumos de citrinos, foi estudada em Erlenmeyer tendo como objetivo conhecer os perfis de crescimento do microrganismo, bem como, estudar a melhor combinação desta fonte de carbono e sua concentração. O bagaço de citrinos e um resíduo líquido, que se denominou de licor, foram testados com resultados comparáveis à produção obtida com meio usado como standard, (YPS), sem comprometer a atividade antagonista do agente de biocontrolo. Posteriormente, foi realizada a produção em reator mecanicamente agitado, escolhendo-se para tal o meio YL (10 g/l extrato de levedura e licor à concentração de açúcares de 12.5 g/l). Os parâmetros de crescimento da cultura foram semelhantes aos obtidos com a fonte de carbono comercial. Após aproximadamente 40 h de incubação, a população viável de M. andauensis PCB-2 atingiu 3.1×108 ufc/ml. A produtividade de biomassa e rendimento foi de 0.435 g/l.h e 1.502 g/g, respetivamente, comparável a produtividade de biomassa (0.432 g/l.h) e rendimento (1.4416 g/g) observado no meio YPS. Os resultados obtidos, são uma base sólida para o aumento de escala a um nível laboratorial e semi-industrial, permitiram concluir que é exequível produzir M. andauensis a baixo custo e representam uma possível alternativa para um resíduo. Em estudos dos possíveis modos de ação, de M. andauensis PBC-2, conclui-se que, este agente de biocontrolo, não tem como modos de ação a produção de antibióticos ou de voláteis, uma vez que, não se verificou inibição do crescimento dos agentes patogénicos. A competição por ferro e a produção de enzimas líticas por M. andauensis PBC-2 foi estudada em meios com diferentes concentrações de ferro e em um meio de cultura, com paredes celulares de fungos, como única fonte de carbono. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a produção e secreção de enzimas líticas não é o principal ou o mais importante modo de ação do agente de controlo biológico PBC-2, uma vez que a produção de quitinase observada ao 5 e 7º dia de incubação foi muito baixa, e não foi observada a produção de β-1,3- glucanases e proteases.

Helicobacter pylori: perspetivas do uso de compostos naturais no seu combate

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologias, Universidade do Algarve, 2015

Construção de curvas binodais para sistemas ternários, contendo biodiesel, álcool e água

