Properties of a constitutive alkaline phosphatase from strain 74A of the mold Neurospora crassa

A constitutive alkaline phosphatase was purified to apparent homogeneity as determined by polyacrylamide gel electrophoresis from mycelia of the wild strain 74A of the mold Neurospora crassa, after growth on acetate and in the presence of saturating amounts of inorganic phosphate (Pi) for 72 h at 30ºC. The molecular mass was 58 kDa and 56 kDa as determined by exclusion chromatography and SDS-PAGE, respectively. This monomeric enzyme shows an apparent optimum pH ranging from 9.5 to 10.5 and Michaelis kinetics for the hydrolysis of p-nitrophenyl phosphate (the Km and Hill coefficient values were 0.35 mM and 1.01, respectively), alpha-naphthyl phosphate (the Km and Hill coefficient values were 0.44 mM and 0.97, respectively), ß-glycerol phosphate (the Km and Hill coefficient values were 2.46 mM and 1.01, respectively) and L-histidinol phosphate (the Km and Hill coefficient values were 0.47 mM and 0.94, respectively) at pH 8.9. The purified enzyme is activated by Mg2+, Zn2+ and Tris-HCl buffer, and is inhibited by Be2+, histidine and EDTA. Also, 0.3 M Tris-HCl buffer protected the purified enzyme against heat inactivation at 70ºC(half-life of 19.0 min, k = 0.036 min-1) as compared to 0.3 M CHES (half-life of 2.3 min, k = 0.392 min-1) in the same experiment.

Immunocytochemical and biochemical detection of alpha-L-fucosidase in Trypanosoma cruzi

The aim of the present study was to demonstrate the presence of alpha-L-fucosidase in Trypanosoma cruzi. Immunocytochemical and biochemical techniques were used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum, alpha-L-fucosidase from the parasite. Light and electron microscopy localized the alpha-L-fucosidase specifically on the surface of the parasite and on membranes in the posterior region of the epimastigote stage. Although much less intense, labeling was also detected on the surface of trypomastigotes. At least 50% of the alpha-L-fucosidase activity was associated with epimastigote membrane solubilized with 1 M NaCl or 1% Triton X-100, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. The enzyme from epimastigotes had a neutral pH optimum (near 7) but displayed low specific activity when p-nitrophenyl-alpha-L-fucoside was employed as substrate (0.028 U/mg protein for epimastigotes and 0.015 U/mg protein for tissue culture-derived trypomastigotes). Polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting analysis both showed an expected 50-kDa polypeptide which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies.

Persistent organic pollutants in sediments and fish from Lake Victoria, Uganda

This thesis describes the occurrence and sources of selected persistent organic pollutants (POPs) such as polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs), polychlorinated dibenzofurans (PCDFs), polychlorinated biphenyls (PCBs), polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and hexachlorocyclohexanes (HCHs) in the northern watershed of Lake Victoria. Sediments and fish were collected from three highly polluted embayments (i.e. Murchison Bay, Napoleon Gulf and Thurston Bay) of the lake. The analysis for PCDD/Fs, PCBs and PBDEs was done using a high resolution mass spectrometer coupled to a gas chromatograph (GC), and a GC equipped with an electron capture detector was used for HCHs. Total (Σ) PCDD/Fs, PCBs and PBDEs in sediments ranged from 3.19 to 478, 313 to 4325 and 60.8 to 179 pg g-1 dry weight (dw), respectively. The highest concentrations of pollutants were found at sites close to industrial areas and wastewater discharge points. The maximum concentrations of PCDD/Fs, PCBs, PBDEs and HCHs in fish muscle homogenates were 49, 779, 495 and 45,900 pg g-1 wet weight (ww), respectively. The concentrations of the pollutants in Nile perch (Lates niloticus) were significantly greater than those in Nile tilapia (Oreochromis niloticus), possibly due to differences in trophic level and dietary feeding habits among fish species. World Health Organization-toxic equivalency quotient (WHO2005-TEQ) values in the sediments were up to 4.24 pg g-1 dw for PCDD/Fs and 0.55 pg TEQ g-1 dw for the 12 dioxin-like PCBs (dl-PCBs). 23.1% of the samples from the Napoleon Gulf were above the interim sediment quality guideline value of 0.85 pg WHO-TEQ g-1 dw set by the Canadian Council for Ministers of the Environment. The WHO2005-TEQs in fish were 0.001-0.16 pg g-1 for PCDD/Fs and 0.001-0.31 pg g-1 ww for dl- PCBs. The TEQ values were within a permissible level of 3.5 pg g−1 ww recommended by the European Commission. Based on the Commission set TEQs and minimum risk level criteria formulated by the Agency for Toxic Substances and Disease Registry, the consumption of fish from Lake Victoria gives no indication of health risks associated to PCDD/Fs and PCBs. Principal component analysis (PCA) indicated that anthropogenic activities such as agricultural straw open burning, medical waste incinerators and municipal solid waste combustors were the major sources of PCDD/Fs in the watershed of Lake Victoria. The ratios of α-/γ-HCH varied from 0.89 to 1.68 suggesting that the highest HCH residues mainly came from earlier usage and fresh γ-HCH (lindane). In the present study, the concentration of POPs in fish were not significantly related to those in sediments, and the biota sediment accumulation factor (BSAF) concept was found to be a poor predictor of the bioavailability and bioaccumulation of environmental pollutants.

