Superficial and deep changes of cellular mechanical properties following cytoskeleton disassembly.

The cytoskeleton, composed of actin filaments, intermediate filaments, and microtubules, is a highly dynamic supramolecular network actively involved in many essential biological mechanisms such as cellular structure, transport, movements, differentiation, and signaling. As a first step to characterize the biophysical changes associated with cytoskeleton functions, we have developed finite elements models of the organization of the cell that has allowed us to interpret atomic force microscopy (AFM) data at a higher resolution than that in previous work. Thus, by assuming that living cells behave mechanically as multilayered structures, we have been able to identify superficial and deep effects that could be related to actin and microtubule disassembly, respectively. In Cos-7 cells, actin destabilization with Cytochalasin D induced a decrease of the visco-elasticity close to the membrane surface, while destabilizing microtubules with Nocodazole produced a stiffness decrease only in deeper parts of the cell. In both cases, these effects were reversible. Cell softening was measurable with AFM at concentrations of the destabilizing agents that did not induce detectable effects on the cytoskeleton network when viewing the cells with fluorescent confocal microscopy. All experimental results could be simulated by our models. This technology opens the door to the study of the biophysical properties of signaling domains extending from the cell surface to deeper parts of the cell.

A novel cyclosporin a aqueous formulation for dry eye treatment: in vitro and in vivo evaluation.

PURPOSE: The aim of the present study was the in vitro and in vivo evaluation of a novel aqueous formulation based on polymeric micelles for the topical delivery of cyclosporine A for dry eye treatment. METHODS: In vitro experiments were carried out on primary rabbit corneal cells, which were characterized by immunocytochemistry using fluorescein-labeled lectin I/isolectin B4 for the endothelial cells and mouse monoclonal antibody to cytokeratin 3+12 for the epithelial ones. Living cells were incubated for 1 hour or 24 hours with a fluorescently labeled micelle formulation and analyzed by fluorescence microscopy. In vivo evaluations were done by Schirmer test, osmolarity measurement, CyA kinetics in tears, and CyA ocular distribution after topical instillation. A 0.05% CyA micelle formulation was compared to a marketed emulsion (Restasis). RESULTS: The in vitro experiments showed the internalization of micelles in the living cells. The Schirmer test and osmolarity measurements demonstrated that micelles did not alter the ocular surface properties. The evaluation of the tear fluid gave similar CyA kinetics values: AUC = 2339 ± 1032 min*μg/mL and 2321 ± 881.63; Cmax = 478 ± 111 μg/mL and 451 ± 74; half-life = 36 ± 9 min and 28 ± 9 for the micelle formulation and Restasis, respectively. The ocular distribution investigation revealed that the novel formulation delivered 1540 ± 400 ng CyA/g tissue to the cornea. CONCLUSIONS: The micelle formulation delivered active CyA into the cornea without evident negative influence on the ocular surface properties. This formulation could be applied for immune-related ocular surface diseases.

Cell-selective modulation of the neuromuscular system in Drosophila

The capacity for all living cells to sense and interact with their environment is a necessity for life. In highly evolved, eukaryotic species, like humans, signalling mechanisms are necessary to regulate the function and survival of all cells in the organism. Synchronizing systemic signalling systems at the cellular, organ and whole-organism level is a formidable task, and for most species requires a large number of signalling molecules and their receptors. One of the major types of signalling molecules used throughout the animal kingdom are modulatory substances (e.x. hormones and peptides). Modulators can act as chemical transmitters, facilitating communication at chemical synapses. There are hundreds of circulating modulators within the mammalian system, but the reason for so many remains a mystery. Recent work with the fruit fly, Drosophila melanogaster demonstrated the capacity for peptides to modulate synaptic transmission in a neuron-specific manner, suggesting that peptides are not simply redundant, but rather may have highly specific roles. Thus, the diversity of peptides may reflect cell-specific functions. The main objective of my doctoral thesis was to examine the extent to which neuromodulator substances and their receptors modulate synaptic transmission at a cell-specific level using D. melanogaster. Using three different modulatory substances, i) octopamine - a biogenic amine released from motor neuron terminals, ii) DPKQDFMRFa - a neuropeptide secreted into circulation, and iii) Proctolin - a pentapeptide released both from motor neuron terminals and into circulation, I was able to investigate not only the capacity of these various substances to work in a cell-selective manner, but also examine the different mechanisms of action and how modulatory substances work in concert to execute systemic functionality . The results support the idea that modulatory substances act in a circuit-selective manner in the central nervous system and in the periphery in order to coordinate and synchronize physiologically and behaviourally relevant outputs. The findings contribute as to why the nervous system encodes so many modulatory substances.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Assemblage oligomérique des récepteurs couplés aux protéines G avec les RAMPs

