Pontes de Calliphora vicina, Robineau-Desvoidy et de Calliphora vomitoria, (Linné) (Diptères, Calliphoridae) sur un cadavre humain enseveli dans la neige.

Résumé : Les auteurs rapportent un cas où des mouches nécrophages ont pondu dans des conditions extrêmes sur un corps enseveli dans un névé. Cette enquête apporte des éléments importants sur l'activité de vol et les possibilités de pontes de deux espèces de mouches nécrophages. Ces données dépassent largement ce qui est généralement admis dans la littérature spécialisée.

Étude du mécanisme de transport des cations par la Na, K-ATPase et de son implication dans la migraine familiale hémiplégique de type 2

Résumé La Na,K-ATPase est une protéine transmembranaire, présente dans toutes les cellules de mammifères et indispensable à la viabilité cellulaire. Elle permet le maintien des gradients sodiques et potassiques à l'origine du potentiel membranaire en transportant 3 Na+ en dehors de la cellule contre 2 K+, grâce à l'énergie fournie par l'hydrolyse d'une molécule d'ATP. Le potentiel membranaire est indispensable au maintien de l'excitabilité cellulaire et à la transmission de l'influx nerveux. Il semblerait que la Na,K-ATPase soit liée à l'hypertension et à certains troubles neurologiques comme la Migraine Familiale Hémiplégique (1VIFH). La MFH est une forme de migraine avec aura, qui se caractérise par une hémiparésie. Cette forme de migraine est très rare. Elle se transmet génétiquement sur un mode autosomique dominant. Plusieurs mutations localisées dans le gène de la Na,K-ATPase ont été identifiées durant ces 3 dernières années. C'est la première fois qu'une maladie génétique est associée au gène de la Na,K-ATPase. La compréhension du fonctionnement de cette protéine peut donner des informations sur les mécanismes conduisant à ces pathologies. On sait que la fonction d'une protéine est liée à sa structure. L'étude de sa fonction nécessite donc l'étude de sa structure. Alors que la structure de la SERCA a été déterminée à haute résolution, par cristallographie, celle de la Na,K-ATPase ne l'est toujours pas. Mais ces 2 ATPases présentent une telle homologie qu'un modèle de la Na,K-ATPase a pu être élaboré à partir de la structure de la SERCA. Les objectifs de cette étude sont d'une part, de comprendre le contrôle de l'accessibilité du K+ extracellulaire àses sites de liaison. Pour cela, nous avons ciblé cette étude sur la 2ìème et la 31eme boucle extracellulaire, qui relient respectivement les segments transmembranaires (STM) 3-4 et 5-6. Le choix s'est porté sur ces 2 boucles car elles bordent le canal des cations formés des 4ième' Sième et 6'ème hélices. D'autre part, nous avons également essayer de comprendre les effets des mutations, liées à la Migraine Familiale Hémiplégique de type 2 (MFH2), sur la fonctionnalité de la Na,K-ATPase. Alors que les STM et les domaines cytoplasmiques sont relativement proches entre la Na,KATPase et la SERCA, les boucles extracellulaires présentent des différences. Le modèle n'est donc pas une approche fiable pour déterminer la structure et la fonction des régions extracellulaires. Nous avons alors utilisé une approche fonctionnelle faisant appel à la mutation dirigée puis à l'étude de l'activité fonctionnelle de la Na,K ATPase par électrophysiologie sur des ovocytes de Xenopus. En conclusion, nous pouvons dire que la troisième boucle extracellulaire participerait à la structure de la voie d'entrée des cations et que la deuxième boucle extracellulaire semble impliquée dans le contrôle de l'accessibilité des ions K+àses sites de liaison. Concernant les mutations associées à la MFH2, nos résultats ont montré une forte diminution de l'activité fonctionnelle de la pompe Na,K, inférieure aux conditions physiologiques de fonctionnement, et pour une des mutations nous avons observés une diminution de l'affmité apparente au K+ externe. Nous poumons faire l'hypothèse que l'origine pathologique de la migraine est liée à une diminution de l'activité de la pompe à Na+. Summary The Na,K-ATPase is a transmembrane protein, present in all mammalian cells and is necessary for the viability of the cells. It maintains the gradients of Na+ and K+ involved in the membrane potential, by transporting 3Na+ out the cell, and 2K+ into the cell, using the energy providing from one ATP molecule hydrolysis. The membrane potential is necessary for the cell excitability and for the transmission of the nervous signal. Some evidence show that Na,K-ATPase is involved in hypertension and neurological disorders like the Familial Hemiplegic Migraine (FHM). La FHM is a rare form of migraine characterised by aura and hemiparesis and an autosomal dominant transmission. Several mutations linked to the Na,KATPase gene have been identified during these 3 last years. It's the first genetic disorder associated with the Na,K-ATPase gene. Understand the function of this protein is important to elucidate the mechanisms implicated in these pathologies. The function of a