Transglutaminases de Anopheles gambiae: caracterização molecular, bioquímica e histológica.

A malária é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium spp, a sua transmissão aos humanos deve-se à picada infecciosa de mosquitos fêmea do género Anopheles spp, sendo Anopheles gambiae o vector mais eficiente de malária em todo o mundo. O intestino médio do mosquito representa um dos ambientes mais desafiantes à sobrevivência e desenvolvimento do parasita, e é, portanto, também um dos locais mais atraentes para novas estratégias de controlo da malária, pois é onde se observa uma diminuição acentuada na população de parasitas invasores. A transglutaminase (TGM) desempenha um papel importante e diversificado em mamíferos, tais como a coagulação e a formação da barreira epitelial, catalisando o “crosslinking” entre proteínas. Em invertebrados, como Drosophila sp, a proteína TGM mostrou estar envolvida na defesa imunitária. O mosquito A. gambiae tem codificado no seu genoma três TGMs, o gene AGAP009099, já caracterizado, é expresso exclusivamente nas MAGs (glândulas auxiliares masculinas). Os genes AGAP009098 e AGAP009100, cujas funções não foram ainda clarificadas, são expressos ubiquamente e em baixos níveis. No presente trabalho, propõe-se a caracterização das duas proteínas codificadas por estes genes, de forma a identificar o modo como estas proteínas interagem dentro do mosquito, a esclarecer o seu papel na invasão do intestino médio de A. gambiae por Plasmodium spp., o que permitirá averiguar o seu envolvimento ao nível da imunidade inata do mosquito. Foi produzida e purificada a proteína recombinante AgTGM98-1, que se utilizou para a produção de um anticorpo anti-AgTGM98. A atividade de TGM no mosquito não se mostrou estatisticamente significativa entre os estadios larvares, pupas e adultos. A caracterização bioquímica de AgTGM98 e AgTGM100 revelou a possível existência de proteínas do tipo TGM. Através de western blotting, verificou-se uma diminuição de AgTGM98, comparando mosquitos não infetados com infetados por P. berghei, o que sugere alterações na expressão desta proteína face à invasão pelo parasita, o que pode significar o seu envolvimento direto na infeção. Caracterizou-se, por imunohistoquímica (IHC) a localização de AgTGM98 e AgTGM100 em intestinos médios de mosquitos. A proteína AgTGM98 apresentou uma localização membranar, na parte basal do intestino médio e com distribuição ao longo deste. Contrariamente, a AgTGM100 tem uma localização intracelular e uma distribuição presente apenas no proventrículo e zona mais apical do intestino médio durante uma fase da sua existência, sendo com o passar do tempo detectada em todo o intestino médio.

El territorio de la identidad y la figura del árbitro

En nuestras investigaciones sobre la formación de la identidad cultural local y regional, hemos encontrado con frecuencia relatos que vinculan la afirmación de una identidad territorial con antagonismos de vecindad expresados en la evocación de encuentros deportivos, particularmente en relación de encuentros de equipo. Observamos en estos relatos que el enfrentamiento deportivo, sobre todo en el fútbol, se utiliza para representar conflictos que forman parte de las relaciones entre localidades.

Study of glycosidic changes in lung cancer: potential effectors in hematogenous metastasis

RESUMO: O cancro do pulmão (LC), uma das principais causas de mortalidade relacionada com cancro em Portugal, pode levar à formação de metástases hematogénicas. A adesão das células tumorais ao endotélio é considerada um dos passos fundamentais envolvidos na metástase. Em células sanguíneas, esta adesão é mediada por ligandos de E-selectina (E-SL), glicoproteínas ou glicolípidos decorados principalmente com sialyl-Lewis x (sLex) e sialyl-Lewis a (sLea). Tem sido descrito a expressão destes antigénios em LC, contudo o seu papel funcional em permitir a adesão das células de LC ao endotélio é ainda pouco compreendido. Foram analisadas amostras emparelhadas normais e tumorais de pacientes com cancro de pulmão de não-pequenas células (NSCLC) e três linhas celulares de LC. Immunoblotting assays com anti-sLex/sLea e molécula quimérica de E-selectina demonstraram que tecidos tumorais de LC sobreexpressam significativamente E-SL e resultados de citometria de fluxo demonstraram uma expressão elevada de E-SL nas linhas celulares. Para compreender o mecanismo da sobreexpressão de E-SL em tecidos tumorais e linhas celulares de LC, foi analisada a expressão de genes envolvidos na biossíntese de E-SL, nomeadamente FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, β4GALT1, GCNT1 e GALNT3. Observou-se a sobreexpressão das fucosiltransferases FUT3, FUT6 e FUT7 em tecidos tumorais de LC e FUT3 em linhas celulares de LC, sendo que neste último, esta expressão é correlacionada com um aumento da adesão das células de LC às selectinas endoteliais. Foi observado que uma baixa expressão de FUT4 em tecidos tumorais está associada com estadios menos avançados de NSCLC. Foram analisadas ainda proteínas decoradas com sLex/sLea, tendo-se identificado como E-SL o antigénio carcinoembrionário em NSCLC. Em resumo, esta tese contribuiu para uma melhor compreensão das alterações glicosídicas e moléculas que podem influenciar a progressão tumoral do LC, podendo permitir identificar futuramente novos biomarcadores de diagnóstico/prognóstico e potenciais alvos terapêuticos para o NSCLC.--------------------------ABSTRACT: Lung cancer (LC), one of the major causes of mortality related to cancer in Portugal, may lead to hematogenous metastasis. Adhesion of cancer cells to endothelium is considered one of the crucial steps involved in metastasis. In blood cells, this adhesion is initiated by endothelial selectin ligands (E-SL) that are glycoproteins or glycolipids decorated mostly with sialyl-Lewis x (sLex) and sialyl-Lewis a (sLea). While LC has been described as expressing these sialyl Lewis antigens, its functional role in allowing LC adhesion to endothelium is still poorly understood. We analyzed paired tumor and normal tissues samples from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and three LC cell lines. Immunoblotting assays with anti-sLex/sLea and E-selectin chimera demonstrated that LC tumor tissues significantly overexpress E-SL and flow cytometry results indicated that E-SL are also abundantly expressed in LC cell lines. To understand the mechanism behind the overexpression of E-SL in LC tissues and cell lines, we analyzed the expression of genes involved in its biosynthesis, namely FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, β4GALT1, GCNT1 and GALNT3. It was observed the overexpression of fucosyltransferases FUT3, FUT6 and FUT7 in LC tumor tissues and FUT3 in LC cell lines, being this last one correlated with an increased reactivity of the LC cells to endothelial selectins. It was described that low expression of FUT4 in tumor tissues is correlated with early stages of NSCLC. We also analyzed scaffolds proteins of sLex/sLea and it was identified the carcinoembryonic antigen as an E-SL in NSCLC. In summary, this thesis contributed to a better understanding of the glycosidic changes and molecules that can influence tumor progression of LC, allowing identifying in the future new diagnosis/prognosis biomarkers and potential therapeutic targets for NSCLC.