Characterization of the interdependency between residues that bind the substrate in a β-glycosidase

The manner by which effects of simultaneous mutations combine to change enzymatic activity is not easily predictable because these effects are not always additive in a linear manner. Hence, the characterization of the effects of simultaneous mutations of amino acid residues that bind the substrate can make a significant contribution to the understanding of the substrate specificity of enzymes. In the β-glycosidase from Spodoptera frugiperda (Sfβgly), both residues Q39 and E451 interact with the substrate and this is essential for defining substrate specificity. Double mutants of Sfβgly (A451E39, S451E39 and S451N39) were prepared by site-directed mutagenesis, expressed in bacteria and purified using affinity chromatography. These enzymes were characterized using p-nitrophenyl β-galactoside and p-nitrophenyl β-fucoside as substrates. The k cat/Km ratio for single and double mutants of Sfβgly containing site-directed mutations at positions Q39 and E451 was used to demonstrate that the effect on the free energy of ES‡ (enzyme-transition state complex) of the double mutations (∆∆G‡xy) is not the sum of the effects resulting from the single mutations (∆∆G‡x and ∆∆G‡y). This difference in ∆∆G‡ indicates that the effects of the single mutations partially overlap. Hence, this common effect counts only once in ∆∆G‡xy. Crystallographic data on β-glycosidases reveal the presence of a bidentate hydrogen bond involving residues Q39 and E451 and the same hydroxyl group of the substrate. Therefore, both thermodynamic and crystallographic data suggest that residues Q39 and E451 exert a mutual influence on their respective interactions with the substrate.

Antimutagenic, antiproliferative, and antioxidant effect of extracts obtained from octopus (Paraoctopus limaculatus)

Abstract The search for chemopreventive/chemoprotective compounds in marine organism has been extensively reported; however, the presence of these compounds in octopus has been incipiently explored. In this research, the antimutagenic, antiproliferative, and antioxidant potential of three crude extracts (methanolic, acetonic, and hexanic) from Paroctopus limaculatus was investigated. Antimutagenic activity against aflatoxin B1 (AFB1) was evaluated through the Ames test using Salmonella typhimurium tester strains TA98 and 100. Antiproliferative activity was assessed using the standard MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide) assay on M12.C3.F6 murine cell line. Antioxidant activity was assessed using the DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) and ABTS (2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) methods. Hexanic extract showed the highest antimutagenic and antiproliverative activities inhibiting 80 and 43% of mutagenicity induced by AFB1 for TA98 and TA100, respectively, and showing a high antiproliferative activity at 200 and 100 µg/mL. However, when the antioxidant activity was evaluated at a concentration of 50 mg/mL, the methanolic fraction exerted inhibition of 98 and 96 % ABTS and DPPH radicals, respectively. RP-HPLC and 1H-RMN analyses suggested the presence of double bonds with extended conjugation and oxygenated compounds such as alcohols, esters, ethers or ketones. These results suggested that hexanic and methanolic extract form octopus contained compounds with chemoprotective and antioxidant properties.

Kinetic studies of the effect of organic sulphides on the oxidation of other sulphides /

The rates of oxidation of three Organic sulphides viz. methyl phenyl sulphide, (P), p -me thoxyphenyl methyl sulphide (M) and methyl p-nitrophenyl sulphide (N). have been obtained in ethanol using MoO-(acac)- as catalyst and Bu OOH as the oxidizing agent. A Hammett plot gave a rho value of -2.1 and the activation energies for the oxidation of P, M and N were estimated to be 63.60, 40.12 and 197.46 Kj mol respectively. The effect of organic sulphide on the oxidation of another sulphide was also ascertained. Positive and negative deviations were observed from the expected slope.