protein is linked with its structure. Thus, to know the function of a protein, we need to know its structure. While the Ca-ATPase (SERCA) has been crystallised with a high resolution, the structure of the Na,K-ATPase is not known. Because of the great homology between these 2 ATPases, a model of the Na,K-ATPase was realised by comparing with the structure of the SERCA. The aim of this study is on one side, understand the control of the extracellular K+ accessibility to their binding sites. Because of theirs closed proximity with the cation pathway, located between the 4th, 5th and 6th helices, we have targeted this study on the 2nd and the 3rd extracellular loops linking respectively the transmembrane segment (TMS) 3 and 4, and the TMS 5 and 6. And on the other side, we have tried to understand the functional effects of mutations linked with the Familial Hemiplegic Migraine Type 2 (FHM2). In contrast with the transmembrane segments and the cytoplasmic domains, the extracellular loops show lots of difference between Na,K-ATPase and SERCA, the model is not a good approach to know the structure and the function of the extracellular loops. Thus, we have used a functional approach consisting in directed mutagenesis and the study of the functional activity of the Na,K-ATPase by electrophysiological techniques with Xenopus oocytes. In conclusion, we have demonstrated that the third extracellular loop could participate in the structure of the entry of the cations pathway and that the second extracellular loop could control the K+ accessibility to their binding sites. Concerning the mutations associated with the FHM2, our results showed a strong decrease in the functional activity of the Na,K-pump under physiological conditions and for one of mutations, induce a decrease in the apparent external K+ affinity. We could make the hypothesis that the pathogenesis of migraine is related to the decrease in Na,K-pump activity. Résumé au large publique De la même manière que l'assemblage des mots forme des phrases et que l'assemblage des phrases forme des histoires, l'assemblage des cellules forme des organes et l'ensemble des organes constitue les êtres vivants. La fonction d'une cellule dans le corps humain peut se rapprocher de celle d'une usine hydroélectrique. La matière première apportée est l'eau, l'usine électrique va ensuite convertir l'eau en énergie hydraulique pour fournir de l'électricité. Le fonctionnement de base d'une cellule suit le même processus. La cellule a besoin de matières premières (oxygène, nutriments, eau...) pour produire une énergie sous forme chimique, l'ATP. Cette énergie est utilisée par exemple pour contracter les muscles et permet donc à l'individu de se déplacer. Morphologiquement la cellule est une sorte de petit sac rempli de liquide (milieu intracellulaire) baignant elle-même dans le liquide (milieu extracellulaire) composant le corps humain (un adulte est constitué environ de 65 % d'eau). La composition du milieu intracellulaire est différente de celle du milieu extracellulaire. Cette différence doit être maintenue pour que l'organisme fonctionne correctement. Une des différences majeures est la quantité de sodium. En effet il y a beaucoup plus de sodium à l'extérieur qu'à l'intérieur de la cellule. Bien que l'intérieur de la cellule soit isolé de l'extérieur par une membrane, le sodium arrive à passer à travers cette membrane, ce qui a tendance à augmenter la quantité de sodium dans la cellule et donc à diminuer sa différence de concentration entre le milieu extracellulaire et le milieu intracellulaire. Mais dans les membranes, il existe des pompes qui tournent et dont le rôle est de rejeter le sodium de la cellule. Ces pompes sont des protéines connues sous le nom de pompe à sodium ou Na,K-ATPase. On lui attribue le nom de Na,K-ATPase car en réalité elle rejette du sodium (Na) et en échange elle fait entrer dans la cellule du potassium (K), et pour fonctionner elle a besoin d'énergie (ATP). Lorsque les pompes à sodium ne fonctionnent pas bien, cela peut conduire à des maladies. En effet la Migraine Familiale Hémiplégique de type 2, est une migraine très rare qui se caractérise par l'apparition de la paralysie de la moitié d'un corps avant l'apparition du mal de tête. C'est une maladie génétique (altération qui modifie la fonction d'une protéine) qui touche la pompe à sodium située dans le cerveau. On a découvert que certaines altérations (mutations) empêchent les pompes à sodium de fonctionner correctement. On pense alors que le développement des migraines est en partie dû au fait que ces pompes fonctionnent moins bien. Il est important de bien connaître la fonction de ces pompes car cela permet de comprendre des mécanismes pouvant conduire à certaines maladies, comme les migraines. En biologie, la fonction d'une protéine est étudiée à travers sa structure. C'est pourquoi l'objectif de cette thèse a été d'étudier la structure de la Na,K-ATPase afin de mieux comprendre son mécanisme d'action.