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química

A infecção por Helicobacter pylori em populações de Angola

RESUMO: A infecção por H. pylori, enquadra-se nas doenças infecciosas gastroduodenais e estima-se que mais de 50% da população mundial esteja infectada. A história natural da infecção por H. pylori, sofre interferências relacionadas com a genética do hospedeiro, a estirpe e as características da toxicidade da bactéria. Associam-se a estes factores, o tempo de exposição à infecção, assim como as condições sociais e higiéno-sanitárias. Paralelamente, o H. pylori é considerado o principal agente patogénico das doenças gastroduodenais. Este estudo teve como objectivo principal caracterizar a infecção por H. pylori em populações de Angola e sua avaliação como problema de Saúde Pública. Trata-se de um estudo prospectivo dirigido a dois grupos populacionais, um constituído por indivíduos aparentemente saudáveis, sem queixas gástricas específicas, em ambiente de comunidade, Grupo I, e outro, Grupo II, constituído por doentes que acorreram ao serviço de Gastrenterologia do Hospital Militar Principal de Luanda (HMP). No que diz respeito ao estudo na comunidade a pesquisa de H. pylori foi realizada pelo método ELISA de pesquisa de antigénios nas fezes. Por sua vez, a nível hospitalar, os métodos de diagnóstico da infecção por H. pylori foram: a endoscopia digestiva alta para a colheita de biópsias da mucosa gástrica destinadas ao exame anatomopatológico, ao exame citobacteriológico e aos métodos moleculares. Como método não invasivos foi utilizado o teste respiratório com ureia marcada. Grupo I: o diagnóstico da infecção por H. pylori, realizado pela pesquisa de antigénios deste microrganismo nas fezes, revelou uma frequência de 69,6% na população em estudo. Considerando em cada região, verificou-se que a região do Sambizanga possuía o valor mais elevado de frequência, 81,2%, seguida do Dinge com 79,5%, estatisticamente significativas (p 0,001). A avaliação da distribuição da frequência da infecção por grupo etário, revelou que os indivíduos com idade inferior a 15 anos, possuíam uma frequência de infecção de 63,5% e sendo de 76% nos indivíduos com idade superior a 15 anos. Este estudo permitiu concluir que a frequência da infecção por H. pylori nas regiões estudadas, é de 70% à excepção do Capulo, zona litoral em que não obstante as precárias condições de saneamento, a frequência da infecção por H. pylori é baixa. Grupo II: dos 309 doentes avaliados, verificou-se que 22 (7%), apresentavam uma mucosa normal e 287 (93%) uma mucosa alterada. A avaliação histológica das biópsias do antro, em 270 amostras de acordo com o Sistema de Sidney, em 235 (87,0%), revelou a presença de gastrite, 13 (4,8%) a presença de úlcera e em 9 (3,3%), uma lesão tumoral. A avaliação histológica da actividade nas 226 amostras do antro gástrico, verificou-se que 129 (57%) possuíam actividade e 97 (43%) não possuíam. O estudo das 255 biópsias do corpo, revelou em 212 (83,1%), a presença de lesões de gastrite, em 7 (2,7%), observaram-se lesões tumorais e 2 (0.8%) apresentaram úlcera. Dos 263 doentes avaliados histologicamente para pesquisa do H. pylori, 148 (58,2%) revelaram a presença positiva desta bactéria e 106 (41,7%) foram negativas. No que diz respeito à susceptibilidade aos macrólidos, do universo de 158 doentes com H. pylori positivo, 125 (79,1%) doentes apresentaram estirpes sensíveis aos macrólidos e 33 (20,9%) estirpes resistentes. Em relação aos factores de virulência, na avaliação conjunta dos dois factores de virulência estudados (cagA e vacA), em relação ao tipo de lesões encontradas na mucosa gástrica, verificou-se que dos 11 doentes com úlcera, 7 (63,6%), apresentavam uma estirpe cagA negativa, sendo 6 vacA s1 (85,7%), uma s2 e 4 (36,3%) com uma estirpe cagA positiva e vacA s1. Por sua vez dos 2 doentes com tumor, ambas as estirpes eram cagA negativas, sendo uma vacA s1 e outra vacA s2. Em relação aos factores de virulência nos doentes aos quais se diagnosticou úlcera e tumor apresentavam estirpe cagA negativa, vacAs1. Em relação ás lesões gástricas inflamatórias, os doentes com gastrite apresentavam cagA positivo. Do presente trabalho, em atenção aos resultados obtidos no que concerne a prevalência em populações sem queixas gastrenterológicas, recomenda-se que o mesmo se possa vir a replicar numa abrangência maior, realizando-se, por exemplo, estudos comparativos de prevalência entre as populações residentes no litoral (beira-mar) e as do interior. Pelas características genotípicas de H. pylori, em correspondência com as lesões encontradas, após novos estudos mais abrangentes, recomenda-se a avaliação de uma terapêutica mais acessível para o doente e que seja de maior eficácia. Face à escassez de médicos especialistas em gastrenterologia em Angola e de meios de diagnóstico, recomenda-se um estudo mais alargado da eficácia do seguimento do doente dispéptico, conforme protocolo avaliado pelo Colégio da Especialidade de Gastrenterologia da Ordem dos Médicos de Angola e já em prática em algumas instituições de saúde.--------------------------- ABSTRACT: H.pylori infection, is part of the gastroduodenal infectious diseases and it is estimated that over 50% of the world population is infected. The natural history of H.pylori infection, is influenced by host genetic, strain type, of bacterial virulence factors, time of exposure to the infection, as well as social and hygienic-sanitary conditions. In parallel, H.pylori is considered the main pathogen of gastroduodenal diseases. This study's main objective was to characterize H.pylori infection in populations of Angola and its evaluation as a public health problem. This is a prospective study conducted in two population groups, one in community environment composed by healthy individuals without specific gastric complaints - Group I, and Group II consisting of patients who went to the Gastroenterology Service of the Hospital Military of Luanda (HMP). As regards to the study in the community detection of H.pylori was carried out by antigen search in faeces using ELISA method. At hospital level H.pylori infection diagnostic methods were: upper gastrointestinal endoscopy to obtain gastric mucosal biopsies for histology, culture and molecular methods. As a non-invasive breath test with labelled urea was used. Group I: the diagnosis of H.pylori infection, by antigens detection in faeces, revealed a frequency of 69.6% in the study population. Whereas in each region, it was found that the Sambizanga region had the highest frequency of positive cases, 81.2% , followed by Dinge with 79.5%, Funda with 78.7 and Capulo with 39.8% being differences statistically significant (p=0.001). The evaluation of the distribution of the infection frequency by age group, revealed that individuals younger than 15 years had a frequency of 63.5% and in individuals older than 15 years, 76%. This study showed that the frequency of H.pylori infection in the regions studied was 70% exception due to Capulo, a coastal zone where despite the poor sanitation conditions; the frequency of H.pylori infection is lower. Group II: from the 309 patients evaluated, it was found that 22 (7%) had a normal mucosa and 287 (93%) a modified mucosa. Histological evaluation of antrum biopsies in 270 samples according to the Sydney System revealed the presence of gastritis in 235 (87.0%), the presence of ulcers in 13 (4.8%) and a tumour in 9 (3 3%). Histological assessment of activity in the gastric antrum of 226 samples, revealed that 129 (57%) had activity and 97 (43%) did not. The evaluation of the 255 corpus biopsies showed in 212 (83.1%), the presence of lesions of gastritis, in 7 (2.7%) tumour lesions and in 2 (0.8%) an ulcer. Of the 263 patients histological evaluated for H.pylori, 148 (58.2%) revealed the presence of this bacteria and 106 (41.7%) were negative. As regards susceptibility to macrolides from the universe of 158 patients with H.pylori, 125 (79.1%) patients had macrolides susceptible strains and 33 (20.9%) resistant strains. Regarding virulence factors (vacA and cagA), it was found that from the 11 patients with ulcers, 7 (63.6%), had a cagA negative strain, being 6 vacA s1, (85.7%) one vacA s2 and 4 (36.3%) with a cagA positive strain vacA s1. Concerning the 2 patients with tumour, both strains were cagA negative, one vacA s1 and other vacA s2. Patients with ulcer and tumour had cagA negative strains vacAs1. From this work, considering the prevalence of H.pylori obtained in health population, it is recommended that the same study should be performed in larger scale to confirm these results. The results of H.pylori genotyping suggest that more comprehensive studies are needed. Given the reduce number gastroenterology specialist in Angola and the lack of diagnostics methods, we recommend a larger study of the effectiveness of follow-up the patient dyspeptic, according to the protocol assessed by the College of Gastroenterology Specialty of the Order of Doctors and Angola already in place in some health institutions.