Biosynthesis of benzyliasoquinoline alkaloids

This research was carried out to obtain a convenient route for the synthesis of [7_ 14C]-p-hydroxy benzaldehyde. Section 1 of the thesis includes a route involving intermediates with protecting groups like benzyl and methyl ethers of the phenols. The benzyl ethers afforded the product in relatively better yield. The overall synthesis involves four steps. Section 2 describes the reactions carried out directly on phenols, and a three step pathway is obtained for the synthesis of p-hydroxy benzaldehyde, which was repeated on labelled compounds to obtain [7_14C]p- hydroxy benzaldehyde. The synthesis involves the reaction of p-bromophenol with Cu14CN to yield [7_ 14C]-p-cyano phenol, which is then reduced to the aldehyde by means of a simple and clean photolysis method. The same route was tried out to get 3,4-dihydroxybenzaldehyde and was found to work equally well for the synthesis of this compound. Section 3 deals with the isolation of labelled alkaloids, corydaline, protopine and reticu1ine from [2-3H,1-14C]-dopamine (3H/ 14C ratio = 4) fed Corydalis solida. 3H/14C ratios in the labelled alkaloids were determined. The uncorrected values showed almost 50% loss of 3H relative to 14C in reticuline, and roughly 75% loss of the 3H relative to 14C in corydaline and protopine.

NMR studies of the exchange reactions of CH3CN.BX3 with excess CH3CN /|nJoseph Fogelman. -- 260 St. Catharines, Ont. : [s. n.],

Exchange reactions between molecular complexes and excess acid or base are well known and have been extensively surveyed in the literature(l). Since the exchange mechanism will, in some way involve the breaking of the labile donor-acceptor bond, it follows that a discussion of the factors relating to bonding in molecular complexes will be relevant. In general, a strong Lewis base and a strong Lewis acid form a stable adduct provided that certain stereochemical requirements are met. A strong Lewis base has the following characteristics (1),(2) (i) high electron density at the donor site. (ii) a non-bonded electron pair which has a low ionization potential (iii) electron donating substituents at the donor atom site. (iv) facile approach of the site of the Lewis base to the acceptor site as dictated by the steric hindrance of the substituents. Examples of typical Lewis bases are ethers, nitriles, ketones, alcohols, amines and phosphines. For a strong Lewis acid, the following properties are important:( i) low electron density at the acceptor site. (ii) electron withdrawing substituents. (iii) substituents which do not interfere with the close approach of the Lewis base. (iv) availability of a vacant orbital capable of accepting the lone electron pair of the donor atom. Examples of Lewis acids are the group III and IV halides such (M=B, AI, Ga, In) and MX4 - (M=Si, Ge, Sn, Pb). The relative bond strengths of molecular complexes have been investigated by:- (i) (ii) (iii) (iv) (v] (vi) dipole moment measurements (3). shifts of the carbonyl peaks in the IIIR. (4) ,(5), (6) .. NMR chemical shift data (4),(7),(8),(9). D.V. and visible spectrophotometric shifts (10),(11). equilibrium constant data (12), (13). heats of dissociation and heats of reactions (l~), (16), (17), (18), (19). Many experiments have bben carried out on boron trihalides in order to determine their relative acid strengths. Using pyridine, nitrobenzene, acetonitrile and trimethylamine as reference Lewis bases, it was found that the acid strength varied in order:RBx3 > BC1 3 >BF 3 • For the acetonitrile-boron trihalide and trimethylamine boron trihalide complexes in nitrobenzene, an-NMR study (7) showed that the shift to lower field was. greatest for the BB~3 adduct ~n~ smallest for the BF 3 which is in agreement with the acid strengths. If electronegativities of the substituents were the only important effect, and since c~ Br ,one would expect the electron density at the boron nucleus to vary as BF3

The Smiles rearrangement in hydrazidic systems and related syntheses /|nG. A. Pawelchak. -- 260 St. Catharines, Ont. : [s. n.],