Clinical decisions in breast cancer, a heterogenous disease

RESUMO: Introdução: Tratamento do carcinoma da mama Este trabalho inicia-se com a história do tratamento do carcinoma da mama, desde os primeiros documentos que descrevem doentes com carcinoma da mama até 1950. Desde 1950 até 2000 o diagnóstico, risco e as modalidades terapêuticas usadas no tratamento das doentes são mais detalhadas com ênfase nas terapêuticas locais, regionais e sistémicas. Parte 1:Quem tratar com terapêutica sistémica adjuvante Capítulo 1: A classificação TNM não está morta no carcinoma da mama Tem sido dito que a classificação TNM não é adequada para usar como ferramenta de prognóstico e decisão terapêutica no carcinoma da mama, especialmente em doentes com carcinoma detectado através de rastreio, que tem geralmente menores dimensões. A razão desta classificação não ser adequada prendese com o facto de não estarem incluidos parâmetros biológicos na classificação TNM atual. Pusemos a hipótese de que numa população com alta percentagem de carcinoma da mama não detectado em exames de rastreio, com uma mediana de idade baixa e com alta percentagem de estadios II e III, o estadiamento clássico, pela classificação TNM, é mais descriminatório que as características biológicas na determinação do prognóstico. Para isto analisámos uma população de doentes com carcinoma da mama tratados consecutivamente na mesma instituição, durante 10 anos. Caracterizámos os fatores de prognóstico do estadiamento clássico incluídos na classificação TNM e as variantes biológicas, presentemente não incluídas na classificação TNM. Quantificámos a capacidade de cada um dos factores de prognóstico para para prever a sobrevivência. A população é de 1699 doentes com carcinoma da mama que foram tratádos com terapêutica sistémica adjuvante. Individualmente, cada um dos fatores de prognostico, clássicos ou biológicos, diferem significativamente entre doentes que sobrevivem e que não sobrevivem. Explicitamente, como previsto, doentes com tumores maiores, envolvimento dos gânglios axilares, estadios TNM mais avançados, que não expressam recetor de esrogéneo, com amplificação do gene Her2, triplos negativos ou de menor diferenciação têm menor sobrevida. Na análise multivariada, só os fatores de prognostico da classificação TNM, o grau histológico e a amplificação do gene Her2, esta última com menos significância estatistica são preditores independentes de sobrevivência. Capítulo 2: Em busca de novos factores de prognostico: Poder preditivo e mecanismo das alterações de centrossomas em carcinoma da mama Compilámos inúmeros grupos de experiências de genómica feitas em tumores primários de doentes com carcinoma da mama para as quais existe informação prognóstica. Estas experiências são feitas com o objectivo de descobrir novos factores de prognóstico. Reanalisámos os dados, repetindo a mesma pergunta: Quais são os genes com expressão diferencial estatisticamente significativa entre doentes que recaíram e doentes que não recaíram. Identificámos 65 genes nestas condições e o MKI67, o gene que codifica a proteina Ki67, estava nesse grupo. Identificámos vários genes que se sabe estarem envolvidos no processo de agregação de centrossomas. O gene que considerámos mais promissor foi a kinesina KiFC1, que já tinha sido identificada como regulador da agregação de centrossomas. Anomalias cetrossomais numéricas e estruturais têm sido observadas em neoplasias. Há dados correlacionando anolmalias centrossomais estruturais e e numéricas com o grau de malignidade e os eventos precoces da carcinogénese. Mas estas anomalias centrossomais têm um peso para a célula que deve adapatar-se ou entrará em apoptose. Os nossos resultados sugerem que existe um mecanismo adaptativo, a agregação de centrossomas, com impacto prognóstico negativo. O nosso objetivo foi quantificar o valor prognóstico das anomalias centrossomais no carcinoma da mama. Para isto usámos material de doentes dos quais sabemos a história natural. Avaliámos os genes de agregação de centrossomas, KIFC1 e TACC3, nas amostras tumorais arquivadas em parafina: primeiro com PCR (polymerase chain reaction) quantitativa e depois com imunohistoquímica (IHQ). Apenas a proteína KIFC1 foi discriminatória em IHQ, não se tendo conseguido otimizar o anticorpo da TACC3. Os níveis proteicos de KIFC1 correlacionam-se com mau prognóstico. Nas doentes que recaíram observámos, no tumor primário, maior abundância desta proteína com localização nuclear. Em seguida, demonstrámos que a agregação de centrossomas é um fenómeno que ocorre in vivo. Identificámos centrossomas agregados em amostras de tumores primários de doentes que recaíram. Tecnicamente usámos microscopia de fluorescência e IHQ contra proteínas centrossomais que avaliámos nos tumores primários arquivados em blocos de parafina. Observámos agregação de centrossomas num pequeno número de doentes que recaíram, não validámos, ainda, este fenótipo celular em larga escala. Parte 2: Como tratar com terapêutica sistémica os vários subtipos de carcinoma da mama Capítulo 3: Quantas doenças estão englobadas na definição carcinoma da mama triplo negativo? (revisão) O carcinoma da mama triplo negativo é um tumor que não expressa três proteínas: recetor de estrogénio, recetor de progesterona e o recetor do fator de crescimento epidermico tipo 2 (Her2). As doentes com estes tumores não são ainda tratadas com terapêutica dirigida, possivelmente porque esta definição negativa não tem ajudado. Sabemos apenas as alterações genéticas que estes tumores não têm, não as que eles têm. Talvez por esta razão, estes tumores são o subtipo mais agressivo de carcinoma da mama. No entanto, na prática clínica observamos que estas doentes não têm sempre mau prognóstico, além de que dados de histopatologia e epidemiologia sugerem que esta definição negativa não está a capturar um único subtipo de carcinoma da mama, mas vários. Avaliámos criticamente esta evidência, clínica, histopatológica, epidemiológica e molecular. Há evidência de heterogeneidade, mas não é claro quantos subtipos estão englobados nesta definição de carcinoma da mama triplo negativo. A resposta a esta pergunta, e a identificação do fundamento molecular desta heterogeneidade vai ajudar a melhor definir o prognóstico e eventualmente a definir novos alvos terapêuticos nesta população difícil. Capítulo 4: Terapêuica sistémica em carcinoma da mama triplo negativo (revisão) A quimioterapia é a única terapêutica sistémica disponível para as doentes com carcinoma da mama triplo negativo, ao contrário dos outros dois subtipo de carcinoma da mama que têm com a terapêutica antiestrogénica e anti Her2, importantes benefícios. Apesar de terem surgido várias opções terapêuticas para estes doentes nennhuma terapêutica dirigida foi validada pelos ensaios clínicos conduzidos, possivelmente porque a biologia deste carcinoma ainda não foi elucidada. Muitos ensaios demonstram que os tumores triplos negativos beneficiam com quimioterapia e que as mais altas taxas de resposta patológica completa à terapêutica neoadjuvante são observadas precisamente nestes tumors. A resposta patológica completa correlaciona-se com a sobrevivência. Estamos a estudar regimes adjuvantes específicos para doentes com estes tumors, mas, neste momento, regimes de terceira geração com taxanos e antraciclinas são os mais promissores. O papel de subgrupos de fármacos específicos, como os sais de platina, mantémse mal definido. Quanto às antraciclinas e taxanos, estes grupos não mostraram beneficio específico em carcinoma da mama triplo negativo quando comparado com os outros subtipos. Os próprios carcinomas da mama triplos negativos são heterogéneos e carcinomas da mama basais triplos negativos com elevada taxa de proliferação e carcinomas da mama triplos negativos surgidos em doentes com mutação germinal BRCA1 poderão ser mais sensíveis a sais de platino e menos sensíveis a taxanos. Como a definição molecular ainda não foi explicada a busca de terapêutica dirigida vai continuar. Capítulo 5: Ensaio randomizado de fase II do anticorpo monoclonal contra o recetor do fator de crescimento epidérmico tipo 1 combinado com cisplatino versus cisplatino em monoterapia em doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado O recetor do fator de crescimento epidérmico tipo 1 está sobre expresso nos tumores das doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado, um subtipo agressivo de carcinoma da mama. Este ensaio investigou a combinação de cetuximab e cisplatino versus cisplatino isolado em doentes deste tipo. Doentes em primeira ou segunda linha de terapêutica para doença metastizada foram randomizadas, num sistema de 2 para 1, para receber até 6 ciclos da combinação de cisplatino e cetuximab ou cisplatino isolado. Às doentes randomizadas para o braço de monoterapia podiamos, após progressão, acrescentar cetuximab ou tratá-las com cetuximab isolado. O objetivo primário foi a taxa de resposta global. Os objetivos secundários foram a sobrevivência livre de doença, a sobrevivência global e o perfil de segurança dos fármacos. A população em análise foram 115 doentes tratadas com a combinação e 58 doentes tratadas com cisplatino em monoterapia, 31 destas em quem se documentou progressão passaram a ser tratadas com um regime que incluía cetuximab, isolado ou em combinação. A taxa de resposta global foi de 20% no braço da combinaçao e de 10% no braço da monoterapia (odds ratio, 2.13). A sobrevivência livre de doença foi de 3.7 meses no braço da combinação e de 1.5 meses no braço em monoterapia (hazard ratio, 0.67). A sobrevivência global foi de 12.9 meses no braço da combinação versus 9.4 meses no braço de cisplatino. Conclui-se que, apesar de não ter sido alcançado o objectivo primário, acrescentar cetuximab, duplica a resposta e prolonga tanto a sobrevivência livre de doença como a sobrevivência global. Capítulo 6: Bloquear a angiogénese para tratar o carcinoma da mama (revisão) A angiogénese é uma característica que define a neoplasia, porque tumores com mais de 1mm precisam de formar novos vasos para poderem crescer. Desde que se descobriram as moléculas que orquestram esta transformação, que se têm procurado desenvolver e testar fármacos que interfiram com este processo. No carcinoma da mama o bevacizumab foi o primeiro fármaco aprovado pela FDA em primeira linha para tratar doença metastática. Depois foram estudados um grupo de inibidores de tirosina cinase associados aos recetores transmembranares envolvidos na angiogénese como o VEGFR, PDGFR, KIT, RET, BRAF e Flt3: sunitinib, sorafenib, pazopanib e axitinib Neste capítulo, analisaram-se e resumiram-se os dados dos ensaios clínicos das drogas anti-angiogénicas no tratamaneto do carcinoma da mama. Os ensaios de fase III do bevacizumab em carcinoma da mama mostraram uma redução na progressão de doença de 22 a 52% e aumento da sobrevivência livre de doença de 1.2 a 5.5 meses mas nunca foi demonstrado prolongamento de sobrevivência. Os ensaios de fase III em carcinoma da mama adjuvante com bevacizumab são dois e foram ambos negativos. O ensaio de fase III com o inibidor da tirosina cinase, sunitinib foi negativo, enquanto que os ensaios de fase II com os inibidores da tirosina cinase sorafenib e pazopanib melhoraram alguns indicadores de resposta e sobrevivência. A endostatina foi testada no contexto neoadjuvante com antraciclinas e melhorou a taxa de resposta, mas, mais ensaios são necessários para estabelecer este fármaco. A maioria dos ensaios clínicos dos agentes antiangiogénicos em carcinoma da mama reportaram aumento da taxa de resposta e de sobrevivência livre de doença mas nunca aumento da sobrevivência global quando comparado com quimioterapia isolada o que levou ao cepticismo a que assistimos atualmente em relação ao bloqueio da angiogénese. Ensaios clínicos selecionados em doentes específicas com objetivos translacionais relacionados com material biológico colhido, preferefencialmente em diferentes intervalos da terapêutica, serão cruciais para o bloqueio da angiogénese sobreviver como estratégia terapêutica em carcinoma da mama. Capítulo 7: A resposta à hipoxia medeia a resistência primária ao sunitinib em carcinoma da mama localmente avançado O sunitinib é um fármaco antiangiogénico que nunca foi avaliado isolado em