SA-ß-galactosidasa como predictor de senescencia celular del epitelio superficial ovárico y factores de riesgo de cáncer de ovario

Introducción: la tercera causa de muerte ginecológica es cáncer de ovario (CO), la detección temprana es fundamental para reducir mortalidad. El objetivo es establecer asociación entre senescencia en cultivos de tejido epitelial de ovario (ESO) mediante expresión de enzima ßgalactosidasa/normalizada y factores de riesgo reconocidos para CO. Métodos: estudio descriptivo observacional con fase exploratoria de datos proporcionados por “TRF2” segunda fase; muestra 29 tejidos de mujeres con ooforectomia condiciones benignas, analizadas estadísticamente con confianza del 95%, software SPSS versión 17, datos se presentan con desviación estándar, promedio, mediana (velocidad de crecimiento celular y ßgal/Normalizada) y porcentajes (variables categóricas). Realizo comparación con t-student, test de normalidad con Shapiro Wilks y asociación mediante análisis multivariado. Resultados: encuentra evidencia estadísticamente significativa (p < 0,05) para asociación entre antecedente familiar de otros tipos de cáncer con cáncer gástrico (IC95%: -2,84, -0,23) y cáncer de seno (IC95%: -3,39, -0,38); no tener régimen de afiliación en salud (vinculado) (IC95%: -3,67 -0,014); uso de método anticonceptivo de barrera (IC95%: -3,95, -0,07); consumo de embutidos (IC95%: -3,30, -0,21) y enlatados (IC95%: -3,62, -0,030) 1 a 3 veces/semana y consumo de alcohol (IC95%: -2,33, -0,33) con aumento expresión ßgal/Normalizada. Discusión: senescencia es antitumorigénica a edades tempranas, en avanzadas es protumorigénica, cuando hay mucha acumulación de células senescentes en tejido, éstas cambian su perfil senector produciendo sustancias que afectan a las vecinas, lo que lleva a transformación tumoral. Esta investigación es novedosa.