This research was directed towards the investigation of the Smiles rearrangement in hydrazidic systems and the synthesis of related heterocyclic compounds. The work can be conveniently divided into two main sections. Section 1 of the thesis relates to the synthesis and examination of the O+N migration of phenoxy- derivatives of hydrazidic halides. In general, hydrazidic halides were found to react with 2-nitrophenol and 4-nitrophenol to give corresponding a-nitrophenoxy- compounds. These a-nitrophenoxy- compounds were found to rearrange in warm base to give the corresponding N-benzoyl compounds via a proposed five-membered transition state. Experiments conducted in styrene revealed no radical contribution to the rearrangement. Cross-over product analysis indicated the rearrangement as intramolecular and consistent with the Smiles rearrangement. The preparation of N-a-chlorobenzylidene-N'-2-nitrophenyl- -N'-(2,4-dibromophenyl)hydrazine from N-benzoyl-N'-2-nitrophenyl- N'-(2,4-dibromophenyl)hydrazine was accomplished using phosphorus oxychloride. Examination of this hydrazidic chloride indicated a marked decrease .in reactivity as compared to the N-a-chlorobenzylidene-N'-phenylhydrazine case. Section 2 concerns itself with the preparation of heterocyclic compounds using an analogy of the five-membered transition state present in the Smiles rearrangement of a substituted benzylidene derivatives A new preparation of 2,4-phenyl1,3,4- oxadiazol-S-one using N-benzoyl-N'-phenylhydrazine and ethyl thiochloroformate is reported. Two new preparations of N-a-thiobenzoyl-N'-(2,4-dibromophenylhydrazine are reported using sodium hydrosulfide in conjunction with N-a-bromobenzylidene-N'-(2,4-dibromophenyl)hydrazine in the first, and phosphorus pentasulfide with N-benzoylN'-( 2,4-dibromophenyl)hydrazine in the second. The latter is preferred due to the formation of a sulfide co-product in the former. Two preparations of 2-phenyl-4-(2,4-dibromophenyl)-1,3,4- thiadiazol-S-one are reported using N-thiobenzoyl-N'-(2,4-dibromophenyl) hydrazine and ethyl chloroformate and ethyl thiochloroformate Two rapid and easy preparations of 2-phenyl-4-(2,4-dibromophenyl)- 1,3,4-triazol-S-one are reported using ethyl chloroformate and ethyl thiochloroformate. Sodium cyanate in conjunction with a-aminobenzylidene-N'-(2,4-dibromophenyl)hydrazine also provided 2-phenyl-4-(2,4-dibromophenyl)-1,3,4-triazol-S-one Section 2 concludes with an examination of two possible mechanistic routes to the prepared heterocycles.

Reactions of various aromatic nitro-compounds and anthraquinones with selected bases and nucleophiles

The Introducti on deals mainly with hi storical studies on aryne chemi stry and ring closure via arynes , hydride replacement from aromatic rings by nucleophi les, c l eavage of anthr aquinones in basic medium and the Leuckart reaction . This work can be divided into two main s ect i ons. Section I is concerned with the investigation of t he reaction of some aromatic ni t ro-compounds with potassamide in l iquid ammonia. 3-Amino-4- nitrobenzophenone was obtained from the reacti on of 4-nitrobenzophenone with t his reagent, toge t her with benzoic acid formed in a competing Haller-Bauer reaction. Nitrobenzene under these conditions gave a complex mixture from which 2-phenylphenol was isolated; a reaction i nvolving benzyne may be i nvo l ved. 4-Nitrodiphenyl sulfone gave 4-aminodiphenyl sulfone and 4-nitroani l ine. 4-Ethoxydiphenyl sulfone and 4-ethoxynitrobenzene were isolated when ethanol was used as a co-solvent in the reaction. Oxidative coupling reactions were observed with nitrotoluenes. 4-Nitrotoluene gave 4,4t-dinitrobibenzyl which i n a pro longed reaction gave 4,4t-dinitros t ilbene . 2-Nitrotoluene gave 2 , 2 t-dinitrobibenzyl, but not the corresponding stilbene derivative even after a longer time . A rather i nteresting result was obtained with 1-nitro-2,4,6- trimethylbenzene which gave a stilbene derivative only. Also the corresponding stilbene was obtained from bis-(4-nitrophenyl)-methane in a rather slow r eaction with this reagent . Section II deals wi th (i) the preparation of 5-chloro- 1-N-methyl aminoanthraquinone and a new synthesis of N-methyl acridones and (ii) treatment of chloro-anthraquinones with fo rmamide and a new synthesis of chloro-anthracenes . 5-Chloro-1 -N-methylaminoanthraqui none was synthesised f rom 1,5-dichloroanthraquinone by treatment with N-methylformamide. Treatment of 5-chloro-1-N-methylaminoanthraquinone with potassamide in liquid ammonia or with potassium t-butoxide i n t-butylbenzene gave N-methylacridone-1-carboxylic acid. This pleasing result, t he outcome of r i ng opening and alter native ring closure, is being extended to related ring systems.

