Estudio de la factibilidad del uso de bioindicadores pasivos para la detección selectiva de contaminantes orgánicos. Feasibility study of the use of pasive biomonitors for the selective detection of organic pollutants.

En Argentina, existe escasa información sobre las características y concentración de sustancias orgánicas en la atmósfera y, en particular, la información referida a compuestos polifluorados (como por ej. Ácidos perfluorocarboxílicos, PFCA) es prácticamente nula. Los niveles de concentración de estos compuestos están aumentando de manera alarmante en todo el mundo. Se conoce la elevada toxicidad de algunos de ellos debido a que son bioacumulativos, persistentes en el ambiente y potencialmente cancerígenos. En estos momentos se está investigando cuales son los precursores de estos compuestos en el medio ambiente y los mecanismos involucrados en la generación de los PFCA.El uso de biomonitores constituye una excelente alternativa al monitoreo instrumental automático, especialmente para países en desarrollo porque no requieren la aplicación de tecnologías complicadas y son de muy bajo costo. Con este fin se pretende evaluar la factibilidad del empleo de bioindicadores pasivos para la detección de sustancias orgánicas, entre ellos, alcoholes fluoroteloméricos y ácidos perfluorados y estimar el daño que estos compuestos provocan en los organismos expuestos. Se emplearán dos especies autóctonas de epífitas del género Tilandsia para evaluar modificaciones quimico-fisiológicas provocadas por la exposición a concentraciones conocidas de estos compuestos y la especie Tradescantia pallida para evaluar efectos genotóxicos. Se espera, además estimar las concentraciones ambientales de los compuestos bajo estudio mediante el empleo de biomonitores. En este contexto, el desarrollo de este proyecto tendrá un impacto favorable sobre el medio ambiente ya que sus resultados permitirán conocer la capacidad bioindicadora de especies biomonitoras autóctonas, con el fin de emplearlas para identificar ambientes contaminandos con compuestos orgánicos polifluorados y en un futuro extenderla a la mayor variedad de contaminantes atmosféricos orgánicos posibles. Además, la calibración de biomonitores servirá para realizar seguimientos temporales de este tipo de contaminantes en distintos ambientes en Argentina, o en el lugar donde exista el problema de contaminación.

Evaluación de STAT3, COX-2 Y P53 y su papel en la progresión de la inflamación crónica del epitelio bucal.

Durante el proceso oncogénico se desencadenan un sinfín de alteraciones moleculares producto de las características genéticas interindividuales y la exposición a carcinógenos ambientales. Aquellas células “transformadas” son capaces de establecer nuevos vínculos con el entorno, desarrollarse e invadir nuevos tejidos. El proceso inflamatorio es un factor indiscutible en el desarrollo y la progresión tumoral. En un ambiente de inflamación crónica, el daño tisular permanente y la liberación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno generan daños en el material genético y en enzimas de reparación, como ocurre con p53. Además, recientemente se pudo observar que NFkB induce la expresión de citoquinas proinflamatorias (IL-6, TNFa), chemoquinas (IL-8), moléculas de adhesión (MMP), COX2 (ciclooxigenasa-2) e iNOS (Óxido Nítrico Sintasa), generándose un mecanismo de retroalimentación positiva. De estas moléculas, la expresión de COX-2 podría ser una de las promotoras del desarrollo tumoral. STAT3 pertenece a una familia de factores de transcripción latente en el citoplasma y sería indispensable para la activación de numerosas proteínas oncogénicas y en el control de la respuesta del sistema inmune. Más aún, al regular negativamente a p53 sería la responsable de desencadenar el desarrollo tumoral en ausencia de mutaciones de p53. Se realizará un estudio de casos y controles, con un análisis interino a los 6 meses, con el objetivo de conocer qué ocurre con la expresión de COX-2 y STAT3 y evaluar la presencia de las mutaciones de p53 como moléculas clave en el inicio de la transformación tumoral. La población en estudio estará comprendida por tres grupos: pacientes con procesos inflamatorios persistentes en lesiones potencialmente malignas (casos de estudio); pacientes con procesos inflamatorios persistentes en lesiones no potencialmente malignas (control 1) y pacientes con diagnóstico de cáncer bucal (control 2). Se purificarán los ácidos nucleicos de las muestras de biopsia bucal obtenidas de manera rutinaria para confirmar el diagnóstico estomatológico y se analizarán mutaciones de p53 mediante PCR y niveles de expresión de COX2 y STAT3 por PCR semicuantitativa.

Análisis de componentes de la inmunidad innata en infecciones parasitarias. I. Apoptosis de polimorfonucleares (Programa: enfermedades transmisibles y emergentes).

La visión jerárquica de la respuesta inmune, en la cual las células no específicas de la respuesta innata son las primeras reclutadas al sitio del daño, antes que se desarrolle la respuesta inmune específica adaptativa, ha cambiado. Primero, la respuesta innata es mucho más específica que lo reconocido hasta ahora y segundo, las células del sistema innato de defensa constituyen un nexo con el sistema adaptativo, modulándola en el curso de una respuesta inmune. Este complejo patrón de interacciones se ha evidenciado recientemente con las funciones de los neutrófilos. La contribución de los neutrófilos a la respuesta inmunitaria antiparasitaria reside, fundamentalmente, en tres atributos. 1) su patrón de migración, 2) su capacidad fagocítica y 3) su arsenal de mecanismos microbicidas. El objetivo principal de este proyecto de investigación es investigar el efecto de antígenos parasitarios sobre la apoptosis, activación y producción de citocinas por neutrófilos y analizar las vías de activación de la muerte celular en neutrófilos cultivados con antígneos parasitarios. Para ello, en neutrófilos provenientes de individuos sanos se evaluará la apoptosis de estas células luego de su incubación con antígenos solubles y particulados de protozoos y helmintos. Además, se evaluará la expresión de distintos antígenos de superficie, se cuantificarán mediadores solubles pro-inflamatorios en los sobrenadantes de los cultivos y se evaluarán proteínas pro-apoptóticas y anti-apoptóticas en neutrófilos cultivados con antígenos parasitarios. En el contexto de la respuesta inmune innata frente a parásitos, sean protozoos o helmintos, intestinales o extraintestinales, es necesario evaluar el impacto de las infecciones parasitarias en la sobrevida de los neutrófilos y en la capacidad de estas células para liberar mediadores solubles lo que permitirá ampliar el conocimiento sobre su rol en procesos infecciosos.