doentes com carcinoma da mama não tratadas. O nosso objetivo foi caracaterizar a atividade do sunitinib isolado e em combinação com o docetaxel em carcinoma da mama não tratado, localmente avançado ou operável, mas de dimensão superior a 2 cm, para compreender os mecanismos de resposta. Doze doentes foram tratadas com duas semanas iniciais de sunitinib seguido de quatro ciclos de combinação de sunitinib e docetaxel. A resposta, a reistência e a toxicidade foram avaliadas de acordo com parametros clínicos, ressonância magnética nuclear, tomografia de emissão de positrões, histopatologia e perfis de expressão genómica. Detetámos resistência primária ao sunitinib na janela inicial de duas semanas, evidenciada em quatro doentes que não responderam. À data da cirurgia, cinco doentes tinham tumor viável na mama e axila, quatro tinahm tumor viável na mama e três foram retiradas do ensaio. Não houve respostas patológicas completas. A comparação dos perfis de expressão genómica entre os respondedores e os não respondedores, aos quinze dias iniciais, permitiu-nos identificar sobre expressão de VEGF e outras vias angiogénicas nos não respondedores. Especificamente, em tumores resistentes ao sunitinib isolado detectámos uma resposta transcricional à hipoxia caracterizada por sobre expressão de vários dos genes alvo do HIF1α. Neste ensaio de sunitinib isolado em doentes não tratadas com carcinoma da mama localmente avançado, encontrámos evidência molecular de resistência primária ao sunitinib possivelmente mediada por sobre expressão de genes que respondem à hipoxia. Parte 3: Quando parar a terapêutica sistémica às doentes com carcinoma da mama Capítulo 8: Agressividade terapêutica ns últimos três meses de vida num estudo retrospetivo dum centro único Incluímos todos os adultos que morreram com tumores sólidos na instituição em 2003 e foram tratados com quimioterapia para tratar neoplaias metastizadas. Colhemos dados detalhados relacionados com quimioterapia e toxicidade nos últimos três meses de vida a partir do processo clínico. Trezentas e dezanove doentes foram incluídos, a mediana de idade foi 61 anos. A mediana de sobrevivência de doença metastática foi de 11 meses. 66% (211) dos doentes foram tratados com QT nos últimos 3 meses de vida, 37% foram tratados com QT no úlimo mês de vida e 21% nas últimas duas semanas. Nos doentes que foram tratados com QT nos últimos três meses de vida, 50% começaram um novo regime terapêutico neste período e 14% começaram um novo regime no último mês. Identificámos como determinantes de tratamento com QT no fim de vida a idade jovem, o carcinoma da mama, do ovário e do pâncreas. Concluímos que administrámos QT no fim de vida frequentemente e iniciámos novos regimes terapêuticos no último mês de vida em 14% dos casos. Precisamos de aprofundar este trabalho para compreender se esta atitude agressiva resulta em melhor paliação de sintomas e qualidade de vida no fim de vida dos doentes com neoplasias disseminadas. Capítulo 9: O tratamento do carcinoma da mama no fim de vida está a mudar? Quisémos caracterizar a modificação da tendência no uso de QT e de estratégias paliativas no fim de vida das doentes com carcinoma da mama em diferentes instituições e em intervalos de tempo diferentes. Para isto selecionámos doentes que morreram de carcinoma da mama durante 6 anos, entre 2007 e 2012, num hospital geral e comparámos com as doentes que morreram de carcinoma da mama em 2003 num centro oncológico. Avaliámos um total de 232 doentes. O grupo mais recente tem 114 doentes e o grupo anterior tem 118 doentes. Usámos estatística descritiva para caracterizar QT no fim de vida e o uso de estratégias paliativas. Ambas as coortes são comparáveis em termos das características do carcinoma da mama. Observámos aumento do uso de estatégias paliativas: consulta da dor, consulta de cuidados paliativos e radioterapia paliativa no cuidado das doentes com carcinoma da mama metastizado. Evidenciámos aumento do número de mortes em serviços de cuidados paliativos. No entanto, a QT paliativa continua a ser prolongada até aos últimos meses de vida, embora tenhamos mostrado uma diminuição desta prática. Outros indicadores de agressividade como a admissão hospitalar também mostraram diminuição. Confirmámos a nossa hipótese de que há maior integração da medicina paliativa multidisciplinar e menos agressividade na terapêutica sistémica das doentes com carcinoma da mama nos últimos meses de vida. Chapter 10: Porque é que os nossos doentes são tratados com quimioterapia até ao fim da vida? (editorial) Este capítulo começa por dar o exmeplo duma jovem de 22 anos que viveu três meses após começar QT paliatva. Este caso epitomiza a futilidade terapêutica e é usado como ponto de partida para explorar as razões pelas quais administramos QT no fim de vida aos doentes quando é inútil, tóxica, logisticamente complexa e cara. Será que estamos a prescrever QT até tarde demais? Os oncologistas fazem previsões excessivamente otimistas e têm uma atitude pró terapêutica excessiva e são criticados por outros intervenientes nas instituições de saúde por isto. Crescentemente doentes, familiares, associações de doentes, definidores de políticas de saúde, jornalistas e a sociedade em geral afloram este tema mas tornam-se inconsistentes quando se trata dum doente próximo em que se modifica o discurso para que se façam terapêuticas sitémicas agressivas. Há uma crescente cultura de preservação da qualidade de vida, paliação, abordagem sintomática, referenciação a unidades de cuidados paliativos e outros temas do fim de vida dos doentes oncológicos terminais. Infelizmente, este tema tem ganhado momentum não porque os oncologistas estejam a refletir criticamente sobre a sua prática, mas porque os custos dos cuidados de saúde são crescentes e incomportáveis. Seja qual fôr o motivo, as razões que levam os oncologistas a administrar QT no fim de vida devem ser criticamente elucidadas. Mas há poucos dados para nos guiar nesta fase delicada da vida dos doentes e os que existem são por vezes irreconciliáveis, é uma revisão destes dados que foi feita neste capítulo. Conclusão: A abordagem do carcinoma da mama no futuro? Na conclusão, tenta-se olhar para o futuro e prever como será a tomada a cargo dum doente com carcioma da mama amanhã. Faz-se uma avaliação das várias àreas desde prevenção, rastreio, suscetibilidade genética e comportamental e terapêutica. Na terapêutica separa-se a terapêutica locoregional, sistémica adjuvante e da doença metastizada. Nos três últimos parágrafos a história duma mulher com um carcinoma localmente avançado que sobre expressa o recetor Her2, serve como ilustração de como devemos estar preparados para incorporar evolução, heterogeneidade e dinamismo no cuidado de doentes com carcinoma da mama. -------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Introduction: Breast cancer care in the past This work starts with an overview of the treatment of breast cancer (BC). From the first reports of patients ill with BC until 1950. From 1950 until 2000, there is a more detailed account on how BC patients were treated with emphasis on the different modalities, local, regional and systemic treatments and their evolution. Part 1: Who to treat with adjuvant systemic therapy? Chapter 1: TNM is not dead in breast cancer It has been said that the current TNM staging system might not be suitable for predicting breast cancer (BC) outcomes and for making therapeutic decisions, especially for patients with screen detected BC which is smaller. The reason for this is also due to the non inclusion of tumor biology parameters in the current TNM system. We hypothesize that in a population where there is still a large abundance of non screen detected BC, with a low median age of incidence and abundance of high TNM staged lesions, biology is still second to classical staging in predicting prognosis. We analyzed a population of consecutive BC patients from a single institution during ten years. We characterized current established prognostic factors, classical staging variables included in the current TNM staging system and biological variables, currently not included in the TNM system. We quantified the capacity of individual prognostic factors to predict survival. We analyzed a population of 1699 consecutive BC patients. We found that individually both the TNM system prognostic factors and the biological prognostic factors are differing among BC survivors and dead patients in a statistically significant distribution. Explicitly, patients with larger tumors, positive nodes, higher stage lesions, ER negative, HER2 positive, TN or lower differentiation tumors show decreased survival. In the multivariate analysis we can conclude that in a population such as ours classical TNM staging variables, irrespective of tumor biological features, are still the most powerful outcome predictors. Chapter 2: Defining breast cancer prognosis: The predictive power and mechanism of centrosome alterations in breast cancer We performed a systematic analysis of the literature and compiled an extensive data set of gene expression data originated in primary tumours of BC patients with prognostic information. We analysed this data seeking for genes consistently up or down regulated in poor prognosis BC, i.e. that relapsed after initial treatment. In the course this bioinformatics analysis our lab identified 65 genes statistically significant across multiple datasets that can discriminate between relapsed and non-relapsed BC patients. Among the identified genes, we have detected genes such as MKI67, a marker of mitotic activity which is routinely used in the clinic. Unexpectedly, we also discovered several genes found to be involved in centrosome clustering, The most prominent of these is the kinesin KIFC1, also called HSET, and previously identified as regulator of centrosome clustering. Centrosome abnormalities (numerical, structural) have been observed in cancer. Indeed, compelling data has shown that cells from many cancers have multiple and abnormal centrosomes, that are either correlated with tumour malignancy or considered an early tumorigenesis event. However, extra centrosomes come at a cost and cells must be able to handle such abnormalities or otherwise die. Thus our results suggested a new mechanism of breast cancer progression with negative prognostic value. We aimed at quantifying the predictive power of centrosome clustering in BC clinical setting and at detecting this process in BC patient material. We validated the centrosome clustering genes KIFC1 and TACC3 in formalin fixed paraffin embedded (FFPE) BC patient material, using quantitative real-time PCR (RT-qPCR) technology. Our results indicate that the tested KIFC1 has a clear IHC signal (1) and that the protein expression patterns and levels correlate with prognosis, with relapsing patients having increased expression and nuclear localisation of this kinesin (2). Next we were able to show that centrosome clustering does occur in vivo. We identified centrosome amplification and clustering in breast cancer samples, and we established a fluorescence microscopy-based IHC approach by staining FFPE samples with centrosomal markers. Using this approach we have observed centrosome amplification and clustering in a small set of poor prognosis samples. By expanding the number of samples in which we have characterised the number of centrosomes, we were able to confirm our preliminary observation that centrosomes are clustered in relapsed BC. Part 2: How to treat breast cancer subtypes? Chapter 3: How many diseases is triple negative breast cancer? (review) Triple negative breast cancer is a subtype of breast cancer that does not express the estrogen receptor, the progesterone receptor and the epidermal growth factor receptor type 2 (Her2). These tumors are not yet treated with targeted therapies probably because no positive markers have been described to reliably classify them - they are described for what they are not. Perhaps for this reason, they are among the most aggressive of breast carcinomas, albeit with very heterogenous clinical behavior. The clinical observation that these patients do not carry a uniformly dismal prognosis, coupled with data coming from pathology and epidemiology, suggests