Integrated application of geochemical and geophysical methods for hydrogeological impact assessment for tunneling in fractured rock

The interaction of tunneling with groundwater is a problem both from an environmental and an engineering point of view. In fact, tunnel drilling may cause a drawdown of piezometric levels and water inflows into tunnels that may cause problems during excavation of the tunnel. While the influence of tunneling on the regional groundwater systems may be adequately predicted in porous media using analytical solutions, such an approach is difficult to apply in fractured rocks. Numerical solutions are preferable and various conceptual approaches have been proposed to describe and model groundwater flow through fractured rock masses, ranging from equivalent continuum models to discrete fracture network simulation models. However, their application needs many preliminary investigations on the behavior of the groundwater system based on hydrochemical and structural data. To study large scale flow systems in fractured rocks of mountainous terrains, a comprehensive study was conducted in southern Switzerland, using as case studies two infrastructures actually under construction: (i) the Monte Ceneri base railway tunnel (Ticino), and the (ii) San Fedele highway tunnel (Roveredo, Graubiinden). The chosen approach in this study combines the temporal and spatial variation of geochemical and geophysical measurements. About 60 localities from both surface and underlying tunnels were temporarily and spatially monitored during more than one year. At first, the project was focused on the collection of hydrochemical and structural data. A number of springs, selected in the area surrounding the infrastructures, were monitored for discharge, electric conductivity, pH, and temperature. Water samples (springs, tunnel inflows and rains) were taken for isotopic analysis; in particular the stable isotope composition (δ2Η, δ180 values) can reflect the origin of the water, because of spatial (recharge altitude, topography, etc.) and temporal (seasonal) effects on precipitation which in turn strongly influence the isotopic composition of groundwater. Tunnel inflows in the accessible parts of the tunnels were also sampled and, if possible, monitored with time. Noble-gas concentrations and their isotope ratios were used in selected locations to better understand the origin and the circulation of the groundwater. In addition, electrical resistivity and VLF-type electromagnetic surveys were performed to identify water bearing fractures and/or weathered areas that could be intersected at depth during tunnel construction. The main goal of this work was to demonstrate that these hydrogeological data and geophysical methods, combined with structural and hydrogeological information, can be successfully used in order to develop hydrogeological conceptual models of the groundwater flow in regions to be exploited for tunnels. The main results of the project are: (i) to have successfully tested the application of electrical resistivity and VLF-electromagnetic surveys to asses water-bearing zones during tunnel drilling; (ii) to have verified the usefulness of noble gas, major ion and stable isotope compositions as proxies for the detection of faults and to understand the origin of the groundwater and its flow regimes (direct rain water infiltration or groundwater of long residence time); and (iii) to have convincingly tested the combined application of a geochemical and geophysical approach to assess and predict the vulnerability of springs to tunnel drilling. - L'interférence entre eaux souterraines et des tunnels pose des problèmes environnementaux et de génie civile. En fait, la construction d'un tunnel peut faire abaisser le niveau des nappes piézométriques et faire infiltrer de l'eau dans le tunnel et ainsi créer des problème pendant l'excavation. Alors que l'influence de la construction d'un tunnel sur la circulation régionale de l'eau souterraine dans des milieux poreux peut être prédite relativement facilement par des solution analytiques de modèles, ceci devient difficile dans des milieux fissurés. Dans ce cas-là, des solutions numériques sont préférables et plusieurs approches conceptuelles ont été proposées pour décrire et modéliser la circulation d'eau souterraine à travers les roches fissurées, en allant de modèles d'équivalence continue à des modèles de simulation de réseaux de fissures discrètes. Par contre, leur application demande des investigations importantes concernant le comportement du système d'eau souterraine basées sur des données hydrochimiques et structurales. Dans le but d'étudier des grands systèmes de circulation d'eau souterraine dans une région de montagnes, une étude complète a été fait en Suisse italienne, basée sur deux grandes infrastructures actuellement en