EFECTO DE LA TERAPIA FOTODINAMICA SOBRE EL MICROAMBIENTE TUMORAL COMO ESTRATEGIA ANTINEOPLASICA: VALORACION DE LA RESPUESTA INTEGRAL EN MODELOS DE CULTIVO TRIDIMENSIONAL.

El carcinoma colorrectal es una de las neoplasias más comunes y es la segunda causa de muerte por cáncer luego del cáncer de pulmón. La principal causa de muerte de los individuos que padecen esta enfermedad es la metástasis hepática. La angiogénesis está asociada con la progresión y metástasis de dicho cáncer, afectando la supervivencia del paciente, y ocasionando la mayoría de las muertes. El crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en relación al crecimiento tumoral, es un proceso complejo. En 1971, Judat Folkman postuló la hipótesis: “el crecimiento tumoral es angiogénesis dependiente y que la inhibición de la angiogénesis podría ser terapéutica”. La Terapia fotodinámica es una modalidad terapéutica que utiliza compuestos fotosensibilizadores (FSs) que se acumulan en tejidos tumorales y una vez excitados por la luz actúan mediante 3 mecanismos principales: muerte directa de la célula tumoral; daño de la vasculatura tumoral; y respuesta inmunológica. La inhibición del proceso angiogénico presenta claras ventajas debido a la casi inexistencia, en individuos adultos, de neovascularización en condiciones fisiológicas normales. El desarrollo de ambientes celulares de arquitectura tridimensional es clave para simular las condiciones que gobiernan en el microambiente tumoral ya que las interacciones célula - célula juegan un papel clave en eventos fisiológicos tal como la angiogénesis. Por lo tanto, postulamos que el impacto de la TFD sobre los componentes del ambiente tumoral permitirá modular el proceso angiogénico como estrategia antitumoral. Los objetivos planteados son: I) Investigar la susceptibilidad individual de las de células endoteliales y tumorales a la TFD en la expresión y alteración de moléculas relevantes en angiogénesis. II) Examinar la respuesta de “células endoteliales fotosensibilizadas” al estímulo tumoral para comprender la regulación del proceso angiogénico 2D y 3D. III) Examinar la respuesta a la TFD vascular y TFD tumoral, determinando la eficacia de la doble terapéutica en revertir el proceso de angiogénesis 2D y 3D. IV) Investigar la capacidad estimulante de las “células tumorales fotosensibilizadas” de inducir angiogénesis en modelos in vivo. Para cumplir con los objetivos se propone evaluar: a) La expresión de factores proangiogénicos, moléculas de adhesión, invasividad y migración de células microendoteliales humanas y de adenocarcinoma de colon, comparando modelos de monocultivos 2D y 3D. b) La capacidad de las células tumorales, con diferente malignidad, de promover en las células endoteliales tratadas con TFD estímulos de: proliferación, migración, formación de tubos y quimiotáxis. c) La capacidad de la TFD en modular la respuesta parácrina que participa en la progresión tumoral. d) La implicancia en la respuesta a la TFD de factores de crecimiento y receptores celulares por siRNA o anticuerpos bloqueantes. e) La respuesta angiogénica in vivo mediante el uso de implantes de matrigel con células tumorales o sobrenadantes tratados con TFD. Este trabajo aportará conocimientos sobre el dialogo tumor-endotelio y la susceptibilidad de ese estímulo a la TFD. Además, se determinarán blancos terapéuticos que incrementen su efectividad en relación al proceso angiogénico. Las interacciones entre las células tumorales y endoteliales son relevantes en la angiogénesis tumoral. Por ello, nuevas y más eficientes terapéuticas involucran estrategias combinadas que se dirigen hacia las células tumorales y su entorno, el cual está compuesto por células endoteliales, perivasculares, y matriz extracelular. El abordaje de esta problemática de manera integrada hace suponer encontrar una solución más específica al tratamiento del cáncer. Se espera, según los resultados obtenidos, poder optimizar y/o modular la intervención terapéutica de la acción fotodinámica sobre blancos moleculares del proceso angiogénico.