L'ostéolyse expansive familiale : manifestations otologiques et dentaires d'origine génétique

RESUME Nous rapportons l'étude d'une famille de 49 membres sur 5 générations. Parmi 35 membres étudiés, 18 sont atteints d'Osteolyse Expansive Familiale (OEF). L'OEF est une dysplasie osseuse génétique rare, autosomique dominante, dont les altérations locales et générales du squelette ont une distribution périphérique prédominante qui devient manifeste à partir de la deuxième décennie de vie. Une résorption ostéoclastique progressive, accompagnée d'une faible activité ostéoblastique, est à l'origine d'une expansion médullaire osseuse. Cette dernière est caractérisée par une raréfaction de la moelle osseuse qui est remplacée par du tissu fibreux et de la graisse. L'amincissement de la moelle osseuse aboutit à des déformations invalidantes, sévères et douloureuses du squelette, avec tendance aux fractures spontanées. La première manifestation clinique de la maladie est une surdité de transmission très précoce résultant d'une lyse de la chaîne ossiculaire. Radiologiquement, il existe toujours une pneumatisation marquée de la mastoïde et du rocher. Les dents montrent des signes importants de résorption osseuse au niveau de la région apicale et/ou du collet, dont l'aspect est caractéristique et unique. La phosphatase alcaline sérique, l'hydroxyproline et la deoxypiridoline urinaire sont élevées à des taux variables. Le taux de calcium et d'hormone parathyroïdienne est normal. Le traitement par les diphosphonates, la calcitonine et la vitamine D est inefficace. Histologiquement, l'OEF présente des similitudes avec la maladie de Paget, mais l'âge de début, la distribution des lésions osseuses, les altérations dentaires et de l'oreille moyenne, ainsi que la progression clinique sont différents. Il en va de même pour la dysplasie fibreuse, l'ostéite fibro-kystique et l'ostéogénèse imparfaite. Le gêne responsable de la maladie se localise dans la région du chromosome 18q21-22. Récemment, des mutations du TNFRSF 11A, gêne qui codifie le RANK, ont été identifiées comme étant la cause de l'OEF. La duplication de la 18ème paire de base au niveau de l'exon 1 suggère qu'il correspond au site de l'anomalie. La technique chirurgicale et les résultats audiométriques à court et long terme de 13 interventions chez 8 patients sont présentés. ABSTRACT Objectives: Familial Expansive Osteolysis (EEO) is a rare autosomal dominant bone dys¬plasia. The disease can show general and focal skeletal alterations, the latter having a pre¬dominantly peripheral distribution. Onset occurs after the second decade of life. Patients and methods: We present the study, of 30 years, of a family consisting of 49 members covering five generations. Results: Among the 35 members studied, 18 have familial expansive osteolysis (FEO). The first clinical sign of the condition is transmission deafness at an early age. The features of the teeth has a unique and characteristic appearance. Thinning of the corti¬cal bone leads to severe, painful, disabling deformities. Serum alkaline phosphatase, and urinary hydroxyproline and deoxipyridinoline are elevated. Calcium and parathyroid hor¬mone are normal. Treatment with diphosphonates, calcitonin and vitamin D has been unsuccessful. We present the surgical technology and the results to short and long term of 13 interventions on 8 patients. Conclusion: Progressive osteoclastic reabsorption accompanied by weak osteoblastic activ¬ity results in medullary expansion characterized by rarefaction of the bone marrow, which is replaced by fibrous tissue and fat. FE0 is histologically similar to Paget disease, but the age of onset, the distribution of the bone lesions, the dental and middle ear alterations, and the clin¬ical progression are different. These features also differentiate FE0 from fibrous dysplasia, fibrocystic osteitis and imperfect osteogenesis. The gene responsible for EEO is located in the 18q21-22 chromosome region. Mutations in TNFRSF11A, the gene encoding receptor activa¬tor of nuclear factor-kappa-B (RANK), has been recently identified as the cause of FEO. A duplication of 18 base pairs in exon 1 of the TNFRSF11A gene suggests that this corresponds to the site of the anomaly and can be considered a "hot spot" for mutations.