Découverte et application de nouveaux motifs d'association propres à l'hexaphénylbenzène et à ses dérivés

Les propriétés des matériaux moléculaires proviennent à la fois de la structure des composantes individuelles et de la façon dont elles s’associent. Ce dernier aspect reste difficile à contrôler, malgré de grandes avancées en science des matériaux. Pour mieux comprendre la relation structure-propriétés, nous avons entrepris une étude systématique de l'hexaphénylbenzène et de ses dérivés, qui offrent une charpente symétrique et rigide. En premier lieu, nous avons attaché six groupements diaminotriazinyles sur l’hexaphénylbenzène afin de produire des réseaux tridimensionnels hautement poreux maintenus par des ponts hydrogène. En modifiant systématiquement le coeur moléculaire, nous avons excisé près du tiers de la molécule-mère, générant des réseaux supramoléculaires dont la porosité s’est élevée graduellement jusqu’à 75%, équivalant ainsi le record pour ce type de matériaux. Ensuite, nous avons étudié le comportement de l’hexakis(4-nitrophényl)benzène. Dans les structures cristallines obtenues, des interactions non-covalentes entre groupements nitro démontrent leur potentiel en chimie supramoléculaire. Le coeur moléculaire ne joue qu’un rôle secondaire dans l’empilement des molécules : seules quelques interactions C-H•••π impliquant le cycle aromatique central de l’hexaphénylbenzène sont évidentes. Cette dernière observation nous a poussés à étudier le comportement à l’état cristallin de l’hexaphénylbenzène et ses dérivés. En scrutant attentivement neuf structures cristallines de ces composés, nous avons décerné la présence récurrente d’interactions C-H•••π impliquant le cycle aromatique central. Cette association caractéristique a été exploitée pour créer des réseaux supramoléculaires maintenus par des interactions C-H•••π sélectives entre un groupement éthynyle et le cycle aromatique central de l’hexaphénylbenzène. Finalement, nous avons joint le côté sombre de l’ingénierie cristalline en utilisant nos connaissances dans le but d’empêcher la formation d’interactions directionnelles. En protégeant le cycle aromatique central de l’hexaphénylbenzène à l’aide de groupements alkyles, les interactions C-H•••π ont été pratiquement éliminées. Ces résultats offrent la possibilité de créer de nouveaux matériaux amorphes. Dans ces études, focalisées sur le système hexaphénylbenzène, nous avons mis en relief des phénomènes qui sont obscurcis dans d'autres familles de molécules. De plus, ce système a grandement facilité l’utilisation d’une approche méthodique pour explorer la relation structure-propriétés. Nos travaux nous ont amenés à des conclusions de valeur universelle en science des matériaux moléculaires.

Addition stéréosélective de nucléophiles sur un centre acétal : synthèse de nucléosides 1’,2’-cis

Plusieurs analogues de nucléosides thérapeutiques (Ara-C, Clofarabine), utilisés pour le traitement de leucémies, présentent un arrangement 1’,2’-cis entre la nucléobase reliée au centre anomère et le substituant (électroattracteur) en C-2’. Récemment, notre laboratoire a développé une approche synthétique pour former sélectivement des analogues de nucléosides et de thionucléosides 1’,2’-trans et 1’,2’-cis à partir de précurseurs acycliques. Ce mémoire présente une nouvelle méthodologie pour accéder efficacement aux analogues de nucléosides 1’,2’-cis à partir de furanosides. Différents groupements en position anomérique ont été examinés, sous conditions cinétiques en utilisant le bromure de diméthylbore pour générer sélectivement des produits acycliques ou cycliques. Les intermédiaires cinétiques de différents furanosides de méthyle formés en présence de Me2BBr ont été piégés in situ par un thiol pour générer des thioacétals acycliques avec de bonnes voire d’excellentes diastéréosélectivités. Les produits générés sont en accord avec une rétention globale de l’information stéréochimique du centre acétal et deux déplacements SN2 consécutifs ont été suggérés pour rationaliser ces résultats. Toutefois, l’objectif de synthétiser des analogues de nucléosides à partir de furanosides de méthyle a échoué. Tel que démontré par le Dr Michel Prévost, l’activation par Me2BBr des lactols des quatres différents furanosides suivie d’une addition in situ d’une base silylée a permis de former diastéréosélectivement les analogues de nucléosides 1’,2’-cis correspondants avec d’excellents rendements. Nous avons démontré que d’autres substrats peuvent être employés et que l’induction stéréochimique est sous contrôle du substituant électroattracteur en C-2. D’autres acides de Lewis, tel que TMSBr, peuvent également être utilisés. Cette méthodologie a également été étendue à d’autres nucléophiles tels que des Grignards ou des éthers d’énols silylés, conduisant à de bonnes sélectivités.