O potencial da PCR em tempo real no diagnóstico da infecção por helicobacter pylori

H. pylori é um microrganismo responsável por gastrites e implicado, em associação com outros factores, na úlcera gastroduodenal e no cancro gástrico. O diagnóstico da infecção por microrganismo pode realizar-se recorrendo a métodos invasivos através da obtenção de uma biópsia gástrica obtida por endoscopia digestiva alta e a métodos não invasivos. Nenhum dos métodos, desenvolvido até hoje, constitui o método ideal. Todos eles possuem as suas vantagens e desvantagens consoante a situação em que são aplicados. A reacção de polimerização em cadeia (PCR) conduziu a uma modificação fundamental no campo da biologia molecular, abrindo novos horizontes nas ciências médicas e biológicas. Apesar da cultura de H. pylori a partir de biópsia gástrica continuar a ser o método de referência para o diagnóstico da infecção por esta bactéria, ela apresenta inconvenientes que podem ser ultrapassados pela utilização da PCR, como sejam o longo período para a obtenção de resultados e o respeito de condições estritas de transporte da biópsia gástrica. Recentemente foi desenvolvido um protocolo baseado no principio da PCR em tempo real, utilizando o aparelho LightCycler Roche Diagnostics. Este protocolo permite a obtenção de um resultado de detecção da presença de H. pylori na biópsia gástrica assim como do seu perfil de susceptibilidade aos macrólidos. A PCR em tempo real é dotada de uma grande sensibilidade e especificidade, rapidez de obtenção de resultados o que aliado à sua capacidade de detecção de mutações responsáveis pela resistência dos microrganismos aos antibióticos faz com que esta técnica seja a metodologia do futuro no diagnóstico das doenças infecciosas.

Actividades inibitória de colinesterases e antioxidante de extractos de plantas utilizadas como chás

Nos últimos séculos perdeu-se o interesse por uso de plantas medicinais nos países desenvolvidos, devido à evolução da síntese química de fármacos. Ressurgiu recentemente este uso para desenvolvimento de novos fármacos de patologias com múltiplos mecanismos fisiopatológicos associados devido às actividades simultâneas dos extractos. Dos potenciais usos medicinais explorou-se a inibição da acetilcolinesterase (AChE) para problemas gastrointestinais e para terapêutica da doença de Alzheimer com menos efeitos secundários, e menor toxicidade associada. Realizou-se um estudo de actividades antioxidante e inibitória de AChE onde as duas espécies estudadas de plantas tiveram actividade. A decocção de A. cherimola apresentou capacidade de actividade mais elevada de inibir Ache com um IC50 de 0,627±0,028 mg/mL e antioxidante com um EC50 de 15,435±0,184 mg/mL. Nenhum dos extractos perdeu actividade com o metabolismo in vitro gástrico e pancreático. Na biodisponibilidade verificou-se que a maior parte dos compostos permeia até determinada extensão a monocamada de células Caco-2 com excepção do glucósido da quercetina. A via de transporte predominante dos compostos estudados parece ser difusão paracelular passiva.