APOPTOSIS PRODUCIDA POR SALES BILIARES EN EL EPITELIO INTESTINAL. IMPLICANCIAS EN LA ABSORCIÓN INTESTINAL DE CALCIO

En altas concentraciones, el deoxicolato de sodio (DXCS, sal biliar) produce daño hepático durante la colestasis y actúa como promotor de cáncer de colon en animales de experimentación. El estrés oxidativo que el DXCS desencadena produce alteraciones mitocondriales y del retículo endoplásmico, las cuales pueden llevar a la apoptosis. Las dietas occidentales, ricas en grasas y pobres en fibras, y el incremento de las expectativas de vida hacen que el DXCS circule mayor número de veces por el circuito enterohepático aumentando, en consecuencia, sus efectos citotóxicos. Dado que el intestino constituye la única puerta de entrada de calcio al organismo y que la absorción intestinal del catión es sensible al estrés oxidativo nos planteamos como HIPÓTESIS que el DXCS, en concentraciones fisiológicas altas, podría alterar la absorción intestinal de Ca2+, quizás por desencadenamiento de estrés oxidativo que estimularía los procesos apoptóticos de las células epiteliales, resultando en una disminución de la capacidad de transporte del catión. Para demostrar esta hipótesis, se plantearon los siguientes objetivos. OBJETIVO GENERAL: Conocer los mecanismos moleculares que pueden desencadenar altas concentraciones de DXCS en el duodeno y sus implicancias sobre la absorción intestinal de calcio. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1) Analizar la histología del intestino en presencia y ausencia de altas concentraciones de DXCS.2) Determinar el efecto del DXCS sobre la absorción intestinal de calcio en función del tiempo de exposición y la dosis. 3) Evaluar el efecto del DXCS sobre la expresión de genes relacionados con la absorción intestinal de calcio. 4) Analizar la expresión de proteínas que participan en la absorción intestinal de calcio tales como Ca2+-ATPasa, intercambiador Na+/Ca2+ y CB28k. 5) Estudiar el efecto del DXCS sobre el sistema redox intestinal, a través de la cuantificación del contenido de glutatión y carbonilos, de la medición de radicales libres hidroxilo y de las actividades de las enzimas del sistema antioxidante.6) Determinar la localización subcelular y la expresión de moléculas proapoptóticas de la vía intrínseca (Bax, citocromo c) y la fragmentación del ADN como indicadores de apoptosis en enterocitos expuestos a altas concentraciones de DXCS. 7) Analizar la expresión de moléculas proapoptóticas de la vía extrínseca (Fas, FasL, etc) en enterocitos tratados con DXCS.8) Interpretar los posibles mecanismos moleculares desencadenados por el DXCS que podrían afectar el proceso global de la absorción intestinal de calcio. Metodología: Se utilizarán pollos Cobb, los cuales serán alimentados con una dieta comercial. Al cabo de cuatro semanas de edad, se dividirán en dos grupos: a) controles y b) tratados con DXCS en el lumen intestinal a diferentes tiempos y concentraciones (1-100 mM). En ellos se medirá la absorción intestinal de calcio mediante la técnica del asa intestinal ligada in situ utilizando 45Ca2+ como trazador .Se medirá la expresión de genes y proteínas que participan en la vía transcelular de calcio por RT-PCR y Western blot, respectivamente. Se estudiarán variables asociadas al estres oxidativo tales como grupos carbonilos, radicales libres hidroxilos, niveles de glutatión y se medirá la actividad de enzimas del sistema antioxidante. Se evaluarán moléculas de las vías apoptóticas extrínseca e intrínseca. Para el análisis de los datos se utilizará ANOVA seguido del test de Bonferroni en la mayoría de los estudios. El estudio de la absorción intestinal de calcio bajo la influencia del DXCS, sal biliar no conjugada que está en gran proporción en el líquido fecal, arrojará información no sólo sobre los factores moleculares que influyen sobre la absorción intestinal del Ca2+ sino también puede brindar elementos que orienten hacia el conocimiento de la etiopatogenia de enfermedades que transcurren con alteraciones en la absorción del catión como es el caso de la osteoporosis o de otras patologías óseas.

EVALUACIÓN FUNCIONAL DEL CEREBRO: EL VALOR PREDICTIVO DE LA HABITUACIÓN COMO INDICADOR TEMPRANO DE LA INTEGRIDAD DEL SNC EN RECIÉN NACIDOS DE ALTO RIESGO NEUROLÓGICO POR HIPOXIA PERINATAL

La hipoxia perinatal se considera hoy una de las causas de mayor morbimortalidad en el recién nacido estando altamente asociada con déficits de orden neuro-psico-sensorial. Un adecuado tratamiento y rehabilitación implica la detección temprana de los déficits apuntando a la prevención. La neonatología actual se está orientando hacia técnicas no invasivas que valoran la respuesta hacia estímulos de diferentes cualidades sensoriales y permiten indagar capacidades tempranas de aprendizaje y memoria. La precoz madurez del sistema olfativo facilita el trabajo con estas claves brindando asímismo un panorama de la integración cortical. Hipótesis: Las capacidades de habituación-deshabituación olfativa reflejan el estado del SNC neonatal y se convierten en un indicador temprano de la funcionalidad cerebral en niños con alto riesgo neurológico. Objetivos: Evaluar la integridad funcional del cerebro de recién nacidos con riesgo neurológico mediante técnicas no invasivas de habituación-deshabituación. Estas téncicas se tomarán como indicadores del estado del SNC neonatal comparando sus resultados con los arrojados por el test de Bayley durante el primer año de vida. Asímismo, se relacionarán los resultados con las valoraciones clínicas y de imágenes (ecografía y RMN) obtendias. El objetivo último implica determinar la sensibilidad, especificidad y valor predictivo del test de Habituación-Deshabituación para el daño cerebral . Materiales y Métodos: Se evaluarán pacientes con antecedentes perinatales de hipoxia pertenecientes al Servicio del Neonatología del HUMN y al Hospital Materno Neonatal (Pcia de Córdoba) caracterizados por apgar < 3 a los 5 minutos ó < 5 a los 5 minutos, Ph de cordón < 7 ó entre 7 y 7,10 ó >7,10 con alguno de los criterios anteriores presentes y niños con manifestaciones sistémicas de asfixia o déficit de base en gas arterial superior a -15 Meq/L. De manera posterior a la firma del consentimiento informado se aplicará un esquema olfativo de habituación-deshabituación antes y después de las 6 horas de vida consistente en 10 presentaciones consecutivas de olor a limón o vainilla seguidos de 5 presentaciones consecutivas de olor a vainilla o limón que actúan como estímulos deshabituatorios. Se filmará la conducta motriz que será considerada como variable dependiente. Asímismo se evaluarán parámetros fisiológicos como presión areterial, saturación de oxígeno, frecuencia cardíaca y ritmo respiratorio. La evaluación de la habituación se complementará con estudios clínicos y ecografía cerebral antes de las 48 hs y 1 vez por semana. Todos estos bebés serán seguidos por el equipo de Seguimiento del Recién Nacido de Alto Riesgo. A los 6 meses y al año de vida se evaluará el desarrollo integral con el Test de Bayley . Resultados Esperados: Se espera encontrar diferencias en los patrones habituacionales en función del estado cerebral del bebé. Aquellos bebés con riesgo leve tenderán a mostrar patrones habituatorios que se acercan a los normales mientras que los que presenten riesgo moderado o grave exhibiran patrones habituacionales defectuosos. Estos resultados se correlacionarán con los estudios de seguimiento realizados y con los indices de desarrollo mental y motor arrojados por el test de Bayley durante el año de vida. Importancia del Proyecto: Definir precozmente al niño con riesgo neurológico permite intervenir a tiempo con la estimulación y rehabilitación adecuada. Teniendo en cuenta la valoración del examen clínico, los antecedentes perinatales y los estudios de imágenes que se realizan en el bebé junto a los resultados obtenidos en las pruebas habituacionales, el proyecto brinda la posibilidad de la construcción de un score de riesgo neurológico sencillo y de fácil utilización.