that this negative definition is not capturing a single clinical entity, but several. We critically evaluate this evidence in this paper, reviewing clinical and epidemiological data, as well as molecular data. There is evidence for heterogeneity, but it is not clear how many diseases are grouped into triple negative breast cancer. Answering this question, and identifying the molecular basis of heterogeneity will help define prognosis and, eventually, the identification of new targeted therapies. Chapter 4: Systemic treatment for triple negative breast cancer (review) Chemotherapy remains the backbone of treatment for triple negative breast cancer (TNBC). Despite the appearance of new targeted and biologic agents there has been no targeted therapy validated for TNBC, possibly because the biology of TNBC has not been conclusively elucidated. Many studies have shown that TNBC derive significant benefit of chemotherapy in the neoadjuvant, adjuvant and metastatic treatment, possibly more benefit than other BC subtypes. Neoadjuvant chemotherapy studies have repeatedly shown higher response rates in TNBC than non-TNBC. Pathologic complete response has been shown to predict improved long term outcomes in BC. Although specific adjuvant regimens for TNBC are under study, third generation chemotherapy regimens utilizing dose dense or metronomic polychemotherapy are among the most effective tools presently available. The role of specific chemotherapy agents, namely platinum salts, in the treatment of TNBC remains undefined. Taxanes and anthracyclines are active in TNBC and remain important agents, but have not shown specific benefit over non-TNBC. TNBC is itself a heterogeneous group in which subgroups like basal like BC defined by higher proliferation and including those TNBC arising in BRCA1 mutation carriers may be more sensitive to platinum agents and relatively less sensitive to taxanes. The molecular characterization of TNBC is lacking and therefore the search for targeted therapy is still ongoing. Chapter 5: Randomized phase II study of the anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab with cisplatin versus cisplatin alone in patients with metastatic triple-negative breast cancer Epidermal growth factor receptor is overexpressed in metastatic triple-negative breast cancers, an aggressive subtype of breast cancer. Our randomized phase II study investigated cisplatin with or without cetuximab in this setting. Patients who had received no more than one previous chemotherapy regimen were randomly assigned on a 2:1 schedule to receive no more than six cycles of cisplatin plus cetuximab or cisplatin alone. Patients receiving cisplatin alone could switch to cisplatin plus cetuximab or cetuximab alone on disease progression. The primary end point was overall response rate (ORR). Secondary end points studied included progressionfree survival (PFS), overall survival (OS), and safety profiles. The full analysis set comprised 115 patients receiving cisplatin plus cetuximab and 58 receiving cisplatin alone; 31 patients whose disease progressed on cisplatin alone switched to cetuximab-containing therapy. The ORR was 20% with cisplatin plus cetuximab and 10% with cisplatin alone (odds ratio, 2.13). Cisplatin plus cetuximab resulted in longer PFS compared with cisplatin alone (median, 3.7 v 1.5 months; hazard ratio, 0.67. Corresponding median OS was 12.9 versus 9.4 months. While the primary study end point was not met, adding cetuximab to cisplatin doubled the ORR and appeared to prolong PFS and OS, warranting further investigation in mTNBC. Chapter 6: Blocking angiogenesis to treat breast cancer (review) Angiogenesis is a hallmark of cancer because tumors larger than 1mm need new vessels to sustain their growth. Since the discovery of the molecular players of this process and some inhibitors, that angiogenesis became a promising therapeutic target. Bevacizumab was the first molecular-targeted antiangiogenic therapy approved by the FDA and is used as first-line therapy in metastatic breast cancer. A second class of approved inhibitors (sunitinib, sorafenib, pazopanib and axitinib) include oral small-molecule tyrosine kinase inhibitors that target vascular endothelial growth factor receptors, platelet-derived growth factor receptors, and other kinases including KIT, Ret, BRAF and Flt-3, but none of these have gained approval to treat breast cancer. This review analyzes and summarizes data from clinical trials of anti-angiogenic agents in the treatment of BC. Phase III trials of bevacizumab in advanced BC have demonstrated a reduction in disease progression (22–52%), increased response rates and improvements in progression-free survival of 1.2 to 5.5 months, but no improvements in OS. Bevacizumab phase III trials in early BC have both been negative. Bevacizumab combined with chemotherapy is associated with more adverse events. Phase III trials of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib were negative, while randomized phase II trials of sorafenib and pazopanib have improved some outcomes. Endostatin has been tested in neoadjuvant clinical trials in combination with anthracyclinebased chemotherapy in treatment-naive patients and has increased the clinical response rate, but more trials are needed to establish this drug. Most trials of anti-angiogenic agents in BC have reported improved RR and PFS but no increase in OS compared to chemotherapy alone, leading to skepticism towards blocking angiogenesis. Selected trials in selected BC populations with translational endpoints related to harvested tumor tissue and other biological material samples, preferentially at several timepoints, will be crucial if antiangiogenesis is to survive as a strategy to treat BC. Chapter 7: Does hypoxic response mediate primary resistance to sunitinib in untreated locally advanced breast cancer? The antiangiogenic drug sunitinib has never been evaluated as single agent in untreated BC patients. We aimed to characterize the activity of sunitinib, alone and with docetaxel, in untreated locally advanced or operable BC, and, to uncover the mechanisms of response. Twelve patients were treated with an upfront window of sunitinib followed by four cycles of sunitinib plus docetaxel. Response, resistance and toxicity were evaluated according to standard clinical parameters, magnetic resonance imaging, positron emission tomography, pathology characterization and gene expression profiling. We detected primary resistance to sunitinib upfront window in untreated BC, as evidenced by four non-responding patients. At surgery, five patients had viable disease in the breast and axilla, four had viable tumor cells in the breast alone and three were taken off study due to unacceptable toxicity and thus not evaluated. Early functional imaging was useful in predicting response. There were no pathologic complete responses (pCR). Comparison of gene expression profiling tumor data between early responders and non-responders allowed us to identify upregulation of VEGF and angiogenic pathways in non responders. Specifically, in tumors resistant to the single-agent sunitinib we detected a transcriptional response to hypoxia characterized by over-expression of several HIF1α target genes. In this report of single-agent sunitinib treatment of untreated localized BC patients, we found molecular evidence of primary resistance to sunitinib likely mediated by up-regulation of hypoxia responsive genes. Part 3: When to stop systemic treatment of breast cancer patients? Chapter 8: The aggressiveness of cancer care in the last three months of life: a retrospective single centre analysis. All adult patients with solid tumors who died in our hospital in 2003 and received chemotherapy for advanced cancer, were included. Detailed data concerning chemotherapy and toxicity, in the last three months of life, were collected from patientsʼ clinical charts. A total of 319 patients were included. Median age was 61 years. Median time from diagnosis of metastatic disease to death was 11 months. The proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life was 66% (n=211), in the last month 37% and in the last two weeks 21%. Among patients who received chemotherapy in the last three months of life, 50% started a new chemotherapy regimen in this period and 14% in the last month. There was an increased probability of receiving chemotherapy in the last three months of life in younger patients and in patients with breast, ovarian and pancreatic carcinomas. There was a large proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life, including initiation of a new regimen within the last 30 days. Thus, further study is needed to evaluate if such aggressive attitude results in better palliation of symptoms at the end of life. Chapter 9: Is breast cancer treatment in the end of life changing? We aimed to characterize the shifting trends in use of anti-cancer chemotherapy and palliative care approaches in the end of life of BC patients in different institutions and times. For this, we selected women that died of BC during six years, from 2007 to 2012, and were treated in a central acute care general hospital and compared it with the BC patients that died in 2003 and were treated in a large cancer center. We analyzed a total of 232 patients: the more recent group has 114 women and the older cohort has 118. We used descriptive statistics to characterize CT in the EoL and use of palliative care resources. Both populations were similar in terms of BC characteristics. We observed more palliative care resources, pain clinic, palliative care teams and palliative radiotherapy, involved in the care of MBC patients and a shift towards more deaths at hospices. Systemic anti cancer treatments continue to be prolonged until very late in patients’ lives, notwithstanding, we could show a decrease in the use of such treatments. Other indicators of aggressiveness, namely hospital admissions, also show a decrease. We confirmed our hypothesis that there is more integration of multidisciplinary palliative care and less aggressiveness in the treatment of metastatic cancer patients, specifically, use of palliative anti-cancer treatment and hospital admissions. Nonetheless, we use systemic therapy until too late with underutilization of palliative medicine. Chapter 10: Why do our patients get chemotherapy until the end of life? (editorial) The editorial starts with a clinical case of a 21 year old patient that lives three months after starting palliative chemotherapy for the first time, a case that illustrates therapeutic futility at the end of life. Why are we not ceasing chemotherapy when it is useless, toxic, logistically complex and expensive? Are we prescribing chemotherapy until too late in solid tumor patientsʼ lives? Medical oncologists have overly optimistic predictions and, excessive, treatment-prone attitude and they are criticized by other health care providers for this. Increasingly, patients, their families, advocacy groups, policy makers, journalists and society at large dwell on this topic, which is a perplexing conundrum, because sometimes they are the ones demanding not to stop aggressive systemic anticancer treatments, when it comes to their loved ones. There is a growing culture of awareness toward preserving quality of life, palliative care, symptom-directed care, hospice referral and end of life issues regarding terminal cancer patients. Sadly, this issue is gaining momentum, not because oncologists are questioning their practice but because health care costs are soaring. Whatever the motive, the reasons for administering chemotherapy at the end of life should be known. There are few and conflicting scientific data to guide treatments in this delicate setting and we review this evidence in this paper. Conclusion: What is the future of breast cancer care? This work ends with a view into the future of BC care. Looking into the different areas from prevention, screening, hereditary BC, local, regional and systemic treatments of adjuvant and metastatic patients. The last three paragraphs are a final comment where the story of a patient with Her2 positive locally advanced breast cancer is used as paradigm of evolution, heterogeneity and dynamism in the management of BC.