Expressão imunohistoquímica do C-MYC na seqüência metaplasia-displasia-adenocarcinoma no esôfago

Introdução e Objetivos: O esôfago de Barrett (BE) desenvolve-se como conseqüência de uma agressão acentuada sobre a mucosa esofágica causada pelo refluxo gastresofágico crônico. É uma lesão precursora e exerce papel importante no desenvolvimento do adenocarcinoma esofágico (ACE). Inúmeras alterações genéticas estão presentes ao longo da transformação tumoral de uma célula, sendo o c-Myc um dos principais genes envolvidos na carcinogênese humana. O objetivo do presente estudo foi determinar a expressão do c-myc em pacientes com EB e com adenocarcinoma esofágico, e avaliar esta prevalência relacionada com a seqüência metaplasia-displasia-adenocarcinoma. Métodos: A expressão da proteína do C-myc foi determinada através da análise imunohistoquímica em quatro grupos diferentes: 31 pacientes com tecido normal, 43 pacientes com EB sem displasia, 11 pacientes com displasia em EB e 37 pacientes com o adenocarcinoma esofágico. O material foi obtido de peças de biópsias ou de ressecção cirúrgica de pacientes atendidos pelo Grupo de Cirurgia de Esôfago, Estômago e Intestino Delgado (GCEEID) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) no período de janeiro 1998 a fevereiro 2004. Dados demográficos e endoscópicos (sexo, idade, raça, tamanho hiatal da hérnia e extensão do epitélio colunar esofágico), e as características morfológicas e histopatológicas tumorais (invasão tumoral, comprometimento linfonodal, e diferenciação histológica do tumor) foram analisados. A expressão de c-Myc foi avaliada usando o sistema de escore de imunorreatividade (Immunoreactive Scoring System – ISS). Resultados: Expressão aumentada do c-myc foi encontrada em apenas 9,7% das amostras de epitélio normal, em 37,2% dos pacientes com EB, em 45,5% dos pacientes com displasia e em 73% dos pacientes com adenocarcinoma, com diferença estatística significativa entre os grupos. Nenhuma associação foi identificada quando a expressão do c-Myc foi comparada as características morfológicas e histológicas do tumor ou aos dados endoscópicos. Entretanto, uma correlação linear da expressão do c-myc ao longo da seqüência metaplasia-displasia-adenocarcinoma foi observada. Conclusão: O estudo demonstrou um aumento significativo da expressão do c-Myc no EB, na displasia, e no adenocarcinoma em relação aos controles, bem como uma progressão linear da positividade deste gene ao longo desta seqüência. Estes resultados apontam para um papel importante deste marcador no desenvolvimento do ACE a partir do EB. Esta expressão aumentada do c-Myc em pacientes com EB poderá ajudar a identificar pacientes com risco elevado para o desenvolvimento de adenocarcinoma, contribuindo para um diagnóstico precoce desta doença.

Nova pipeta para inseminação intra-uterina em suínos.

A inseminação intra-uterina (IAU) permite reduzir o número de espermatozóides e o volume de diluente em comparação à inseminação tradicional. No entanto, a técnica ainda apresenta algumas limitações a serem superadas para que seja uma alternativa de diminuição dos custos de cobertura. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho reprodutivo de 423 fêmeas suínas de ordem de parto 1 a 9 submetidas à inseminação intra-uterina (IAU), com um novo modelo de pipeta (T1) cuja extremidade não é fixada na cérvix ou uma pipeta de IAU modelo Verona® e que permite a fixação da sua extremidade em espiral na cérvix (T2). Para comparar as duas pipetas foi considerado o grau de dificuldade para realização das inseminações, o tempo necessário para realizálas, presença de sangramento após a inseminação, a presença de refluxo no momento da inseminação, as taxas de retorno ao estro (TR), de prenhez (TPR) e de parto ajustada (TPA), além do número de leitões nascidos (NT). As fêmeas de ambos os grupos foram inseminadas com doses de 1 bilhão de espermatozóides, em intervalos de 24 horas. A passagem do cateter de IAU através da cérvix foi possível em 95,9% das fêmeas, sem diferença entre os tratamentos (P>0,05). Em pelo menos uma das inseminações, foi observado sangue no cateter, após a realização da IAU, em 20,6% das fêmeas do T1 e 15,2% das fêmeas do T2 (P=0,14). O tempo médio necessário para realizar a inseminação foi de 2,1 minutos para o T1 e 2,3 minutos para o T2 (P=0,26). O percentual de fêmeas com refluxo de sêmen no momento da inseminação foi maior (P=0,01) no T1 (8,4%) em comparação ao T2 (2,9%). Não houve diferença (P>0,05) nas variáveis TR (8,0 e 4,8%), TPR (93,4 e 96,2%) e NT (12,4 e 12,7 leitões) entre T1 e T2, respectivamente. A TPA do T1 (90,6%) apresentou tendência (P=0,07) de ser inferior à do T2 (95,1%). No T1, as fêmeas primíparas apresentaram maior TR e menor TPA em comparação às pluríparas (P<0,05). Os resultados mostram que a nova pipeta pode ser utilizada sem prejuízos ao desempenho reprodutivo, em fêmeas pluríparas, mas sugerem cautela para sua utilização em fêmeas primíparas.