Roles of transient guidepost neurons in corpus callosum formation and guidance

RESUMENeurones transitoires jouant un rôle de cibles intermédiaires dans le guidage des axones du corps calleuxLe guidage axonal est une étape clé permettant aux neurones d'établir des connexions synaptiques et de s'intégrer dans un réseau neural fonctionnel de manière spécifique. Des cellules-cibles intermédiaires appelées « guidepost » aident les axones à parcourir de longues distances dans le cerveau en leur fournissant des informations directionnelles tout au long de leur trajet. Il a été démontré que des sous-populations de cellules gliales au niveau de la ligne médiane guident les axones du corps calleux (CC) d'un hémisphère vers l'autre. Bien qu'il fût observé que le CC en développement contenait aussi des neurones, leur rôle était resté jusqu'alors inconnu.La publication de nos résultats a montré que pendant le développement embryonnaire, le CC contient des glies mais aussi un nombre considérable de neurones glutamatergiques et GABAergiques, nécessaires à la formation du corps calleux (Niquille et al., PLoS Biology, 2009). Dans ce travail, j'ai utilisé des techniques de morphologie et d'imagerie confocale 3D pour définir le cadre neuro-anatomique de notre modèle. De plus, à l'aide de transplantations sur tranches in vitro, de co-explants, d'expression de siRNA dans des cultures de neurones primaires et d'analyse in vivo sur des souris knock-out, nous avons démontré que les neurones du CC guident les axones callosaux en partie grâce à l'action attractive du facteur de guidage Sema3C sur son récepteur Npn- 1.Récemment, nous avons étudié l'origine, les aspects dynamiques de ces processus, ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de ce faisceau axonal (Niquille et al., soumis). Tout d'abord, nous avons précisé l'origine et l'identité des neurones guidepost GABAergiques du CC par une étude approfondie de traçage génétique in vivo. J'ai identifié, dans le CC, deux populations distinctes de neurones GABAergiques venant des éminences ganglionnaires médiane (MGE) et caudale (CGE). J'ai ensuite étudié plus en détail les interactions dynamiques entre neurones et axones du corps calleux par microscopie confocale en temps réel. Puis nous avons défini le rôle de chaque sous-population neuronale dans le guidage des axones callosaux et de manière intéressante les neurones GABAergic dérivés de la MGE comme ceux de la CGE se sont révélés avoir une action attractive pour les axones callosaux dans des expériences de transplantation. Enfin, nous avons clarifié la base moléculaire de ces mécanismes de guidage par FACS sorting associé à un large criblage génétique de molécules d'intérêt par une technique très sensible de RT-PCR et ensuite ces résultats ont été validés par hybridation in situ.Nous avons également étudié si les neurones guidepost du CC étaient impliqués dans son agénésie (absence de CC), présente dans nombreux syndromes congénitaux chez 1 humain. Le gène homéotique Aristaless (Arx) contrôle la migration des neurones GABAergiques et sa mutation conduit à de nombreuses pathologies humaines, notamment la lissencéphalie liée à IX avec organes génitaux anormaux (XLAG) et agénésie du CC. Fait intéressant, nous avons constaté qu'ARX est exprimé dans toutes les populations GABAergiques guidepost du CC et que les embryons mutant pour Arx présentent une perte drastique de ces neurones accompagnée de défauts de navigation des axones (Niquille et al., en préparation). En outre, nous avons découvert que les souris déficientes pour le facteur de transcription ciliogenic RFX3 souffrent d'une agénésie du CC associé avec des défauts de mise en place de la ligne médiane et une désorganisation secondaire des neurones glutamatergiques guidepost (Benadiba et al., submitted). Ceci suggère fortement l'implication potentielle des deux types de neurones guidepost dans