construction: (i) Le tunnel ferroviaire de base du Monte Ceneri (Tessin) et (ii) le tunnel routière de San Fedele (Roveredo, Grisons). L'approche choisie dans cette étude est la combinaison de variations temporelles et spatiales des mesures géochimiques et géophysiques. Environs 60 localités situées à la surface ainsi que dans les tunnels soujacents ont été suiviès du point de vue temporel et spatial pendant plus de un an. Dans un premier temps le projet se focalisait sur la collecte de données hydrochimiques et structurales. Un certain nombre de sources, sélectionnées dans les environs des infrastructures étudiées ont été suivies pour le débit, la conductivité électrique, le pH et la température. De l'eau (sources, infiltration d'eau de tunnel et pluie) a été échantillonnés pour des analyses isotopiques; ce sont surtout les isotopes stables (δ2Η, δ180) qui peuvent indiquer l'origine d'une eaux, à cause de la dépendance d'effets spatiaux (altitude de recharge, topographie etc.) ainsi que temporels (saisonaux) sur les précipitations météoriques , qui de suite influencent ainsi la composition isotopique de l'eau souterraine. Les infiltrations d'eau dans les tunnels dans les parties accessibles ont également été échantillonnées et si possible suivies au cours du temps. La concentration de gaz nobles et leurs rapports isotopiques ont également été utilisées pour quelques localités pour mieux comprendre l'origine et la circulation de l'eau souterraine. En plus, des campagnes de mesures de la résistivité électrique et électromagnétique de type VLF ont été menées afin d'identifier des zone de fractures ou d'altération qui pourraient interférer avec les tunnels en profondeur pendant la construction. Le but principal de cette étude était de démontrer que ces données hydrogéologiques et géophysiques peuvent être utilisées avec succès pour développer des modèles hydrogéologiques conceptionels de tunnels. Les résultats principaux de ce travail sont : i) d'avoir testé avec succès l'application de méthodes de la tomographie électrique et des campagnes de mesures électromagnétiques de type VLF afin de trouver des zones riches en eau pendant l'excavation d'un tunnel ; ii) d'avoir prouvé l'utilité des gaz nobles, des analyses ioniques et d'isotopes stables pour déterminer l'origine de l'eau infiltrée (de la pluie par le haut ou ascendant de l'eau remontant des profondeurs) et leur flux et pour déterminer la position de failles ; et iii) d'avoir testé d'une manière convainquant l'application combinée de méthodes géochimiques et géophysiques pour juger et prédire la vulnérabilité de sources lors de la construction de tunnels. - L'interazione dei tunnel con il circuito idrico sotterraneo costituisce un problema sia dal punto di vista ambientale che ingegneristico. Lo scavo di un tunnel puô infatti causare abbassamenti dei livelli piezometrici, inoltre le venute d'acqua in galleria sono un notevole problema sia in fase costruttiva che di esercizio. Nel caso di acquiferi in materiale sciolto, l'influenza dello scavo di un tunnel sul circuito idrico sotterraneo, in genere, puô essere adeguatamente predetta attraverso l'applicazione di soluzioni analitiche; al contrario un approccio di questo tipo appare inadeguato nel caso di scavo in roccia. Per gli ammassi rocciosi fratturati sono piuttosto preferibili soluzioni numeriche e, a tal proposito, sono stati proposti diversi approcci concettuali; nella fattispecie l'ammasso roccioso puô essere modellato come un mezzo discreto ο continuo équivalente. Tuttavia, una corretta applicazione di qualsiasi modello numerico richiede necessariamente indagini preliminari sul comportamento del sistema idrico sotterraneo basate su dati idrogeochimici e geologico strutturali. Per approfondire il tema dell'idrogeologia in ammassi rocciosi fratturati tipici di ambienti montani, è stato condotto uno studio multidisciplinare nel sud della Svizzera sfruttando come casi studio due infrastrutture attualmente in costruzione: (i) il tunnel di base del Monte Ceneri (canton Ticino) e (ii) il tunnel autostradale di San Fedele (Roveredo, canton Grigioni). L'approccio di studio scelto ha cercato di integrare misure idrogeochimiche sulla qualité e quantité delle acque e indagini geofisiche. Nella fattispecie sono state campionate le acque in circa 60 punti spazialmente distribuiti sia in superficie che in sotterraneo; laddove possibile il monitoraggio si è temporalmente prolungato per più di un anno. In una prima fase, il progetto di ricerca si è concentrato sull'acquisizione dati. Diverse sorgenti, selezionate nelle aree di possibile influenza attorno allé infrastrutture esaminate, sono state monitorate per quel che concerne i parametri fisico-chimici: portata, conduttività elettrica, pH e temperatura. Campioni d'acqua sono stati prelevati mensilmente su sorgenti, venute d'acqua e