Desempenho reprodutivo de fêmeas suínas após a inseminação artificial intra-uterina ou tradicional

O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho reprodutivo de fêmeas suínas inseminadas com a técnica intra-uterina (IAU) ou tradicional (IAT), considerando o refluxo de sêmen após a IA, as taxas de retorno ao estro e de parto, além do número de leitões nascidos. As fêmeas do grupo IAU foram inseminadas com doses de 1,5 bilhão de espermatozóides em 60 ml de volume e as do grupo IAT com 3 bilhões em 90 ml. A passagem do cateter de IAU através da cérvix foi possível em 97,4% das fêmeas. Houve presença de sangue no cateter, após a realização da IAU, em 9,5% das fêmeas em pelo menos uma das inseminações, e estas apresentaram retorno ao estro superior ao das fêmeas sem sangramento (P<0,05). Foi coletado o refluxo no momento e até duas horas após a inseminação. Apesar do percentual de volume refluído ter sido maior (P<0,05) na IAU (75,4%) do que na IAT (62,7%), o percentual de espermatozóides presentes no refluxo foi semelhante (22,7 e 23,0%, respectivamente). Foi realizado diagnóstico de retorno ao estro a partir do 18º dia e diagnóstico de gestação por ultra-sonografia transcutânea entre o 21º e 23º dias após a inseminação. Não houve diferença (P>0,05) nas taxas de retorno ao estro (3,6% e 4,3%), de prenhez aos 21-23 dias (99,5% e 97,2%), de parto ajustada (94,9% e 94,4%) e no tamanho da leitegada (11,6 e 11,8 leitões) entre IAU e IAT, respectivamente. Independentemente do número de espermatozóides da dose inseminante, a perda por refluxo, superior ou inferior a 20% do total infundido, não influenciou a taxa de parto e o número de leitões nascidos. O desempenho reprodutivo de fêmeas suínas de ordem de parto dois a quatro, inseminadas pela técnica intra-uterina, com doses de 1,5 bilhão de espermatozóides, foi semelhante àquele observado com a inseminação tradicional cervical com doses de 3 bilhões de espermatozóides.

Qualidade de vida em gestantes no terceiro trimestre com pirose e/ou regurgitação : contribuição da cafeína, acido ascórbico e ácidos graxos

Introdução: Pirose e regurgitação são manifestações da Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) que ocorrem freqüentemente no terceiro trimestre da gravidez, porém seu impacto na qualidade de vida de gestantes é pouco conhecido. Objetivos: 1. Mensurar a qualidade de vida em gestantes no terceiro trimestre da gravidez com Pirose e Regurgitação; 2. Avaliar a relação entre Pirose e Regurgitação e a dieta. Pacientes e Métodos: Gestantes no terceiro trimestre acompanhadas ambulatorialmente foram entrevistadas para colher dados referentes à história obstétrica, freqüência, intensidade e passado de P e R, qualidade de vida (mensurada a partir do questionário genérico SF-36), ingestão alimentar (avaliada por recordatório de 24h) e medidas antropométricas; Resultados: Foram estudadas consecutivamente 82 gestantes: 62 com pirose e/ou regurgitação e 20 assintomáticas. Pirose foi relatada por 62 (76%) gestantes e regurgitação por 58 (71%). A idade gestacional média foi 33,8±3,7 semanas, 35 (43%) apresentavam história familiar positiva de pirose e/ou regurgitação e 57 (70%) não apresentavam tais sintomas fora da gravidez. Houve redução estatisticamente significativa na qualidade de vida das gestantes sintomáticas nos seguintes domínios: Para pirose, em Limitação Física e Aspectos Sociais; para regurgitação, em Limitação Física, Aspectos Sociais, Aspectos Emocionais e Dor. Houve concordância entre presença de pirose em gestações passadas e a atual. Gestantes com pirose apresentaram-se significativamente com maior peso corporal. Ácidos graxos poli e monoinsaturados, cafeína, ácido ascórbico e sulfato ferroso foram significativamente associados com pirose e/ou regurgitação. Conclusões: 1.Pirose e / ou regurgitação diminuíram a qualidade de vida em gestantes no terceiro trimestre; 2. ácidos graxos, cafeína, ácido ascórbico e sulfato ferroso estiveram associados com pirose e/ou regurgitação.