PARTICIPACIÓN DEL RECONOCIMIENTO INMUNE INNATO EN LA RESPUESTA DE CARDIOMIOCITOS DURANTE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON TRYPANOSOMA CRUZI. Characterization of the cardiac innate immune response during Trypanosoma cruzi experimental infection.

La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, constituye la principal miocarditis infecciosa a nivel mundial. Crecientes evidencias revelan que la respuesta inmune innata tendría un rol determinante en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. La inmunidad innata es la primera línea de defensa, no específica, preprogramada para combatir agentes infecciosos. Este sistema censa la presencia de antígenos extraños a través de los receptores tipo toll (TLR) produciendo citoquinas y activando mecanismos microbicidas. Sin embargo, los TLRs también se hayan distribuidos en las células parenquimales no inmunes, jugando un importante rol tanto en la defensa como en la homeostasis de cada tejido. Durante la etapa aguda de la infección, el T. cruzi invade y se replica dentro de una amplia variedad de células y tejidos. Pero posteriormente, los parásitos son efectivamente eliminados de la mayoría de los tejidos persistiendo durante toda la vida en las células del músculo cardíaco y esquelético de los pacientes infectados. Debido a que el mantenimiento de la célula cardíaca infectada es crítica para la patogénesis de la enfermedad, los mecanismos que participan en la sobrevida de los cardiomiocitos están siendo foco de nuestro estudio. Hemos demostrado, que la infección ejerce efectos antiapoptóticos sobre células cardíacas aisladas. Nuestra hipótesis es que la inmunidad innata cardíaca estaría involucrada en el mantenimiento de la sobrevida de los miocitos así como en la defensa contra el parásito. Objetivo general: determinar la participación de la respuesta inmune innata cardíaca en el desarrollo de la enfermedad de Chagas experimental murina. Objetivos específicos: 1) Analizar el compromiso de TLRs en la respuesta anti-apoptótica y de autofagia de cardiomiocitos aislados de ratones salvajes y de ratones deficientes en TLR4, TLR2 y en MyD88, molécula adaptadora de la señalización por TLRs, sometidos a la infección con el parásito. 2) Determinar la importancia de la actividad cisteín proteasa parasitaria en el grado de infectividad y la sobrevida de cultivos primarios de ratones salvajes infectados con parásitos transgénicos que poseen disminuída o nula actividad cisteín proteasa. 3) Establecer la cinética de expresión de TLR2/TLR6, TLR4 y TLR9, factores antiapoptóticos (Bcl-2, Bcl-xL, etc.), daño cardíaco y la carga parasitaria en el tejido cardíaco de ratones infectados salvajes y/o deficientes antes mencionados. Materiales y Métodos: Los animales serán infectados i.p. con 5x103 parásitos y se determinará la cinética de expresión de los mediadores mencionados por western blot e inmunofluorescencia, la carga parasitaria será determinada por qRT-PCR. Como controles se procesarán animales inyectados con solución salina. En cultivos primarios de cardiomiocitos de ratones neonatos salvajes y deficientes infectados se estudiará la carga parasitaria, la activación de los mecanismos microbicidas (producción de óxido nítrico, metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, ciclooxigenasa, etc.), producción de citoquinas y expresión de moléculas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bax, etc.). Se explorará la tasa de apoptosis en cultivos deprivados de suero. La autofagia se analizará por microscopia electrónica. Cultivos controles serán mantenidos en medio o tratados con ligandos de los diferentes TLRs. Resultados preliminares sugieren que tanto TLR2 como Bcl-2 se incrementan en tejido cardíaco infectado. Esto nos lleva a profundizar en los mecanismos observados en cultivos y estudiarlos en un modelo in vivo, analizando la posible importancia que tiene la inmunidad innata cardíaca en el control del establecimiento de la infección. La comprensión de los mecanismos que mantienen la sobrevida de los cardiomiocitos y su respuesta a la infección es importante ya que el conocimiento de las bases moleculares es fundamental para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. Chagas disease is endemic in Central and South America and causes the most common myocarditis worldwide. We have previously reported that the cardiotrophic parasite Trypanosoma cruzi, its etiological agent, protects cardiomyocytes against apoptosis induced by growth factor deprivation activating the PI3K/Akt and MEK1/ERK signaling pathways. Recent studies have shown that local innate immunity plays a key role in initiating and coordinating homeostatic as well as defense responses in the heart. One of the mechanisms by which the innate immune system senses the presence of foreign antigens is through TLRs. The stimulation of these receptors leads to the activation and nuclear translocation of NF-kB transcription factor and the production of cytokines. Proinflammatory cytokines, in turn, appear to play a central role in the orchestration and timing of the intrinsic cardiac stress response providing, under different situations, instantaneous anti-apoptotic cytoprotective signals, which allow tissue repair and/or remodeling. The aim of the present project is to study the cardiomyocyte innate immune responses to T. cruzi infection and its role in target cell protection from apoptosis. Specific objectives: 1) Study the mechanism triggered by TLR in the anti-apoptotic response and parasite load of infected cardiomyocyte primary cultures from wild type and mice deficient in TLR2, TLR4 or MyD88. 2) Determine the effect of parasite cisteín protease activity on primary cultures from wild type mice. 3) Determine the TLR signaling-involvement in parasite load and survival indicators in deficient mice. Preliminary results showed us that cardiac-TLR2 may be involved in the anti-apoptotic effect elicited by the parasite and prompted us to establish the mechanisms triggered by the innate immunity that mediate parasite persistence within the host cell.