Assessment of prognosis in patients with stage II colon cancer

Assessment of prognosis of patients with stage II colon cancer.

Análisis de componentes del sistema inmune innato en la infección VIH/SIDA: Apoptosis y expresión de moléculas y receptores en Polimorfonucleares Neutrófilos

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) afecta principalmente a la respuesta inmune específica causando una pérdida progresiva de los linfocitos T CD4+. Este virus también puede afectar a células del sistema inmune innato, como los Polimorfonucleares Neutrófilos (PMN). Los objetivos propuestos para esta etapa del proyecto son: a) investigar el efecto de la infección por VIH sobre la apoptosis de PMN, b) analizar la expresión de moléculas y receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos en estas células y c) evaluar el impacto de la terapia antirretroviral sobre la apoptosis y expresión de moléculas y receptores en PMN. Se incluirán individuos en distintos estadios de la infección con o sin tratamiento antirretroviral y se determinarán parámetros hematológicos, inmunológicos y virológicos a fin de correlacionar el nivel de apoptosis y expresión de moléculas y receptores con el nivel de linfocitos T CD4+ y carga viral. La importancia de los PMN en el control de la infección por el VIH es actualmente un área de mucho interés, ya pueden ejercer un efecto anti-VIH directo, y al mismo tiempo, ser blancos de la infección viral. Comprender los aspectos claves en la cascada de la apoptosis de estas células podría en un futuro aportar posibles blancos terapéuticos, que permitan restaurar la función de los PMN durante la infección VIH/SIDA.