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation.

Etude des propriétés physicochimiques des vecteurs nanoparticulaires

Cette thèse rapporte l’étude des propriétés physicochimiques des nanoparticles polymériques et leur impact sur l’interaction avec les cellules vivantes. Nous nous sommes tout spécialement attachés à étudier l’effet des propriétés adhésives et mécaniques des nanoparticules sur leur capacité de pénétration de la membrane cellulaire. Pour ce faire, nous avons tout d’abord utilisé des nanoparticules d’acide polylactique (PLA) fonctionnalisées en surface avec un ligand des sélectines E et P. Le greffage du ligand sur la particule s’est fait par une nouvelle méthode expérimentale garantissant la présence du ligand à la surface de la particule durant toute sa durée de vie. Cette méthode consiste à mélanger un polymère fonctionnalisé avec le ligand avec un autre polymère non fonctionnalisé. La présence du ligand à la surface des nanoparticules formées à partir de ce mélange de polymères a été confirmée par analyse ToF SIMS. Nous avons pu prouver que les particules possédant le ligand greffé à leur surface démontraient une capacité adhésive supérieure à leurs homologues non fonctionnalisés sur des cellules endothéliales HUVEC activées par différentes drogues. De plus, le captage des particules par les cellules HUVEC est modulé par le niveau d’expression des récepteurs selectine E et P et aussi par la quantité de ligand libre. Ces résultats montrent clairement que le greffage du ligand confère aux particules des propriétés adhésives accrues et spécifiques ce qui permet leur usage postérieure comme vecteur pharmaceutique capable de cibler un récepteur particulier à la surface d’une cellule. Nous avons aussi démontré que l’interaction entre les nanoparticules et la membrane cellulaire peut aussi être contrôlée aussi bien par les propriétés mécaniques de la cellule que de la nanoparticule. Dans une première étape, nous avons mesuré à l’aide de l’appareil de forces de surface l’élasticité de cellules macrophagiques déposées sur différents substrats. En contrôlant l’interaction entre la cellule et le substrat sur lequel elle repose nous avons montré qu’il était possible de modifier à ii volonté les propriétés mécaniques cellulaire. Une augmentation de l’élasticité cellulaire s’accompagne d’une augmentation systématique de l’internalisation de nanoparticules de PLA non fonctionnalisées. Ceci suggère un rôle prépondérant des propriétés mécaniques du cortex cellulaire dans le captage des nanoparticules de PLA. Dans une seconde étape, nous avons étudié l’effet des propriétés mécaniques des nanoparticules sur leur capacité de pénétration cellulaire. Pour ce faire, nous avons synthétisé des particules d’hydrogel dont l’élasticité était contrôlée par le degré d’agent réticulant inclus dans leur formulation. Le contrôle des propriétés mécaniques des nanoparticules a été confirmé par la mesure du module de Young des particules par microscopie de force atomique. L’impact des propriétés mécaniques de ces particules sur leur capacité de pénétration dans les cellules vivantes a été étudié sur des cellules macrophagiques de souris. Les résultats ont montré que la cinétique d’internalisation, la quantité de particules internalisées et le mécanisme d’internalisation dépendent tous du module de Young des nanoparticules. Aucune différence dans le trajet intracellulaire des particules n’a pu être observée malgré le fait que différentes voies d’internalisation aient été observées. Ce dernier résultat peut s’expliquer par le fait que les nanoparticules sont internalisées par plusieurs voie simultanément ce qui facilite leur accumulation dans les organelles digestives intracellulaires. Un modèle simple permettant d’expliquer ces résultats a été proposé et discuté.