Conception, synthèse et diversification de l'azaGly-Pro : un mime de tour beta, outil d'étude structure-activité : application au développement d'un nouvel agent tocolytique

Les accouchements prématurés constituent un problème médical majeur en constante augmentation et ce, malgré tous les efforts mis en œuvre afin de contrer le déclenchement des contractions avant terme. Cette thèse relate du ''design'' rationnel d'un nouvel agent thérapeutique (i.e., tocolytique) qui serait capable de 1) arrêter les contractions, et 2) prolonger la gestation. Pour ce faire, une nouvelle cible, la prostaglandine F2α et son récepteur ont été sélectionnés et le peptidomimétisme a été choisi afin de résoudre cette problématique. L'introduction contient un historique rapide de la conception à la synthèse (''drug design'') du peptide parent, le PDC113, premier peptide a avoir démontré des aptitudes tocolytiques suffisantes pour faire du peptidomimétisme. La deuxième partie de l'introduction présente les concepts du peptidomimétisme appliqués au PDC113 qui ont permis d'accéder au PDC113.824, inhibiteur allostérique du récepteur de la prostaglandine F2α, et explique comment ce mime nous a permis d'élucider les mécanismes de signalisation intracellulaire impliqués dans la contraction musculaire lisse. Cette thèse présente la conception, la synthèse et l'étude structure-activité de mimes de repliement de tour β au sein du mime peptidique original (PDC113.824) dans lequel nous avons remplacé l'azabicycloalkane central (l'indolizidin-2-one) par une série d'autres azabicycloalcanes connus et des acides aza-aminés dont nous avons élaboré la synthèse. Dans un premier temps, une nouvelle stratégie de synthèse en solution de l'aza-glycyl-proline à partir de la diphényle hydrazone et du chloroformate de p-nitrophényle a été réalisée. Cette stratégie a permis d'éliminer les réactions secondaires de cyclisation intramoléculaires communément obtenues lors de l'introduction d'acides aza-aminés avec les protections traditionnelles de type carbamate en présence de phosgène, mais aussi de faciliter l'accès en une étape à des dérivés peptidiques du type aza-glycyle. L'élongation de l'aza-glycyl-proline en solution nous a permis d'accéder à un nouveau mime tetrapeptidique du Smac, un activateur potentiel de l'apoptose au sein de cellules cancéreuses. Par la suite, nous avons développé une stratégie de diversification sélective de l'azote α du résidu azaglycine en utilisant différents types d'halogénures d'alkyle en présence de tert-butoxyde de potassium. Afin de valider le protocole d'alkylation de l'aza-dipeptide, différents halogénures d'alkyle ont été testés. Nous avons également démontré l'utilité des aza-dipeptides résultants en tant que ''building block'' afin d'accéder à une variété d'azapeptides. En effet, l'aza-dipeptide a été déprotégée sélectivement soit en N-terminal soit en C-terminal, respectivement. D'autre part, la libération de l'amine de l'ester méthylique de l'aza-alkylglycyl-proline a conduit à une catégorie de composés à potentiel thérapeutique, les azadicétopipérazines (aza-DKP) par cyclisation intramoléculaire. Enfin, notre intérêt quant au développement d'un nouvel agent tocolytique nous a amené à développer une nouvelle voie de synthèse en solution du PDC113.824 permettant ainsi d'élucider les voies de signalisation intracellulaires du récepteur de la prostaglandine F2α. Afin de valider l'importance de la stéréochimie et d'étudier la relation structure/ activité du mime, nous avons remplacé l'indolizidin-2-one (I2aa) centrale du PDC113.824 par une série d'autres azabicycloalcanes et azadipeptides. Les azabicycloalcanes D-I2aa, quinolizidinone, et indolizidin-9-one ont été synthétisés et incorporés au sein du dit peptide ne donnant aucune activité ni in vitro ni ex vivo, validant ainsi l'importance du tour β de type II' pour le maintien de l'activité biologique du PDC113.824. Finalement, l'insertion d'une série de dérivés aza(alkyl)glycyl-prolyles a mené à de nouveaux inhibiteurs allostériques du récepteur de la PGF2α, l'un contenant l'azaglycine et l'autre, l'azaphénylalanine. Cette thèse a ainsi contribué, grâce à la conception et l'application de nouvelles méthodes de synthèse d'aza-peptides, au développement de nouveaux composés à potentiel thérapeutique afin d'inhiber le travail prématuré.