Participación de las células supresoras mieloides (CSM) y T regulatorias (Treg) en el control de la infección con Trypanosoma cruzi y el desarrollo de la patología inflamatoria asociada a la infeccion. Role of Myeloid-Derived Suppressor Cells and regulatory T cells in the control of T. cruzi infection and the infection-associated pathology.

La infección de mamíferos con el T. cruzi resulta en diferentes alteraciones inmunológicas que permiten la persistencia crónica del parásito y destrucción inflamatoria progresiva del tejido cardiaco, nervioso y hepático. Los mecanismos responsables de la patología de la enfermedad de Chagas han sido materia de intensa investigación habiéndose propuesto que el daño producido en esta enfermedad puede ser consecuencia de la respuesta inflamatoria del individuo infectado y/o de una acción directa del parásito sobre los tejidos del hospedador. El propósito del presente proyecto es estudiar comparativamente, en dos cepas de ratones con diferente susceptibilidad a la infección y desarrollo de patología, la participación y los mecanismos efectores de las células supresoras mieloides (CSM) y las celulas T regulatorias inducidas por la infección experimental con Trypanosoma cruzi en el control de la infección con este protozoario y en el desarrollo de la patología hepática siendo los objetivos especificos desarrolar: - Investigar la generación y/o reclutamiento de células de CSM en bazo e hígado de ratones infectados con Trypanosoma cruzi y su contribución a la desigual susceptibilidad a la infección y respuesta inmune desarrollada en las cepas de ratones BALB/c y C57BL/6; - Investigar la capacidad de las CSM inducidas por la infección con T. cruzi en bazo e hígado de ratones de ambas cepas para suprimir la respuesta de células T in vitro e indagar sobre los mecanismos de supresión utilizados; - Investigar la generación y/o reclutamiento de células Treg durante la infección experimental con Trypanosoma cruzi, su participación en la desigual susceptibilidad a la infección y respuesta inmune desarrollada en ambas cepas de ratones y los mecanismos de supresión utilizados. - Analizar en tejido hepático o leucocitos infiltrantes la presencia de COX2, PGE2, MMP2 y 9, IL1b, IL6, IDO, IL10 y GM-CSF capaces de inducir la expansión de las CSM; - Dilucidar si la administración del ligando para TLR2 (Pam3CyS) previo a la infección de ratones C57BL/6 (en los cuales se detecta un menor número de CSM) es capaz de modular la respuesta inflamatoria y el daño hepático a través de la inducción de CSM y/o T reg en hígado y bazo. La comprension de los eventos celulares y moleculares que regulan la producción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias y otros mediadores, así como el papel de los receptores de la inmunidad innata durante la infección con T. cruzi contribuirá a responder interrogantes que son claves para el diseño de nuevas estrategias de intervención inmune tendientes a preservar los mecanismos de defensa del huésped. Two nonexclusive mechanisms have been proposed to explain the Chagas’s disease pathology: 1) The pathology of the disease seems to be consequence of the inflammatory response triggered for the parasite; or 2) The damage is produced by the parasite direct effect. Recently, we reported that TLR2, TLR4 and TLR9 (innate immune response receptors) are differentially modulated in injured livers from BALB/c (lesser liver pathology) and C57BL/6 (elevated liver pathology) mice during Trypanosoma cruzi infection. The aim of our proposal is the study of role of Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC) and regulatory T cells in the control of T. cruzi infection and the infection-associated pathology. Our specific aims are: -To study the induction or recruitment of MDSC in splenn and liver of BALB/c and C57BL/6 mice and their relationship with the differential susceptibility and immune response observed in these both mice strains; - To determine the ability and the mechanisms used by the T. cruzi-induced MDSC to suppress the T cell proliferative response; -To study the induction or recruitment of Treg in liver of BALB/c and C57BL/6 mice and their relationship with the differential susceptibility and immune response observed in these both mice strains; -To analize in liver tissue or tissue infiltrating lymphocytes the activation of COX2, PGE2, MMP2 y 9, IL1b, IL6, IDO, IL10 y GM-CSF known to promote the development of MDSC; -To determine whether the treatment with Pam3CyS (TLR2 ligand) is able to modulate the liver inflammatory respose and damage througth the induction of MDSC or Treg.

Procesos oxidativos en matrices alimentarias complejas. Oxidative processes in complex food matrices.

