Estudio de la estabilidad genética asociada a los procesos de crioconservación de ápices de menta

La crioconservación se ha descrito como una técnica de conservación ex situ a largo plazo que ha sido aplicada con éxito a numerosas especies, y resulta especialmente importante en aquellas con propagación vegetativa, infértiles o amenazadas, en las que sistemas de conservación ex situ más sencillos, como los bancos de semillas, no son posibles. También presenta ventajas frente a la conservación in vitro, ya que logra disminuir o eliminar problemas como la excesiva manipulación del material, evitando los subcultivos periódicos y disminuyendo así el riesgo de contaminaciones y de aparición de variación somaclonal. Sin embargo, someter al material vegetal a los procedimientos que implica la crioconservación provoca distintos estreses. Entre ellos, el estrés oxidativo puede potencialmente producir daños en membranas, proteínas, carbohidratos y en el ADN. En este trabajo se han evaluado diversos sistemas de crioconservación en ápices de Mentha × piperita L., híbrido estéril entre Mentha aquatica L. y Mentha spicata L. Se han utilizado ápices de dos genotipos (‘MEN 186’y ‘MEN 198’) en los cuales se compararon dos técnicas de crioconservación, encapsulación-deshidratación y vitrificación-droplet. El análisis de la supervivencia y capacidad de regeneración del material sometido a los tratamientos de crioconservación, junto con el análisis de la estabilidad genética de dicho material mediante marcadores moleculares (RAPD y AFLP) han permitido comparar los distintos protocolos y tratamientos establecidos. El estudio sobre el tipo de protocolo empleado reveló una mayor variabilidad genética en la técnica de encapsulación-deshidratación, especialmente en el genotipo ‘MEN 186’, ya que ‘MEN 198’ resultó ser más estable en todos los análisis. La inestabilidad encontrada en esta técnica no fue exclusiva de aquellos explantos crioconservados, sino que los pasos previos a la inmersión en nitrógeno líquido (NL) también provocaron variaciones en el ADN. Según el tipo de muestra analizada se encontraron diferencias en la estabilidad: muestras provenientes de callos presentaron una mayor inestabilidad que aquellas de hojas (brotes). Se utilizaron tres medios para la recuperación de los ápices tras la crioconservación con el uso de diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento: “Reed” (0,5 mgL-1 6-bencilaminopurina, BAP), “Senula” (0,5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purina, 2-iP + 0,1 mgL-1 ácido α-naftalen-acético, ANA) y “Nudos” (0,5 mgL-1 BAP + 0,1 mgL-1ANA). El medio “Reed” produjo un aumento en la supervivencia y recuperación de los ápices en ambos genotipos y técnicas, y disminuyó la formación de callo. Sin embargo, no tuvo un efecto significativo en la estabilidad genética. El medio “Senula” provocó una mayor estabilidad genética en el genotipo más inestable, ‘MEN 186’. Para reducir el daño oxidativo producido durante la encapsulación-deshidratación, e incrementar la recuperación de los ápices manteniendo su estabilidad genética, se comparó el efecto de añadir sustancias antioxidantes en el precultivo de los ápices (ácido ascórbico, vitamina E y glutatión). No se obtuvo la respuesta esperada y estos tratamientos no presentaron efectos significativos tanto en la estabilidad como en la recuperación. Para entender mejor qué sucede durante todo el proceso de encapsulación-deshidratación, se evaluó cada paso del protocolo por separado y su efecto en la estabilidad y la recuperación. Además, se determinó el estado de oxidación en cada etapa mediante la cuantificación de malondialdehído y la detección de la formación de radicales libres (mediante el ensayo del ácido tiobarbitúrico, y sondas fluorescentes específicas, respectivamente). Se determinó que a partir de los primeros pasos se genera estrés oxidativo, el cual aumenta a medida que se avanza por el protocolo hasta la inmersión en nitrógeno líquido. Esto se ve reflejado en la disminución progresiva tanto de la recuperación como de la estabilidad genética. Con el uso de antioxidantes en el precultivo (ácido ascórbico y vitamina E) no se obtuvo un efecto positivo en el mantenimiento de la estabilidad genética, y tan sólo con el uso de vitamina E se observó una recuperación mayor en uno de los pasos