Étude de la pharmacologie de ligands du récepteur EP4 de prostaglandine E2

La prostaglandine E2 est une hormone lipidique produite abondamment dans le corps, incluant dans le rein où elle agit localement pour réguler les fonctions rénales. Un couplage à la protéine Gαs menant à une production d’AMPc a classiquement été attribué au récepteur EP4 de PGE2. La signalisation d’EP4 s’est cependant avérée plus complexe et implique aussi un couplage aux protéines sensibles à la PTX Gαi et des effets reliés aux β-arrestines. Il y a maintenant plusieurs exemples de l’activation sélective de voies de signalisation indépendantes par des ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), et ce concept désigné sélectivité fonctionnelle pourrait être exploité dans le développement de nouveaux médicaments plus spécifiques et efficaces. Dans une première étude, la puissance et l’activité intrinsèque d’une série de ligands d’EP4 pour l’activation de Gαs, Gαi et de la ß-arrestine ont été systématiquement déterminées relativement au ligand endogène PGE2. Dans ce but, trois essais de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) ont été adaptés pour évaluer les différentes voies dans des cellules vivantes. Nos résultats montrent une sélectivité fonctionnelle importante parmi les agonistes évalués et ont une implication pour l’utilisation d’analogues de la PGE2 dans un contexte expérimental et possiblement clinique, puisque leur spectre d’activité diffère de l’agoniste naturel. La méthodologie basée sur le BRET utilisée lors de cette première évaluation systématique d’une série d’agonistes d’EP4 devrait être applicable à l’étude d’autres RCPG. Dans une deuxième étude, des peptides reproduisant des régions juxtamembranaires extracellulaires du récepteur EP4 ont été conçus selon le raisonnement que des peptides ciblant des régions éloignées du site de liaison du ligand naturel ont le potentiel de ne moduler qu’une partie des activités du récepteur. L’insuffisance rénale aiguë est une complication médicale grave caractérisée par un déclin brusque et soutenu de la fonction rénale et pour laquelle il n’y a pas de traitement efficace à l’heure actuelle. Nos résultats montrent que le peptidomimétique dérivé d’EP4 optimisé (THG213.29) améliore significativement les fonctions rénales et les changements histologiques dans une insuffisance rénale aiguë induite par cisplatine ou par occlusion des artères rénales dans des rats Sprague-Dawley. Le THG213.29 ne compétitionnait pas la liaison de la PGE2 à EP4, mais modulait la cinétique de dissociation de la PGE2, suggérant une liaison à un site allostérique d’EP4. Le THG213.29 démontrait une sélectivité fonctionnelle, puisqu’il inhibait partiellement la production d’AMPc induite par EP4 mais n’affectait pas l’activation de Gαi ou le recrutement de la ß-arrestine. Nos résultats indiquent que le THG213.29 représente une nouvelle classe d’agent diurétique possédant les propriétés d’un modulateur allostérique non-compétitif des fonctions du récepteur EP4 pour l’amélioration des fonctions rénales suite à une insuffisance rénale aiguë.