Développement de modèles prédictifs de la toxicocinétique de substances organiques

Les modèles pharmacocinétiques à base physiologique (PBPK) permettent de simuler la dose interne de substances chimiques sur la base de paramètres spécifiques à l’espèce et à la substance. Les modèles de relation quantitative structure-propriété (QSPR) existants permettent d’estimer les paramètres spécifiques au produit (coefficients de partage (PC) et constantes de métabolisme) mais leur domaine d’application est limité par leur manque de considération de la variabilité de leurs paramètres d’entrée ainsi que par leur domaine d’application restreint (c. à d., substances contenant CH3, CH2, CH, C, C=C, H, Cl, F, Br, cycle benzénique et H sur le cycle benzénique). L’objectif de cette étude est de développer de nouvelles connaissances et des outils afin d’élargir le domaine d’application des modèles QSPR-PBPK pour prédire la toxicocinétique de substances organiques inhalées chez l’humain. D’abord, un algorithme mécaniste unifié a été développé à partir de modèles existants pour prédire les PC de 142 médicaments et polluants environnementaux aux niveaux macro (tissu et sang) et micro (cellule et fluides biologiques) à partir de la composition du tissu et du sang et de propriétés physicochimiques. L’algorithme résultant a été appliqué pour prédire les PC tissu:sang, tissu:plasma et tissu:air du muscle (n = 174), du foie (n = 139) et du tissu adipeux (n = 141) du rat pour des médicaments acides, basiques et neutres ainsi que pour des cétones, esters d’acétate, éthers, alcools, hydrocarbures aliphatiques et aromatiques. Un modèle de relation quantitative propriété-propriété (QPPR) a été développé pour la clairance intrinsèque (CLint) in vivo (calculée comme le ratio du Vmax (μmol/h/kg poids de rat) sur le Km (μM)), de substrats du CYP2E1 (n = 26) en fonction du PC n octanol:eau, du PC sang:eau et du potentiel d’ionisation). Les prédictions du QPPR, représentées par les limites inférieures et supérieures de l’intervalle de confiance à 95% à la moyenne, furent ensuite intégrées dans un modèle PBPK humain. Subséquemment, l’algorithme de PC et le QPPR pour la CLint furent intégrés avec des modèles QSPR pour les PC hémoglobine:eau et huile:air pour simuler la pharmacocinétique et la dosimétrie cellulaire d’inhalation de composés organiques volatiles (COV) (benzène, 1,2-dichloroéthane, dichlorométhane, m-xylène, toluène, styrène, 1,1,1 trichloroéthane et 1,2,4 trimethylbenzène) avec un modèle PBPK chez le rat. Finalement, la variabilité de paramètres de composition des tissus et du sang de l’algorithme pour les PC tissu:air chez le rat et sang:air chez l’humain a été caractérisée par des simulations Monte Carlo par chaîne de Markov (MCMC). Les distributions résultantes ont été utilisées pour conduire des simulations Monte Carlo pour prédire des PC tissu:sang et sang:air. Les distributions de PC, avec celles des paramètres physiologiques et du contenu en cytochrome P450 CYP2E1, ont été incorporées dans un modèle PBPK pour caractériser la variabilité de la toxicocinétique sanguine de quatre COV (benzène, chloroforme, styrène et trichloroéthylène) par simulation Monte Carlo. Globalement, les approches quantitatives mises en œuvre pour les PC et la CLint dans cette étude ont permis l’utilisation de descripteurs moléculaires génériques plutôt que de fragments moléculaires spécifiques pour prédire la pharmacocinétique de substances organiques chez l’humain. La présente étude a, pour la première fois, caractérisé la variabilité des paramètres biologiques des algorithmes de PC pour étendre l’aptitude des modèles PBPK à prédire les distributions, pour la population, de doses internes de substances organiques avant de faire des tests chez l’animal ou l’humain.