estudiados (después de la desecación). Sin embargo, cuando se utilizó ácido ascórbico durante el precultivo o la deshidratación osmótica se consiguió disminuir de forma significativa la formación de MDA y la acumulación del radical superóxido (O2•-) en la mayoría los pasos analizados, aunque esta reducción no parece tener un efecto directo en la estabilidad genética del material recuperado. ABSTRACT Cryopreservation has been described as an effective technique for the long term of ex situ conservation that has been successfully applied to numerous species, and is of especial relevance for those with vegetative propagation, infertile or endangered, in which simpler systems of ex situ conservation, such as seed banking, are not feasible. It also has advantages over in vitro conservation, as it reduces or eliminates excessive material handling, avoids periodic subcultures and thus limits the risk of contamination and the appearance of somaclonal variation. However, plant material is subjected to different treatments involved in the cryopreservation procedures, which impose several stresses. Among them, oxidative stress can potentially cause damage to membranes, proteins, carbohydrates and DNA. In this work, two cryopreservation techniques have been evaluated in Mentha × piperita L. shoot tips, sterile hybrid between Mentha aquatica L. and Mentha spicata L. Two genotypes ('MEN 186' and 'MEN 198') were used to compare two techniques: encapsulation-dehydration and droplet-vitrification. The analysis of survival and recovery capacity of the material after the cryopreservation treatments, and the analysis of the genetic stability by molecular markers (RAPD and AFLP) have enabled the comparison between protocols and treatments. The study of the two cryopreservation procedures revealed a higher genetic variability in the encapsulation-dehydration technique, especially in genotype 'MEN 186', as 'MEN 198' was more stable in all analyses. The instability generated in this technique was not exclusive of cryopreserved explants, pretreatments prior to immersion in NL also caused DNA variations. The type of sampled plant material revealed also differences in the stability: callus samples showed greater instability than shoots. Three different culture media were used for the recovery of shoot tips after cryopreservation, using different combinations of growth regulators: "Reed" (0.5 mgL-1 6-benzylaminopurine, BAP), "Senula" (0.5 mgL-1 6-dimetilalilamino-purine, 2-iP + 0.1 mgL-1 α-naphthalene acetic acid, ANA) and "Nodes" (0.5 mgL-1 BAP + 0.1 mgL-1 ANA). "Reed" medium increased survival and recovery of shoot tips in both genotypes and techniques and decreased callus formation. However, it didn`t have a significant effect on genetic stability. "Senula" medium caused a higher genetic stability in the most unstable genotype, 'MEN 186'. To reduce oxidative damage during encapsulation-dehydration, and increase shoot tip recovery and maintain genetic stability, the effect of added antioxidants (ascorbic acid, vitamin E and glutathione) in the shoot tip preculture medium was studied. These treatments had no significant effect on both stability and recovery. To better understand the events during the encapsulation-dehydration process, the effect of each step of the protocol on stability and recovery was evaluated separately. Moreover, the oxidation level was determined by quantifying malondialdehyde (MDA) formation and detecting free radical accumulation (using the thiobarbituric acid assay, and specific fluorescent probes, respectively). The oxidative stress was detected from the first steps and increased throughout the protocol until the immersion in liquid nitrogen. This was also reflected in the gradual decline of recovery and genetic stability. The use of antioxidants (ascorbic acid and vitamin E) in the shoot tip preculture medium had no effect in maintaining genetic stability; only vitamin E increased recovery in one of the steps studied (after desiccation). However, when ascorbic acid was used during the preculture or during the osmotic dehydration, a significantly decrease was observed in MDA formation and superoxide radical accumulation in most of the steps analyzed, although this reduction did not seem to have a direct effect on the genetic stability of recovered material.