Las reacciones bioquímicas que ocurren como consecuencia del tratamiento y almacenamiento de los alimentos, mejoran la seguridad alimentaria, las propiedades sensoriales y la vida útil. Sin embargo, el tratamiento térmico, la exposición a la luz y el oxígeno pueden causar daño oxidativo a los lípidos y proteínas. Los procesos oxidativos de matrices complejas tienen características distintivas que no se manifiestan cuando los componentes son sometidos a oxidación individualmente. La hipótesis de trabajo es que la oxidación de proteínas en matrices alimentarias complejas altera la estructura y las propiedades funcionales de las proteínas y, que las modificaciones que se producen varían según las condiciones de procesamiento y de la composición química del alimento. Nuestros estudios intentan demostrar que el estado oxidativo de las proteínas de un alimento es un parámetro importante para la evaluación de las propiedades funcionales, sensoriales y nutricionales de un producto lácteo. El objetivo general del proyecto es el estudio de los procesos de oxidación de matrices alimentarias complejas (la leche, miel) y su relación con distintos procesos y materiales utilizados en la industria. Es decir, nos proponemos estudiar las consecuencias funcionales y biológicas (calidad nutricional, coagulación) de la oxidación proteica en modelos experimentales “in vitro” y en productos comerciales. 1. Estudiar los fenómenos de peroxidación proteica en leche entera y descremada sometida a los distintos procesos tecnológicos de la producción de leche y queso a escala laboratorio. Se realizarán las mismas experiencias con albúmina sérica y con proteínas aisladas de suero de leche para comparar diferencias entre una matriz compleja y una simple. 2. Determinar la relación entre oxidación y composición proteica de la leche, y los cambios en las fracciones proteicas aisladas (caseínas y beta-lactoglobulina). 3. Analizar el impacto de los procesos tecnológicos a nivel de producción primaria (composición proteica y estado de oxidación) en los indicadores de inflamación (contenido de células somáticas y proteína C Reactiva) y de estado redox (capacidad antioxidante de los productos lácteos y nivel de carbonilos de proteinas). 4. Comparar las características de composición química y el estado de oxidación de leche provenientes de las tres regiones (Buenos Aires, Santa Fe y Córdoba) que conforman la cuenca láctea Argentina. Este objetivo se realizará conjuntamente con los integrantes de nuestro grupo de investigación que trabajan en el Laboratorio de Control de Calidad de la Escuela Superior de Lechería. 5. Determinar los metabolitos secundarios de mieles uniflorales propuestos como responsables de la capacidad antioxidante de estas (polifenoles) y como indicadores de su origen botánico. 6. Valorar la capacidad antioxidante total de mieles uniflorales. 7. Validar los métodos analíticos y semicuantitativos utilizados y a utilizar en el presente proyecto teniendo en cuenta lo efectos de matrices típico de los fluidos biológicos y las mezclas. El estudio de las modificaciones oxidativas de matrices complejas es un tema que es importante tanto desde el punto de vista del conocimiento básico como del aplicado. Nosotros creemos que el presente proyecto aportará conocimiento sobre las características de las vías oxidativas de proteínas en matrices complejas y que podrá ser utilizado para diseñar estrategias productivas tendientes a disminuir el deterioro de la calidad de la leche debido a la exposición a energía radiante. Parte de la experiencia ganada por el grupo ha sido ya volcada a subsanar dificultades y problemas de oxidación y deterioro de la calidad de alimentos. Además, se contribuirá a discernir la paradoja que existe en el área sobre las propiedades oxidantes/antioxidantes de los polifenoles y la relación entre estas y el estado oxidativo de un alimento. The biochemical reactions that occur as a result of food treatment and storage, improve food security, sensory properties and shelf life. Heat treatment, exposure to light and oxygen can cause oxidative damage to lipids and proteins. Oxidative processes in complex matrices display distinctive features that do not appear when the components are individually subjected to oxidation. The hypothesis is that protein oxidation in complex food matrices alters the structure and functional properties of proteins and that the modifications vary according to process conditions and food composition. The main goal is to study oxidation of complex food matrices (milk, honey) with different processes and materials used in the industry. The specific aims are: 1. To study protein oxidation in whole milk and skim subject to various technological processes. The same experiences will be done with serum albumin and isolated whey proteins to compare complex and simple matrices. 2. To determine the relationship between oxidation and milk protein composition, and changes in casein and beta-lactoglobulin. 3. Analyze the impact of technological processes at the level of primary production on markers of inflammation and redox (antioxidant capacity and protein carbonyls). 4. Compare characteristics of chemical composition and oxidation state of milk. 5. Determine secondary metabolites of honey responsible for the antioxidant capacity of these. 6. To evaluate the total antioxidant capacity unifloral honey. This project will provide knowledge about characteristics of oxidative pathways of proteins in complex matrices that can be used to design production strategies aimed at reduce the deterioration of milk quality. Also, it would help to discern the paradox that exists on the oxidants/antioxidants properties of polyphenols and the relationship between these and the oxidative status of a food.

Detección de genotixicidad en cerdos inducida por la ingesta de Aflatoxina B1

En cerdos la micotoxicosis representa uno de los problemas de contaminación ambiental más frecuente. La aflatoxina B1 (AFB1) producida por ciertas cepas de A. flavus y A. parasiticus, es un agente genotóxico, ya que al ingerir alimento contaminado, los metabolitos de AFB1 inducen daño cromosómico. En función de este problema se plantean las siguientes hipótesis de trabajo: 1. La ingesta de alimentos contaminados con AFB1 inducen daño cromosómico en cerdos. 2. La inducción, frecuencia y tipo de daño cromosómico es dependiente del tiempo de ingesta de AFB1. En este trabajo se evalúa el potencial genotóxico in vivo de la AFB1, mediante tres métodos distintos: Análisis de aberraciones cromosómicas, Ensayo de micronúcleos y Electroforesis en gel de células individuales. Se evaluarán dos grupos de cerdos en etapa postdestete, uno control y otro alimentado con pienso ad líbitum, con AFB1 a una determinada concentración. Se tomarán muestras de sangre a los 15, 30, 45 y 60 días. En concordancia con los antecedentes bibliográficos, se espera detectar la ocurrencia de daño cromosómico inducido por la ingesta de AFB1 a una determinada dosis. El efecto genotóxico debería ser detectado desde las tres técnicas elegidas para su estudio. Se espera poder establecer el tipo preponderante de daño inducido por la ingesta de AFB1 en cerdos posdestete, la sensibilidad de las diferentes técnicas empleadas para su detección y determinar si existe relación entre el tipo e intensidad de daño cromosómico y el tiempo de ingesta de AFB1. En virtud que Río Cuarto y la región es una zona agrícola-ganadera, donde la explotación porcina es de interés económico y la ocurrencia reiterada de brotes de micotoxicosis, plantea la necesidad de evaluar el potencial genotóxico de las micotoxinas. Considerando que gran parte de la información publicada sobre la toxicidad se refiere a estudios en animales experimentales de laboratorio, que pueden no reflejar sus efectos en seres humanos y en animales de granja, se considera relevante evaluar la toxicidad, particularmente la genotoxicidad en animales a campo y sus posibles consecuencias para la salud y producción porcina. El abordaje de la evaluación del daño genotóxico inducido por AFB1 desde tres ensayos distintos permitirá establecer cuál de éstos métodos reúne las condiciones más ventajosas en cuento a: sensibilidad, tiempo requerido, validez estadística, sencillez y economía, para ser el método de elección en posteriores estudios.