Les azasulfurylpeptides : synthèse, analyse conformationnelle et applications biologiques

Les azasulfurylpeptides sont des mimes peptidiques auxquels le carbone en position alpha et le carbonyle d’un acide aminé sont respectivement remplacés par un atome d’azote et un groupement sulfonyle (SO2). Le but premier de ce projet a été de développer une nouvelle méthode de synthèse de ces motifs, également appelés N-aminosulfamides. À cette fin, l’utilisation de sulfamidates de 4-nitrophénol s’est avérée importante dans la synthèse des azasulfuryltripeptides, permettant le couplage d’hydrazides avec l’aide d’irradiation aux micro-ondes (Chapitre 2). Par la suite, en quantité stoechiométrique d’une base et d’un halogénure d’alkyle, les azasulfurylglycines (AsG) formés peuvent être chimiosélectivement alkylés afin d’y insérer diverses chaînes latérales. Les propriétés conformationnelles des N-aminosulfamides à l’état solide ont été élucidées grâce à des études cristallographiques par rayons X : elles possèdent une structure tétraédrique autour de l’atome de soufre, des traits caractéristiques des azapeptides et des sulfonamides, ainsi que du potentiel à favoriser la formation de tours gamma (Chapitre 3). Après le développement d’une méthode de synthèse des N-aminosulfamides en solution, une approche combinatoire sur support solide a également été élaborée sur la résine amide de Rink afin de faciliter la génération d’une librairie d’azasulfurylpeptides. Cette étude a été réalisée en employant le growth hormone releasing peptide 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2). Ce dernier est un hexapeptide possédant une affinité pour deux récepteurs, le growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a) et le récepteur cluster of differenciation 36 (CD36). Une affinité sélective envers le récepteur CD36 confère des propriétés thérapeutiques dans le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Six analogues d’azasulfurylpeptides de GHRP-6 utilisés comme ligands du CD36 ont été synthétisés sur support solide, mettant en évidence le remplacement du tryptophane à la position 4 de GHRP-6 (Chapitre 4). Les analogues de GHRP-6 ont été ensuite analysés pour leur capacité à moduler les effets de la fonction et de la cascade de signalisation des ligands spécifiques au Toll-like receptor 2 (TLR2), en collaboration avec le Professeur Huy Ong du département de Pharmacologie à la Faculté de Pharmacie de l’Université de Montréal. Le complexe TLR2-TLR6 est reconnu pour être co-exprimé et modulé par CD36. En se liant au CD36, certains ligands de GHRP-6 ont eu un effet sur la signalisation du TLR2. Par exemple, les azasulfurylpeptides [AsF(4-F)4]- et [AsF(4-MeO)4]-GHRP-6 ont démontré une capacité à empêcher la surproduction du monoxyde d’azote (NO), un sous-produit réactif formé suite à l’induction d’un signal dans les macrophages par des ligands spécifiques liés au TLR2, tel le fibroblast-stimulating lipopeptide 1 (R-FSL-1) et l’acide lipotéichoïque (LTA). En addition, la sécrétion du tumor necrosis factor alpha (TNFa) et du monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), ainsi que l’activation du nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kB), ont été réduites. Ces résultats démontrent le potentiel de ces azasulfurylpeptides à pouvoir réguler le rôle du TLR2 qui déclenche des réponses inflammatoires et immunitaires innées (Perspectives). Finalement, le potentiel des azasulfurylpeptides d’inhiber des métallo-bêta-lactamases, tels le New-Delhi Metallo-bêta-lactamase 1 (NDM-1), IMP-1 et le Verona Integron-encoded Metallo-bêta-lactamase 2 (VIM-2), a été étudié en collaboration avec le Professeur James Spencer de l’Université de Bristol (Royaumes-Unis). Certains analogues ont été des inhibiteurs micromolaires du IMP-1 (Perspectives). Ces nouvelles voies de synthèse des azasulfurylpeptides en solution et sur support solide devraient donc permettre leur utilisation dans des études de relations structure-activité avec différents peptides biologiquement actifs. En plus d'expandre l'application des azasulfurylpeptides comme inhibiteurs d'enzymes, cette thèse a révélé le potentiel de ces N-aminosulfamides à mimer les structures secondaires peptidiques, tels que les tours gamma. À cet égard, l’application des azasulfurylpeptides a été démontrée par la synthèse de ligands du CD36 présentant des effets modulateurs sur le TLR2. Compte tenu de leur synthèse efficace et de leur potentiel en tant qu’inhibiteurs, les azasulfurylpeptides devraient trouver une large utilisation dans les sciences de peptides pour des applications dans la médecine et de la chimie biologique.