Computational prediction of neural progenitor cell fates

Understanding how stem and progenitor cells choose between alternative cell fates is a major challenge in developmental biology. Efforts to tackle this problem have been hampered by the scarcity of markers that can be used to predict cell division outcomes. Here we present a computational method, based on algorithmic information theory, to analyze dynamic features of living cells over time. Using this method, we asked whether rat retinal progenitor cells (RPCs) display characteristic phenotypes before undergoing mitosis that could foretell their fate. We predicted whether RPCs will undergo a self-renewing or terminal division with 99% accuracy, or whether they will produce two photoreceptors or another combination of offspring with 87% accuracy. Our implementation can segment, track and generate predictions for 40 cells simultaneously on a standard computer at 5 min per frame. This method could be used to isolate cell populations with specific developmental potential, enabling previously impossible investigations.

Analyse de la localisation génomique et identification de nouvelles fonctions des sous-unités Rpb4/Rpb7 de l’ARN polymérase II et des facteurs TFIIF, TFIIS et UBR5

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription.

Développement d'un biosenseur BRET permettant le criblage de drogues qui causent l'activation de canaux Kir3 via les récepteurs couplés aux protéines G

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3.

Identification de nouveaux partenaires protéiques des récepteurs couplés aux protéines G contrôlant leur transport du reticulum endoplasmique à la membrane plasmique

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire.

Exploring TERRA (TElomeric Repeat-containing RNA) Expression and Regulation During Cell Growth in Saccharomyces cerevisiae

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Étude des mécanismes moléculaires impliquant l'homéoprotéine MEIS1 dans le développement de leucémies myéloïdes aigües

Les leucémies myéloïdes aigües résultent d’un dérèglement du processus de l’hématopoïèse et regroupent des maladies hétérogènes qui présentent des profils cliniques et génétiques variés. La compréhension des processus cellulaires responsables de l’initiation et du maintien de ces cancers permettrait de développer des outils thérapeutiques efficaces et ciblés. Au cours des dernières années, une quantité croissante d’anomalies génétiques reliées au développement de leucémies ont été corrélées à une expression anormale des gènes HOX et de leurs cofacteurs MEIS et PBX. Des modèles expérimentaux murins ont confirmé le rôle direct joué par ces protéines dans le développement de leucémies. En effet, la protéine MEIS1 collabore avec HOXA9 dans la leucémogenèse et requiert pour ce faire trois domaines distincts. Deux de ces domaines sont conservés chez PREP1, un membre de la même classe d’homéoprotéine que MEIS1. En utilisant une approche de gain-de-fonction, j’ai confirmé l’importance du rôle joué par le domaine C-terminal de MEIS1 dans l’accélération des leucémies induites par HOXA9. J’ai également montré que l’activité de ce domaine était corrélée avec une signature transcriptionnelle associée à la prolifération cellulaire. J’ai ensuite réalisé un criblage à haut débit afin d’identifier des antagonistes de l’interaction MEIS-PBX, également essentielle à l’accélération des leucémies HOX. À cette fin, j’ai développé un essai de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permettant de détecter la dimérisation MEIS-PBX dans les cellules vivantes. Plus de 115 000 composés chimiques ont été testés et suite à une confirmation par un essai orthogonal, une vingtaine de molécules ont été identifiées comme inhibiteurs potentiels. Ces composés pourront être rapidement testés sur la prolifération de cellules leucémiques primaires dans un contexte d’étude préclinique. Finalement, deux approches protéomiques complémentaires ont permis d’identifier des partenaires potentiels de MEIS1 et PREP1. La catégorisation fonctionnelle de ces candidats suggère un nouveau rôle pour ces homéoprotéines dans l’épissage de l’ARN et dans la reconnaissance de l’ADN méthylé.