Evaluación de STAT3, COX-2 Y P53 y su papel en la progresión de la inflamación crónica del epitelio bucal.

Durante el proceso oncogénico se desencadenan un sinfín de alteraciones moleculares producto de las características genéticas interindividuales y la exposición a carcinógenos ambientales. Aquellas células “transformadas” son capaces de establecer nuevos vínculos con el entorno, desarrollarse e invadir nuevos tejidos. El proceso inflamatorio es un factor indiscutible en el desarrollo y la progresión tumoral. En un ambiente de inflamación crónica, el daño tisular permanente y la liberación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno generan daños en el material genético y en enzimas de reparación, como ocurre con p53. Además, recientemente se pudo observar que NFkB induce la expresión de citoquinas proinflamatorias (IL-6, TNFa), chemoquinas (IL-8), moléculas de adhesión (MMP), COX2 (ciclooxigenasa-2) e iNOS (Óxido Nítrico Sintasa), generándose un mecanismo de retroalimentación positiva. De estas moléculas, la expresión de COX-2 podría ser una de las promotoras del desarrollo tumoral. STAT3 pertenece a una familia de factores de transcripción latente en el citoplasma y sería indispensable para la activación de numerosas proteínas oncogénicas y en el control de la respuesta del sistema inmune. Más aún, al regular negativamente a p53 sería la responsable de desencadenar el desarrollo tumoral en ausencia de mutaciones de p53. Se realizará un estudio de casos y controles, con el objetivo de conocer qué ocurre con la expresión de COX-2 y STAT3 y evaluar la presencia de las mutaciones de p53 como moléculas clave en el inicio de la transformación tumoral. La población en estudio estará comprendida por tres grupos: pacientes con procesos inflamatorios persistentes en lesiones potencialmente malignas (casos de estudio); pacientes con procesos inflamatorios persistentes en lesiones no potencialmente malignas (control 1) y pacientes con diagnóstico de cáncer bucal (control 2). Se purificarán los ácidos nucleicos de las muestras de biopsia bucal obtenidas de manera rutinaria para confirmar el diagnóstico estomatológico y se analizarán mutaciones de p53 mediante PCR y niveles de expresión de COX2 y STAT3 por PCR semicuantitativa.

Evaluación clínica aleatoria de restauraciones tra y de resina compuesta clase II.

La caries dental es la patología más prevalente de la cavidad bucal. Diversos recursos para su prevención y tratamiento se han propuesto desde su identificación, asociando los abordajes convencionales actuales de las lesiones por caries con los elementos de mayor temor en la figura del odontólogo: la infiltración anestésica y efecto sonoro y vibratorio del instrumental rotatorio para la remoción de tejido cariado. El Tratamiento Restaurador Atraumático (ART) se ha reportado en publicaciones científicas como una alternativa exitosa, en la cual se remueve tejido descompuesto por caries con instrumental de excavación manual, restaurando la cavidad resultante con un material bioactivo, con características adhesivas. Sin embargo, dichos estudios clínicos revelan bajas tasas de sobrevida para cavidades de múltiples superficies, adjudicando el fracaso de las restauraciones a deficiencias del material de obturación. En función de estos hallazgos, la industria de los materiales dentales ha desarrollado nuevos productos superadores que podrían igualar a aquellos utilizados en técnicas convencionales, con la ventaja de asegurar una respuesta biológica más eficaz en la reparación del daño ocasionado por la enfermedad de caries, sustituyendo el uso de materiales resinosos o metálicos para la restauración. El objetivo general del presente estudio es comparar restauraciones convencionales y ART en cavidades de múltiples superficies (clase II) en premolares y molares.

Interacciones medicamentosas de los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y fibrosis renal: rol de la endotelina-1 como biomarcador