Patrones dinámicos de abundancia y dispersión de una plaga en un paisaje heterogéneo. Dynamic patterns of abundance and dispersion of a pest in a heterogeneous landscape.

El desarrollo de conocimiento empírico sobre cómo la heterogeneidad espacial de un paisaje afecta los patrones de movimiento de una especie animal es considerado una prioridad para el manejo y la conservación de las especies y sus hábitats. En el caso de los insectos plaga, estos estudios resultan importantes ya que aportan las bases teóricas y empíricas fundamentales para su manejo. La persistencia de éstas especies en un paisaje modificado depende de la interrelación entre procesos ecológicos y la estructura del paisaje, tales como la interacción entre especies, la disponibilidad de parches hábitat y la influencia de las prácticas de manejo. El análisis de éstos procesos en un agroecosistema permite simplificar los modelos de heterogeneidad espacial, debido a que los lotes de cultivo son internamente homogéneos y los disturbios antropogénicos generalmente ocurren a la escala de parche, permitiendo determinar las respuestas de los insectos a dicha escala. La alfalfa (Medicago sativa) es un recurso fundamental para la producción agropecuaria y en Argentina, es el recurso forrajero más importante, constituyendo la base de la producción ganadera del país. Actualmente se cultivan alrededor de 5 millones de hectáreas, de las cuales un millón se siembran en la provincia de Córdoba. Además, cumple un rol importante en la sustentabilidad de los sistemas de producción por su función de recuperación de la fertilidad y estabilidad edáfica. La isoca de la alfalfa (Colias lesbia) es la plaga principal del cultivo, produciendo en promedio la pérdida de un corte por año. La hipótesis principal de nuestro trabajo es que los patrones de abundancia y movilidad de la isoca de la alfalfa son afectados por la estructura del paisaje y las prácticas de manejo. Los objetivos específicos del proyecto son: (a) Establecer el efecto de la estructura del paisaje y y el manejo del cultivo en la abundancia de los distintos estadios de Colias lesbia. (b) Determinar los patrones de dispersión de Colias lesbia en relación a la heterogeneidad espacial del paisaje (c) Generar un modelo predictivo de la abundancia de Colias lesbia según la estructura espacial del paisaje, el clima y el manejo del cultivo. (d) Desarrollar un conjunto de recomendaciones de manejo a escala regional para el control de la isoca de la alfalfa. Para ello se elegirán lotes de alfalfa en la región este de la provincia de Córdoba, en el departamento de San Justo, donde se realizará un relevamiento inicial del área de estudio y se dialogará con los productores. Paralelamente, se realizará una clasificación supervisada del área de estudio a partir de escenas de imágenes Landsat TM. En los parches seleccionados, durante 3 años y durante los meses de verano, se muestrearán quincenalmente los distintos estadios de Colias lesbia. Se realizarán análisis de correlación y regresión entre las variables independientes (métricas de la configuración y dinámica del paisaje) y las variables dependientes, (abundancia media de los diferentes estadios de las poblaciones). Asimismo, se realizarán experimentos de marcado-liberación-recaptura para determinar cómo el movimiento de la especie depende de la estructura del paisaje. Para modelar el movimiento inherente de la especie se combinará la información obtenida en el campo con un modelo de difusión utilizando métodos bayesianos. Se espera obtener modelos que permitan comprender los mecanismos que generan los patrones observados. Con esta información se propondrán lineamientos generales y específicos para un manejo de la isoca de la alfalfa a escala regional. En tal sentido, se espera aportar información para restringir la dispersión de la plaga, y reducir los costos y perjuicios del control químico que podrían evitarse con la aplicación de prácticas de manejo integrado y de "manejo de área" que minimicen el impacto de la plaga como también contribuir al conocimiento general de la ecología de insectos.

Mecanismos de Fotopercepción No-Visual y Control Circadiano en la Retina Interna de Vertebrados en Condiciones Fisiológicas y en un Modelo Animal de Ceguera. Mechanisms of Non-visual Perception and Circadian Control in the Vertebrate Inner Retina under Physiological Conditions and in Animal Model of Blindness.

La retina juega un rol esencial en el funcionamiento del sistema circadiano de los vertebrados al ser la encargada de sensar las condiciones de iluminación ambiental que ajustan el reloj interno con el fotoperíodo exterior a través de un circuito no-visual. Este circuito es independiente de la vía de formación de imágenes e involucra a las células ganglionares retinianas (CGRs) que proyectan a varias estructuras no-visuales del cerebro; esta vía es la encargada de regular el reflejo pupilar, la sincronización de los ritmos diarios de actividad, el sueño y la supresión de melatonina pineal. La retina contiene además un reloj autónomo que genera ritmos diarios autosostenidos en distintas funciones bioquímicas y fisiológicas, que le confiere la capacidad de predecir el tiempo y anticiparse en su fisiología a los cambios lumínicos a lo largo del ciclo día-noche. Este laboratorio ha demostrado por 1ra vez que las CGRs de pollo poseen osciladores endógenos que generan variaciones diarias en la biosíntesis de fosfolípidos (Guido et al, J Neurochem. 2001; Garbarino et al., J Neurosci Res. 2004a) y de la hormona melatonina con niveles máximos durante el día (Garbarino et al., J Biol Chem 2004b). Aún más, cultivos primarios de CGRs responden a la luz a través de una cascada bioquímica de fototransducción similar a la de invertebrados y que involucra la activación de la enzima fosfolipasa C (PLC) (Contin et al., FASEB J 2006). Estos cultivos fueron obtenidos a estadios embrionarios muy tempranos en dónde solo las CGRs son postmitóticas y mayoritariamente maduras. A estos estadios, los cultivos expresan marcadores de especificación de células ganglionares (pax6, brn3), la proteina Gq y los fotopigmentos melanopsina y criptocromos con gran homología con marcadores descriptos para fotorreceptores rabdoméricos de invertebrados (Contin et al, 2006). Recientemente comenzamos a investigar la percepción de luz en pollos GUCY1*, un modelo de ceguera, en animales que carecen de células fotorreceptoras-conos y bastones-funcionales. Resultados preliminares indicarían que la retina interna, y potencialmente las CGRs de estos animales conservarían la capacidad de responder a la luz regulando el reflejo pupilar y sincronizando los ritmos diarios de alimentación. La convergencia de osciladores y fotopigmentos en la población de CGRs podría contribuir al control temporal de la fisiología del organismo y regulación de funciones no-visuales. Son objetivos de este proyecto: a) Investigar el rol de las CGRs en el sistema circadiano estudiando: i- su habilidad para sintetizar melatonina y, su regulación por luz y dopamina; ii- su capacidad fotorreceptora intrínseca, investigando la presencia de fotopigmentos y componentes de la cascada de fototransducción fundamentalmente la vía de los fosfoinosítidos y la activación de PLC, mediante ensayos moleculares, bioquímicos y farmacológicos; b) Extender estos estudios a cultivos primarios de CGRs inmunopurificadas midiendo la respuesta a la luz sobre la síntesis de melatonina, y los niveles de los mensajeros 2rios Ca2+ y AMP cíclico, la inducción de genes tempranos y la regulación de la actividad NAT, enzima clave en la síntesis de melatonina; y c) Investigar la percepción de luz en pollos GUCY1*(ciegos), sobre distintas funciones no-visuales tales como el reflejo pupilar, la sincronización de los ritmos diarios de alimentación, la síntesis de melatonina y la expresión génica en animales expuestos a estimulación lumínica de distintas intensidades y longitudes de onda. Estos estudios permitirán construir el espectro de acción de la respuesta a la luz en los pollos ciegos a fin de identificar el/los fotopigmentos intervinientes en este fenómeno. Este proyecto profundizará el conocimiento sobre la capacidad fotorreceptora-no visual de la retina interna y particularmente de las CGRs, de la naturaleza de la cascada bioquímica que opera en las mismas y de los mecanismos de regeneración del cromóforo utilizado.

Apoptosis y expresión de receptores de reconocimiento de patrones en Polimorfonucleares Neutrófilos de individuos con infección VIH/SIDA. Apoptosis and recognition patterns receptors expression in Polymorphonuclear Neutrophils of individuals with HIV/AIDS infection.