Development of Free Space Method for Material Characterisation and GPR Study & A Case Study on Biological Samples

The thesis mainly focuses on material characterization in different environments: freely available samples taken in planar fonn, biological samples available in small quantities and buried objects.Free space method, finds many applications in the fields of industry, medicine and communication. As it is a non-contact method, it can be employed for monitoring the electrical properties of materials moving through a conveyor belt in real time. Also, measurement on such systems at high temperature is possible. NID theory can be applied to the characterization of thin films. Dielectric properties of thin films deposited on any dielectric substrate can be determined. ln chemical industry, the stages of a chemical reaction can be monitored online. Online monitoring will be more efficient as it saves time and avoids risk of sample collection.Dielectric contrast is one of the main factors, which decides the detectability of a system. lt could be noted that the two dielectric objects of same dielectric constant 3.2 (s, of plastic mine) placed in a medium of dielectric constant 2.56 (er of sand) could even be detected employing the time domain analysis of the reflected signal. This type of detection finds strategic importance as it provides solution to the problem of clearance of non-metallic mines. The demining of these mines using the conventional techniques had been proved futile. The studies on the detection of voids and leakage in pipes find many applications.The determined electrical properties of tissues can be used for numerical modeling of cells, microwave imaging, SAR test etc. All these techniques need the accurate determination of dielectric constant. ln the modem world, the use of cellular and other wireless communication systems is booming up. At the same time people are concemed about the hazardous effects of microwaves on living cells. The effect is usually studied on human phantom models. The construction of the models requires the knowledge of the dielectric parameters of the various body tissues. lt is in this context that the present study gains significance. The case study on biological samples shows that the properties of normal and infected body tissues are different. Even though the change in the dielectric properties of infected samples from that of normal one may not be a clear evidence of an ailment, it is an indication of some disorder.ln medical field, the free space method may be adapted for imaging the biological samples. This method can also be used in wireless technology. Evaluation of electrical properties and attenuation of obstacles in the path of RF waves can be done using free waves. An intelligent system for controlling the power output or frequency depending on the feed back values of the attenuation may be developed.The simulation employed in GPR can be extended for the exploration of the effects due to the factors such as the different proportion of water content in the soil, the level and roughness of the soil etc on the reflected signal. This may find applications in geological explorations. ln the detection of mines, a state-of-the art technique for scanning and imaging an active mine field can be developed using GPR. The probing antenna can be attached to a robotic arm capable of three degrees of rotation and the whole detecting system can be housed in a military vehicle. In industry, a system based on the GPR principle can be developed for monitoring liquid or gas through a pipe, as pipe with and without the sample gives different reflection responses. lt may also be implemented for the online monitoring of different stages of extraction and purification of crude petroleum in a plant.Since biological samples show fluctuation in the dielectric nature with time and other physiological conditions, more investigation in this direction should be done. The infected cells at various stages of advancement and the normal cells should be analysed. The results from these comparative studies can be utilized for the detection of the onset of such diseases. Studying the properties of infected tissues at different stages, the threshold of detectability of infected cells can be determined.

Modeling chemotaxis reveals the role of reversed phosphotransfer and a bi-functional kinase-phosphatase

Understanding how multiple signals are integrated in living cells to produce a balanced response is a major challenge in biology. Two-component signal transduction pathways, such as bacterial chemotaxis, comprise histidine protein kinases (HPKs) and response regulators (RRs). These are used to sense and respond to changes in the environment. Rhodobacter sphaeroides has a complex chemosensory network with two signaling clusters, each containing a HPK, CheA. Here we demonstrate, using a mathematical model, how the outputs of the two signaling clusters may be integrated. We use our mathematical model supported by experimental data to predict that: (1) the main RR controlling flagellar rotation, CheY6, aided by its specific phosphatase, the bifunctional kinase CheA3, acts as a phosphate sink for the other RRs; and (2) a phosphorelay pathway involving CheB2 connects the cytoplasmic cluster kinase CheA3 with the polar localised kinase CheA2, and allows CheA3-P to phosphorylate non-cognate chemotaxis RRs. These two mechanisms enable the bifunctional kinase/phosphatase activity of CheA3 to integrate and tune the sensory output of each signaling cluster to produce a balanced response. The signal integration mechanisms identified here may be widely used by other bacteria, since like R. sphaeroides, over 50% of chemotactic bacteria have multiple cheA homologues and need to integrate signals from different sources.