Esta propuesta está centralizada en la prevención y detección temprana de daño en el órgano blanco y monitoreo terapéutico para así disminuir las complicaciones derivadas de la hipertensión. Los sistemas internacionales de salud han llegado a disminuir costos de 25-45% aplicando un sistema de prevención eficaz de enfermedad renal crónica. Los pacientes mayores de 65 años tienen una alta tasa de polimedicación asociado a una alta prevalencia de hipertensión arterial. Gran porcentaje de ellos esta tratado con inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (iECA). Determinar el grado de compromiso en pacientes diagnosticados o no con hipertensión, es fundamental a la hora de comenzar un programa de prevención y monitoreo. Aumentos en la actividad de la ECA se asocia a daño renal, pero son relativamente escasos los datos que analizan el daño renal en relación con los niveles fibrosis renal, variable que hasta ahora solo podía ser observada mediante biopsias. Un 80% de pacientes polimedicados hipertensos desarrollan enfermedad renal crónica, aun teniendo controlada su presión arterial. Actualmente en nuestro conocimiento no hay estudios relacionados con las interacciones medicamentosas de los iECA y el daño en órgano blanco; menos aún con el aumento en la fibrosis renal. Basándonos en ello, se estima que las interacciones medicamentosas de los iECA elevan la concentración de Endotelina-1 urinaria, siendo este un marcador de fibrosis renal. La hipótesis de esta propuesta se basa en que las interacciones medicamentosas de los iECA estimulan la fibrosis renal en pacientes polimedicados hipertensos adultos mayores. Los objetivos de esta propuesta son: 1) Relevar pacientes con interacciones medicamentosas de los iECA y evaluar las interacciones medicamentosas más frecuentes en la población abordada, 2) Evaluar el cumplimiento terapéutico de los pacientes con diagnóstico confirmado de hipertensión arterial. 3) Evaluar el daño de órgano blanco renal en modelos animales de hipertensión (ratas espontáneamente hipertensas). Los resultados de esta propuesta contribuirán al afianzamiento de nuevos biomarcadores de daño renal, proveniente de datos de pacientes polimedicados que, generalmente, desarrollan enfermedad renal crónica con el paso del tiempo.

Evaluación de recursos forrajeros promisorios para áreas desfavorecidas.

En la región árida y semiárida del país, los pastizales naturales son la base de la alimentación animal en un 90 % y de ese porcentaje se estima que un 10 % se encuentra en buena condición y el resto muestra algún grado de deterioro. Esta situación de deterioro prevalece hoy en día en el 70% del territorio argentino. Una de las más graves preocupaciones acerca de la desertificación es el extenso daño causado al suelo. Estos suelos en todas estas regiones tienen un cierto grado de degradación, lo que los hace susceptibles a pérdidas por erosión eólica e hídrica. La mitigación de la degradación casi generalizada que presentan los recursos pastoriles en la zona árida y en menor medida en la zona semiárida argentina podría lograrse mediante la revegetación con especies herbáceas nativas y exóticas, así como la implantación de arbustos forrajeros exóticos. La utilización de nuevos recursos forrajeros evaluados y/o mejorados en los sistemas de producción de áreas desfavorecidas, permitirá mejorar e incrementar la productividad sustentable de las mismas. El presente proyecto plantea el objetivo general de generar conocimientos sobre adaptación, caracterización morfológica, productividad y calidad de germoplasma forrajero introducido en áreas ecológicamente desfavorecidas para incrementar la oferta forrajera, la producción y la estabilidad de los sistemas ganaderos. Se caracterizarán adecuadamente las especies en estudio (arbustos, subarbustos y herbáceas), de las familias Chenopodáceas y Fabáceas a través de la fenotipización de caracteres específicos de las especies promisorias. Se evaluará la persistencia, el crecimiento, la producción y la calidad de las accesiones adaptadas a las diversas condiciones ambientales (tres sitios de estudio). Además, el proyecto se vinculará con las redes de evaluación de gramíneas megatérmicas (INTA) con metodología estandarizada, estableciendo nexos entre proyectos similares con la institución relacionada y evaluará la calidad de genotipos mejorados de gramíneas megatérmicas con la institución relacionada (INTA). Este proyecto generará conocimientos que permitirán incrementar la oferta forrajera, la producción y la estabilidad de los sistemas ganaderos de dichas áreas. Esto permitirá paliar las necesidades de los productores de las áreas desfavorecidas y por ende su calidad de vida.

Evaluación de recursos forrajeros promisorios para áreas desfavorecidas.

En la región árida y semiárida del país, los pastizales naturales son la base de la alimentación animal en un 90 % y de ese porcentaje se estima que un 10 % se encuentra en buena condición y el resto muestra algún grado de deterioro. Esta situación de deterioro prevalece hoy en día en el 70% del territorio argentino. Una de las más graves preocupaciones acerca de la desertificación es el extenso daño causado al suelo. Estos suelos en todas estas regiones tienen un cierto grado de degradación, lo que los hace susceptibles a pérdidas por erosión eólica e hídrica. La mitigación de la degradación casi generalizada que presentan los recursos pastoriles en la zona árida y en menor medida en la zona semiárida argentina podría lograrse mediante la revegetación con especies herbáceas nativas y exóticas, así como la implantación de arbustos forrajeros exóticos. La utilización de nuevos recursos forrajeros evaluados y/o mejorados en los sistemas de producción de áreas desfavorecidas, permitirá mejorar e incrementar la productividad sustentable de las mismas. El presente proyecto plantea el objetivo general de generar conocimientos sobre adaptación, caracterización morfológica, productividad y calidad de germoplasma forrajero introducido en áreas ecológicamente desfavorecidas para incrementar la oferta forrajera, la producción y la estabilidad de los sistemas ganaderos. Se caracterizarán adecuadamente las especies en estudio (arbustos, subarbustos y herbáceas), de las familias Chenopodáceas y Fabáceas a través de la fenotipización de caracteres específicos de las especies promisorias. Se evaluará la persistencia, el crecimiento, la producción y la calidad de las accesiones adaptadas a las diversas condiciones ambientales (tres sitios de estudio). Además, el proyecto se vinculará con las redes de evaluación de gramíneas megatérmicas (INTA) con metodología estandarizada, estableciendo nexos entre proyectos similares con la institución relacionada y evaluará la calidad de genotipos mejorados de gramíneas megatérmicas con la institución relacionada (INTA). Este proyecto generará conocimientos que permitirán incrementar la oferta forrajera, la producción y la estabilidad de los sistemas ganaderos de dichas áreas. Esto permitirá paliar las necesidades de los productores de las áreas desfavorecidas y por ende su calidad de vida.