Resposta urodinamica ao cateterismo vesical intermitente e cloreto de oxibutinina em crianças com mielomeningocele

Examinamos urodinamicamente 46 crianças com mielomeningocele que foram classificadas em pressão de perda do detrusor maior de 40 cmH2O (33 pacientes) ou menor de 40 cmH2O (13 pacientes). As variáveis estudadas foram: idade, sexo, pressão intravesical, complacência vesical, contrações vesicais não-inibidas, capacidade vesical, tipo de esfíncter, hidronefrose, refluxo vesicoureteral e cicatriz renal. Os pacientes com pressão de perda do detrusor maior de 40 cmH2O foram tratados com cateterismo vesical intermitente limpo 4 x/dia e cloreto de oxibutinina na dose de 0,2 mg/kg/dose 3 x/dia. Após 30 dias de tratamento, avaliamos a resposta urodinâmica da pressão intravesical, complacência vesical, contrações vesicais não-inibidas e capacidade vesical. A idade dos pacientes com pressão de perda alta é significativamente maior. O sexo não foi significativamente diferente entre os dois grupos. A pressão intravesical e contrações vesicais não-inibidas são significativamente maiores nos pacientes com pressão de perda alta e a complacência vesical é significativamente menor nestes casos. Não houve correlação significativa entre capacidade vesical e pressão de perda. Também não houve correlação significativa entre o tipo de esfíncter e a capacidade vesical, contrações não-inibidas e pressão intravesical. Os pacientes com dissinergia apresentam significativamente menor complacência vesical e aqueles com sinergia apresentam significativamente maior complacência vesical. A dissinergia esteve significativamente associada aos pacientes com pressão de perda alta. Os pacientes com hidronefrose apresentam significativamente maior capacidade vesical e estão correlacionados significativamente com dissinergia e cicatriz renal. Não houve correlação significativa entre hidronefrose e pressão intravesical, complacência vesical, contrações vesicais não-inibidas e pressão de perda.Também não houve correlação significativa entre refluxo vesicoureteral e capacidade vesical, pressão intravesical, complacência vesical, contrações vesicais não-inibidas, tipo de esfíncter e pressão de perda, mas houve associação significativa com hidronefrose e cicatriz renal. Os pacientes com cicatriz renal apresentam significativamente maior capacidade vesical, mas não houve correlação significativa entre cicatriz renal e pressão intravesical, complacência vesical, contrações vesicais não-inibidas, tipo de esfíncter e pressão de perda. A média da pressão intravesical inicial era 60,5 cmH2O e diminuiu significativamente para 50,2 cmH2O após o tratamento. A complacência vesical média era 2,8 ml/cmH2O inicialmente e aumentou significativamente para 5,2 ml/cmH2O. A média das contrações vesicais não-inibidas inicial era 37 cmH2O e diminuiu significativamente para 11,4 cmH2O. A capacidade vesical média inicial era 133,9 ml e aumentou significativamente para 215,3 ml. Houve significativa melhora nos parâmetros urodinâmicos com o tratamento que, contudo, não conseguiu atingir valores considerados normais. Isto pode ser explicado pelas alterações viscoelásticas que já tenham ocorrido nestas bexigas e pela provável presença de outros neurotransmissores envolvidos na neurofisiologia patológica. Este trabalho deixa em aberto a possibilidade de que doses mais elevadas de cloreto de oxibutinina usadas por períodos mais prolongados possam ter efeitos benéficos adicionais aos aqui demonstrados.