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1) afecta principalmente a la respuesta inmune específica causando una pérdida progresiva de los linfocitos T CD4+. Sin embargo, este virus también afecta a células del sistema inmune innato, tales como los Polimorfonucleares Neutrófilos (PMN). Existen evidencias de alteraciones funcionales de los PMN durante la progresión de la infección por VIH y una de las explicaciones de estos defectos, la atribuye a una muerte celular programada o apoptosis constitutiva incrementada. El compromiso de la apoptosis de los PMN en la infección por VIH no está totalmente dilucidado, por ello, los objetivos de este proyecto son investigar el efecto de la infección por VIH sobre la apoptosis de PMN, analizar la expresión de moléculas y receptores de patrones de reconocimiento en estas células y evaluar el impacto de la terapia antirretroviral sobre la apoptosis y expresión de moléculas y receptores en PMN. Se incluirán individuos en distintos estadios clínicos e inmunológicos de la infección con o sin tratamiento antirretroviral y se determinarán parámetros hematológicos, inmunológicos y virológicos a fin de correlacionar el nivel de apoptosis y expresión de moléculas y receptores con el nivel de linfocitos T CD4+ y carga viral. La importancia de los PMN en el control de la infección por el VIH es actualmente un área de mucho interés, ya pueden ejercer un efecto anti-VIH directo, y al mismo tiempo, ser blancos de la infección viral. Los mecanismos que conducen a la muerte acelerada de los PMN no han sido totalmente dilucidados, por ello, su estudio permitirá entender las bases bioquímicas de los cambios morfológicos y determinar los mecanismos que definen su iniciación y regulación. En el presente proyecto, el estudio de la apoptosis de PMN de pacientes con infección VIH/SIDA posibilitará caracterizar la sobrevida de éstas células y su relación con el estado inmunológico, virológico y la terapia antirretroviral. Además, el estudio de los receptores reconocedores de patrones moleculares asociados a patógenos permitirá aclarar algunos aspectos de la activación de la respuesta inmune innata y su conexión con la inmunidad adaptativa. Comprender aspectos claves de la cascada de la apoptosis de PMN y de la expresión de receptores reconocedores de patrones moleculares en la infección VIH/SIDA podría en un futuro aportar posibles blancos terapéuticos para restaurar la función de estas células durante esta infección.

Linfocitos th 17: moduladores o reguladores de la infección por VIH (Programa: enfermedades transmisibles y emergentes).

Los linfocitos T-CD4+ llamados helper (LTH) o cooperadores, componen una población heterogénea de células constituidas por LTH naive y células efectoras: TH1, TH2, TH17, TH1/TH17 y células regulatorias LT reguladores (T-reg). Ellas desempeñan un rol central en la defensa inmune y adquieren distintas propiedades funcionales en respuesta a señales que genera el sistema inmune innato. Los TH17 cumplen un rol crítico en la interrelación entre la inmunidad innata y adaptativa, en la inflamación crónica y en el mantenimiento de la esterilidad de la mucosa gastrointestinal. La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) se caracteriza por una gradual y progresiva disfunción del sistema inmune, con su consecuencia final el Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (SIDA). La infección viral involucra la interacción de proteínas virales con la molécula de superficie celular CD4 y el receptor de quimiocinas CCR5 o CXCR4. Nuestro objetivo es evaluar cualitativamente y cuantitativamente los TH17 en relación con los subtipos de LTH en pacientes con infección por VIH-1 en distintos estadios de la infección y correlacionarlos con la clínica del paciente. Para ello se estudiarán individuos con infección por VIH-1 en distintos estadios de la infección sin tratamiento antirretroviral a los que se evaluarán cuantitativamente los niveles de LTH y las subpoblaciones TH17, TH1 y Treg. Además, se estudiarán las características funcionales de los TH17 cuantificando los niveles de IL-17, IL-10 e INF-γ en suero y sobrenadante de cultivos celulares y los niveles de granulocitos. La evaluación de los TH17, en relación con la etapa inmune, virológica y con la clínica del paciente nos permitirá detectar subgrupos de pacientes y nuevos marcadores de progresión de la enfermedad.

Análisis de componentes del sistema inmune innato en la infección vih/sida: apoptosis y expresión de moléculas y receptores en polimorfonucleares neutrófilos (Programa:enfermedades transmisibles y emergentes).

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) afecta principalmente a la respuesta inmune específica causando una pérdida progresiva de los linfocitos T CD4+. Este virus también puede afectar a células del sistema inmune innato, como los Polimorfonucleares Neutrófilos (PMN). Los objetivos propuestos para esta etapa del proyecto son: a) investigar el efecto de la infección por VIH sobre la apoptosis de PMN, b) analizar la expresión de moléculas y receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos en estas células y c) evaluar el impacto de la terapia antirretroviral sobre la apoptosis y expresión de moléculas y receptores en PMN. Se incluirán individuos en distintos estadios de la infección con o sin tratamiento antirretroviral y se determinarán parámetros hematológicos, inmunológicos y virológicos a fin de correlacionar el nivel de apoptosis y expresión de moléculas y receptores con el nivel de linfocitos T CD4+ y carga viral. La importancia de los PMN en el control de la infección por el VIH es actualmente un área de mucho interés, ya que pueden ejercer un efecto anti-VIH directo, y al mismo tiempo, ser blancos de la infección viral. Comprender los aspectos claves en la cascada de la apoptosis de estas células podría en un futuro aportar posibles blancos terapéuticos, que permitan restaurar la función de los PMN durante la infección VIH/SIDA.

Desarrollo de un modelo predictivo de vulnerabilidad al consumo de alcohol durante la adolescencia

En las últimas décadas, el rol determinante de los factores genéticos en los trastornos por abuso y dependencia al alcohol se ha visto mitigado por estudios epidemiológicos y pre-clínicos que indican que la experiencia temprana con el alcohol está significativamente asociada al consumo posterior de la droga. Ciertos estadios parecen ser períodos críticos para modular el patrón de consumo: la iniciación en el consumo de alcohol durante la adolescencia constituye un factor de riesgo para el posterior desarrollo de problemas con el alcohol. Los sujetos que empiezan a consumir a los 15 años poseen cuatro veces más posibilidades de desarrollar dependencia hacia el alcohol que aquellos que empiezan a los 21 años. Estas investigaciones han modificado nuestra conceptualización del abuso y la dependencia hacia el alcohol, los cuales son ahora considerados trastornos del desarrollo con etiología en la adolescencia. Las ratas adolescentes son, en relación a sus pares adultos, menos sensibles a los efectos sedativos y de incoordinación motora del alcohol, pero más sensibles a los efectos apetitivos reforzantes derivados de la ingesta de alcohol. Este perfil de respuesta podría poner a los adolescentes a riesgo de desarrollar problemas con el alcohol. El presente proyecto indagará, mediante el uso de modelos animales, factores de vulnerabilidad para el consumo exacerbado de alcohol durante la adolescencia y mecanismos asociados a los mismos. Se pretende generar un modelo predictivo de la ingesta adolescente de etanol en función de la evaluación de sensibilidad a los (a) efectos facilitadores de la exposición temprana al alcohol, (b) efectos motivacionales reforzantes de la droga y también en función de la (c) respuestas de búsqueda de la novedad. Se evaluara (Experimentos 1 y 2) si la iniciación adolescente al alcohol tiene un efecto facilitador sobre la ingesta posterior de la droga y si dicho efecto puede contrarrestarse por la administración de antagonistas opiáceos. Los sustratos neurales de este fenómeno son aún poco conocidos. En el presente trabajo realizaremos una caracterización anátomo-funcional de estos sustratos (Experimento 3), mediante genes de expresión temprana c-fos y delta-fos B y el marcado de células catecolaminérgicas, con especial atención a áreas que han sido relacionados con el desarrollo dependencia a drogas (corteza prefrontal y núcleo accumbens). El Experimento 4 analizará la respuesta general de activación frente a la novedad a partir de locomoción en campo abierto, y la adquisición de aprendizajes motivacionales apetitivos y aversivos durante el transcurso de un mismo episodio de intoxicación con alcohol. También se analizará (Experimentos 5 y 6) el rol mediador de el acetaldehído, un producto de la metabolización del alcohol, en la expresión de efectos motivacionales del etanol, evaluados mediante CPL. Una de las hipótesis es que la iniciación al alcohol durante la adolescencia, pero no así durante la adultez, afectará el consumo posterior de esta droga y que esto será revertido por la administración de naltrexona. Se espera proveer un mapa de las áreas cerebrales que se activan en el adolescente luego de la auto-administración de alcohol. Este conocimiento será derivado de la aplicación de marcado de genes de expresión temprana c-fos (específicamente dirigidos a la evaluación de efectos agudos) y delta fos b (que, hipotetizamos, serán expresados luego de la experiencia crónica con la droga). Los datos del Experimento 4 permitirán indagar la asociación entre diferentes rasgos conductuales del adolescente e ingesta de alcohol. Nuestra expectativa es que la ingesta de alcohol estará positivamente asociada con la reactividad a la novedad y el reforzamiento apetitivo, y negativamente asociada a los efectos aversivos de la droga. Finalmente, esperamos observar que la administración de d-penicilamina (un secuestrador de acetaldehído) bloquee la expresión de las propiedades reforzantes del alcohol.

Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la inmunosupresión observada durante la infección con Trypanosoma cruzi: Rol de la vía PD-1/PD1-L y E3 ubiquitina ligasas. Molecular mechanismns involved in the immunosupression during Tryapanosoma cruzi infection. Role of PD1-PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases.

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, un problema de salud importante en América Latina, así como también en América Central, ya que causa infección crónica afectando a millones de personas [1]. Durante esta enfermedad se han descripto varias alteraciones de la respuesta inmune, entre ellas una severa inmunosupresión durante la etapa aguda de la infección, tanto en humanos como en ratones. Células T provenientes de ratones infectados activadas in vitro, muestran reducción en la respuesta proliferativa a mitógenos, característica de un estado de inmunosupresión [2-4]. La falla del sistema inmune durante estadios tempranos de la infección probablemente colabore con la diseminación y el establecimiento del parásito. Un gran número de estudios se han focalizado en la identificación de mecanismos moleculares responsables del fenómeno de inmunosupresión, entre los mecanismos citados se ha demostrado presencia de células supresoras [5-9], factores inmunosupresores presentes en el parásito [2, 3, 10-13], producción excesiva de óxido nítrico [14], disminuida producción de IL-2 y reducida expresión del receptor de IL2 en células de bazo de animales infectados [9, 15-17]. Muchos de estos mecanismos han sido exhaustivamente investigados, sin embargo no está del todo claro si existen mecanismos adicionales involucrados en la inmunosupresión de la célula T. Adicionalmente, en los últimos años nuevas moléculas que median la regulación negativa de la célula T, entre las cuales están PD-1/PD1-L [18], arginasa [19] y E3 ubiquitina ligasas [20-22], han sido reportadas durante inmunosupresión en diversas infecciones. Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, is parasite causing chronic infections in human and other mammalian species. There is an important immunosupresion during the acute phase of the infection that contribute to the dissemination and installation of the parasite. Several studies have been focused on identifying the mechanisms involved in the immunosupresion; however it is not clear if there are additional mechanisms implicated. In addition, during the last years new molecules involved in the negative T cell regulation such as PD-1/PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases (E3-Ub-Lig) have been reported. It has been demonstrated, that E3-Ub-Lig control the amount and localization of intracellular signal mediators, limiting T cell activation. Moreover, these mechanisms mediate the immunosupresion observed during several infections leading to the persistence of the pathogen in the host. In this project the role of E3-Ub-Lig on the T cell immunosupresion and hipo-response mechanisms observed during T. cruzi infection will be studied. On the other hand, it has been reported that some pathogens release proteins with E3-Ub-Lig activity modifying the ubiquitination process to promote their survival and replication in the host. Recently, a protein with E3-Ub-Lig activity was identified in T. cruzi, however its target molecule has not been discovered yet. Therefore, one of the aims of this project consists on studying different potential target molecules for this novel E3-Ub-Lig. In addition, during the last years, important progress has been done about the biological rol of PD-1/PD1-L pathway on the regulation of the immune response in several infections. However, it is not well known how PD-1/PD1-L pathway transduces signals at intracelular level to block T cell response. Because of this, it is interesting to study if there is any relation between the PD-1/PD1-L pathway and E3-Ub-Lig on the mechanism of T cell immunosupression during T. cruzi infection.

Linfocitos TH 17: moduladores o reguladores de la infección por VIH-1.

Los linfocitos T-CD4+ llamados helper (LTh) o cooperadores, componen una población heterogénea de células constituidas por LTh naive y células efectoras: Th1, Th2, Th17, Th1/Th17 y células regulatorias LT reguladores (T-reg). Ellos desempeñan un rol central en la defensa inmune y adquieren distintas propiedades funcionales en respuesta a señales que genera el sistema inmune innato. Los Th17 cumplen un rol crítico en la interrelación entre la inmunidad innata y adaptativa, en la inflamación crónica y en el mantenimiento de la esterilidad de la mucosa gastrointestinal. La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) se caracteriza por una gradual y progresiva disfunción del sistema inmune, con su consecuencia final el Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida (SIDA). La infección viral involucra la interacción de proteínas virales con la molécula de superficie celular CD4 y el receptor de quimiocinas CCR5 o CXCR4. Nuestro objetivo es evaluar cualitativamente y cuantitativamente los Th17 en relación con los subtipos de LTh en pacientes con infección por VIH-1 en distintos estadios de la infección y correlacionarlos con la clínica del paciente. Para ello se estudiarán individuos con infección por VIH-1 en distintos estadios de la infección sin tratamiento antirretroviral a los que se evaluarán cuantitativamente los niveles de LTh y las subpoblaciones Th17, Th1 y Treg. Además, se estudiarán las características funcionales de los TH17 cuantificando los niveles de IL-17, IL10 e INF-G; en suero y sobrenadante de cultivos celulares y los niveles de granulocitos. La evaluación de los Th17, en relación con el fase inmune, virológico y con la clínica del paciente nos permitirá detectar subgrupos de pacientes y nuevos marcadores de progresión de la enfermedad.

Desarrollo de máquina de perfusión para la conservación de órganos para trasplante. Modelo renal.

El trasplante renal es el tratamiento óptimo para personas que sufren estadios terminales de enfermedades renales, presentando una relación costo beneficio a favor del trasplante con respecto a la diálisis. El número de paciente que requieren ser trasplantado se incrementa año a año, pero este incremento no se ve acompañado con el aumento de los órganos disponibles. Según el SINTRA en nuestro país hay 5880 pacientes en lista de espera para recibir un trasplante renal, durante el 2011 se procuraron 1720 riñones con criterios clásicos. Es consecuencia de esta falta de órganos que se comenzó a utilizar órganos marginales, aquellos que no reúnen los criterios clásicos de donantes, el inconveniente que esto genera, es que los órganos a trasplantar presentan un mayor índice de daño celular y de rechazo. Diferentes estudios demostraron que la utilización de máquinas de perfusión en estos órganos mejora la sobrevida del órgano y disminuye el rechazo, algo que no se puede lograr con los métodos de conservación clásicos. El objetivo de este proyecto es: desarrollar y construir una máquina de perfusión renal de flujo continuo / pulsátil, con las innovaciones que consideramos pertinentes para la conservación de órganos con criterios extendidos. La máquina dispondrá de dos cámaras herméticas una dentro de la otra, la interior que contendrá al órgano el cual será conectado por medio de cánulas, a una bomba pulsátil con solución de Wisconsin o similar, estará rodeada de otra con líquido refrigerante bombeado desde una bomba refrigerante eléctrica portátil, estos sistema eléctricos serán a batería de larga duración. Nuestro prototipo aporta además nuevas innovaciones como son; un sistema (GPS) que permitirá conocer la ubicación precisa del dispositivo activado y poder coordinar de mejor manera el procedimiento quirúrgico, una computadora de a bordo con la que se controlará todos los sistemas y se almacenarán los parámetros estadísticos del órgano transportado, consolas y pantalla táctil para el control de los parámetros de funcionamiento, se construirá la carcasa con tecnología LRTM de fibra de vidrio inyectada la cual se está desarrollando en nuestra empresa para aplicaciones varias. Se desarrollarán piezas descartables de bajo costo, acorde a las disponibilidades económicas locales, para lograr de este modo la amplia utilización de esta máquina en todos los centros de trasplante y procuración de órganos del país.