l'agénésie du CC chez l'humain.Ainsi, mon travail de thèse révèle de nouvelles fonctions pour ces neurones transitoires dans le guidage axonal et apporte de nouvelles perspectives sur les rôles respectifs des cellules neuronales et gliales dans ce processus.ABSTRACTRole of transient guidepost neurons in corpus callosum development and guidanceAxonal guidance is a key step that allows neurons to build specific synaptic connections and to specifically integrate in a functional neural network. Intermediate targets or guidepost cells act as critical elements that help to guide axons through long distance in the brain and provide information all along their travel. Subpopulations of midline glial cells have been shown to guide corpus callosum (CC) axons to the contralateral cerebral hemisphere. While neuronal cells are also present in the developing corpus callosum, their role still remains elusive.Our published results unravelled that, during embryonic development, the CC is populated in addition to astroglia by numerous glutamatergic and GABAergic guidepost neurons that are essential for the correct midline crossing of callosal axons (Niquille et al., PLoS Biology, 2009). In this work, I have combined morphological and 3D confocal imaging techniques to define the neuro- anatomical frame of our system. Moreover, with the use of in vitro transplantations in slices, co- explant experiments, siRNA manipulations on primary neuronal culture and in vivo analysis of knock-out mice we have been able to demonstrate that CC neurons direct callosal axon outgrowth, in part through the attractive action of Sema3C on its Npn-1 receptor.Recently, we have studied the origin, the dynamic aspects of these processes as well as the molecular mechanisms involved in the establishment of this axonal tract (Niquille et al., submitted). First, we have clarified the origin and the identity of the CC GABAergic guidepost neurons using extensive in vivo cell fate-mapping experiments. We identified two distinct GABAergic neuronal subpopulations, originating from the medial (MGE) and caudal (CGE) ganglionic eminences. I then studied in more details the dynamic interactions between CC neurons and callosal axons by confocal time-lapse video microscopy and I have also further characterized the role of each guidepost neuronal subpopulation in callosal guidance. Interestingly, MGE- and CGE-derived GABAergic neurons are both attractive for callosal axons in transplantation experiments. Finally, we have dissected the molecular basis of these guidance mechanisms by using FACS sorting combined with an extensive genetic screen for molecules of interest by a sensitive RT-PCR technique, as well as, in situ hybridization.I have also investigated whether CC guidepost neurons are involved in agenesis of the CC which occurs in numerous human congenital syndromes. Aristaless-related homeobox gene (Arx) regulates GABAergic neuron migration and its mutation leads to numerous human pathologies including X-linked lissencephaly with abnormal genitalia (XLAG) and severe CC agenesis. Interestingly, I found that ARX is expressed in all the guidepost GABAergic neuronal populations of the CC and that Arx-/- embryos exhibit a drastic loss of CC GABAergic interneurons accompanied by callosal axon navigation defects (Niquille et al, in preparation). In addition, we discovered that mice deficient for the ciliogenic transcription factor RFX3 suffer from CC agenesis associated with early midline patterning defects and a secondary disorganisation of guidepost glutamatergic neurons (Benadiba et al., submitted). This strongly points out the potential implication of both types of guidepost neurons in human CC agenesis.Taken together, my thesis work reveals novel functions for transient neurons in axonal guidance and brings new perspectives on the respective roles of neuronal and glial cells in these processes.