Proceso metodológico para optimizar la toma de decisiones en el proyecto de envolventes arquitectónicas multicapa = Methodological process for the optimization of the decision making in multilayer building envelope projects

La presente tesis doctoral se enmarca dentro del concepto de la sistematización del conocimiento en arquitectura, más concretamente en el campo de las construcciones arquitectónicas y la toma de decisiones en la fase de proyecto de envolventes arquitectónicas multicapa. Por tanto, el objetivo principal es el establecimiento de las bases para una toma de decisiones informadas durante el proyecto de una envolvente multicapa con el fin de colaborar en su optimización. Del mismo modo que la historia de la arquitectura está relacionada con la historia de la innovación en construcción, la construcción está sujeta a cambios como respuesta a los fracasos anteriores. En base a esto, se identifica la toma de decisiones en la fase de proyecto como el estadio inicial para establecer un punto estratégico de reflexión y de control sobre los procesos constructivos. La presente investigación, conceptualmente, define los parámetros intervinientes en el proyecto de envolventes arquitectónicas multicapa a partir de una clasificación y sistematización de todos los componentes (elementos, unidades y sistemas constructivos) utilizados en las fachadas multicapa. Dicha sistematización se materializa en una hoja matriz de datos en la que, dentro de una organización a modo de árbol, se puede acceder a la consulta de cada componente y de su caracterización. Dicha matriz permite la incorporación futura de cualquier componente o sistema nuevo que aparezca en el mercado, relacionándolo con aquellos con los que comparta ubicación, tipo de material, etc. Con base en esa matriz de datos, se diseña la sistematización de la toma de decisiones en la fase de proyecto de una envolvente arquitectónica, en concreto, en el caso de una fachada. Operativamente, el resultado se presenta como una herramienta que permite al arquitecto o proyectista reflexionar y seleccionar el sistema constructivo más adecuado, al enfrentarse con las distintas decisiones o elecciones posibles. La herramienta se basa en las elecciones iniciales tomadas por el proyectista y se estructura, a continuación y sucesivamente, en distintas aproximaciones, criterios, subcriterios y posibilidades que responden a los distintos avances en la definición del sistema constructivo. Se proponen una serie de fichas operativas de comprobación que informan sobre el estadio de decisión y de definición de proyecto alcanzados en cada caso. Asimismo, el sistema permite la conexión con otros sistemas de revisión de proyectos para fomentar la reflexión sobre la normalización de los riesgos asociados tanto al proprio sistema como a su proceso constructivo y comportamiento futuros. La herramienta proporciona un sistema de ayuda para ser utilizado en el proceso de toma de decisiones en la fase de diseño de una fachada multicapa, minimizando la arbitrariedad y ofreciendo una cualificación previa a la cuantificación que supondrá la elaboración del detalle constructivo y de su medición en las sucesivas fases del proyecto. Al mismo tiempo, la sistematización de dicha toma de decisiones en la fase del proyecto puede constituirse como un sistema de comprobación en las diferentes fases del proceso de decisión proyectual y de definición de la envolvente de un edificio. ABSTRACT The central issue of this doctoral Thesis is founded on the framework of the concept of the systematization of knowledge in architecture, in particular, in respect of the field of building construction and the decision making in the design stage of multilayer building envelope projects. Therefore, the main objective is to establish the bases for knowledgeable decision making during a multilayer building envelope design process, in order to collaborate with its optimization. Just as the history of architecture is connected to the history of innovation in construction, construction itself is subject to changes as a response to previous failures. On this basis, the decisions made during the project design phase are identified as the initial state to establish an strategic point for reflection and control, referred to the constructive processes. Conceptually, this research defines the parameters involving the multilayer building envelope projects, on the basis of a classification and systematization for all the components (elements, constructive units and constructive systems) used in multilayer façades. The mentioned systematization is materialized into a data matrix sheet in which, following a tree‐like organization, the access to every single component and its characterization is possible. The above data matrix allows the future inclusion of any new component or system that may appear in the construction market. That new component or system can be put into a relationship with another, which it shares location, type of material,… with. Based on the data matrix, the systematization of the decision making process for a building envelope design stage is designed, more particularly in the case of a façade. Putting this into practice, it is represented as a tool which allows the architect or the designer, to reflect and to select the appropriate building system when facing the different elections or the different options. The tool is based on the initial elections taken by the designer. Then and successively, it is shaped on the form of different operative steps, criteria, sub‐criteria and possibilities which respond to a different progress in the definition of the building construction system. In order to inform about the stage of the decision and the definition reached by the project in every particular case, a range of operative sheets are proposed. Additionally, the system allows the connection with other reviewing methods for building projects. The aim of this last possibility is to encourage the reflection on standardization of the associated risks to the building system itself and its future performance. The tool provides a helping system to be used during the decision making process for a multilayer façade design. It minimizes the arbitrariness and offers a qualification previous to the quantification that will be done with the development of the construction details and their bill of quantities, that in subsequent project stages will be executed. At the same time, the systematization of the mentioned decision making during the design phase, can be found as a checking system in the different stages of the decision making design process and in the different stages of the building envelope definition.

Cambios epigenéticos en ápices crioconservados de Mentha xpiperita

La crioconservación ofrece una serie de ventajas sobre otros métodos para la conservación a largo plazo del germoplasma de especies de propagación vegetativa. En comparación con la conservación in vitro tiene la ventaja de reducir los posibles cambios genéticos que pueden ocurrir.

Deutschland.

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Traité de Paix : [entre l'empereur des Français, roi d'Italie, protecteur de la Confédération du Rhin, et l'empereur d'Autriche, roi de Hongre et de Boheme, 14 octobre 1809] Trattato di pace.

Text in french and Itlian.

Electre, tragédie en trois actes.

Libretto by N. F. Guillard.

Il calvario /

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Der mächtige Parrunkowitsch nebst einigen andern miniatür-gottheiten ...

Fictitious imprint; printed at Erfurt, 1800.

Histoire de Marie-Charlotte-Louise, reine des Deux-Siciles /

"Ouvrage présenté à son altesse royale monseigneur le duc de Berry."

Gedichte von Karoline Christiane Louise Rudolphi.

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P. Ovidii Nasonis Fastorum libri VI.

Vol. 2: Index rerum et verborum in Ovidii Fastis occurrentium.

Berlinische musikalische Zeitung.

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Justus Möser's sämmtliche werke.

The special t.-p. of v. 1, a reimpression, is dated 1868.

Il diritto pubblico del regno delle due Sicilie, considerato ne'suoi principali, e più interessanti oggetti,

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Reisen unter Sonne, Mond u. Sternen; ein biographisches Gemälde.

Includes bibliographical references.