precipitazioni, per analisi isotopiche; nella fattispecie, la composizione in isotopi stabili (δ2Η, δ180) tende a riflettere l'origine delle acque, in quanto, variazioni sia spaziali (altitudine di ricarica, topografia, etc.) che temporali (variazioni stagionali) della composizione isotopica delle precipitazioni influenzano anche le acque sotterranee. Laddove possibile, sono state campionate le venute d'acqua in galleria sia puntualmente che al variare del tempo. Le concentrazioni dei gas nobili disciolti nell'acqua e i loro rapporti isotopici sono stati altresi utilizzati in alcuni casi specifici per meglio spiegare l'origine delle acque e le tipologie di circuiti idrici sotterranei. Inoltre, diverse indagini geofisiche di resistività elettrica ed elettromagnetiche a bassissima frequenza (VLF) sono state condotte al fine di individuare le acque sotterranee circolanti attraverso fratture dell'ammasso roccioso. Principale obiettivo di questo lavoro è stato dimostrare come misure idrogeochimiche ed indagini geofisiche possano essere integrate alio scopo di sviluppare opportuni modelli idrogeologici concettuali utili per lo scavo di opere sotterranee. I principali risultati ottenuti al termine di questa ricerca sono stati: (i) aver testato con successo indagini geofisiche (ERT e VLF-EM) per l'individuazione di acque sotterranee circolanti attraverso fratture dell'ammasso roccioso e che possano essere causa di venute d'acqua in galleria durante lo scavo di tunnel; (ii) aver provato l'utilità di analisi su gas nobili, ioni maggiori e isotopi stabili per l'individuazione di faglie e per comprendere l'origine delle acque sotterranee (acque di recente infiltrazione ο provenienti da circolazioni profonde); (iii) aver testato in maniera convincente l'integrazione delle indagini geofisiche e di misure geochimiche per la valutazione della vulnérabilité delle sorgenti durante lo scavo di nuovi tunnel. - "La NLFA (Nouvelle Ligne Ferroviaire à travers les Alpes) axe du Saint-Gothard est le plus important projet de construction de Suisse. En bâtissant la nouvelle ligne du Saint-Gothard, la Suisse réalise un des plus grands projets de protection de l'environnement d'Europe". Cette phrase, qu'on lit comme présentation du projet Alptransit est particulièrement éloquente pour expliquer l'utilité des nouvelles lignes ferroviaires transeuropéens pour le développement durable. Toutefois, comme toutes grandes infrastructures, la construction de nouveaux tunnels ont des impacts inévitables sur l'environnement. En particulier, le possible drainage des eaux souterraines réalisées par le tunnel peut provoquer un abaissement du niveau des nappes piézométriques. De plus, l'écoulement de l'eau à l'intérieur du tunnel, conduit souvent à des problèmes d'ingénierie. Par exemple, d'importantes infiltrations d'eau dans le tunnel peuvent compliquer les phases d'excavation, provoquant un retard dans l'avancement et dans le pire des cas, peuvent mettre en danger la sécurité des travailleurs. Enfin, l'infiltration d'eau peut être un gros problème pendant le fonctionnement du tunnel. Du point de vue de la science, avoir accès à des infrastructures souterraines représente une occasion unique d'obtenir des informations géologiques en profondeur et pour échantillonner des eaux autrement inaccessibles. Dans ce travail, nous avons utilisé une approche pluridisciplinaire qui intègre des mesures d'étude hydrogéochimiques effectués sur les eaux de surface et des investigations géophysiques indirects, tels que la tomographic de résistivité électrique (TRE) et les mesures électromagnétiques de type VLF. L'étude complète a été fait en Suisse italienne, basée sur deux grandes infrastructures actuellement en construction, qui sont le tunnel ferroviaire de base du Monte Ceneri, une partie du susmentionné projet Alptransit, situé entièrement dans le canton Tessin, et le tunnel routière de San Fedele, situé a Roveredo dans le canton des Grisons. Le principal objectif était de montrer comment il était possible d'intégrer les deux approches, géophysiques et géochimiques, afin de répondre à la question de ce que pourraient être les effets possibles dû au drainage causés par les travaux souterrains. L'accès aux galeries ci-dessus a permis une validation adéquate des enquêtes menées confirmant, dans chaque cas, les hypothèses proposées. A cette fin, nous avons fait environ 50 profils géophysiques (28 imageries électrique bidimensionnels et 23 électromagnétiques) dans les zones de possible influence par le tunnel, dans le but d'identifier les fractures et les discontinuités dans lesquelles l'eau souterraine peut circuler. De plus, des eaux ont été échantillonnés dans 60 localités situées la surface ainsi que dans les tunnels subjacents, le suivi mensuelle a duré plus d'un an. Nous avons mesurés tous les principaux paramètres physiques et chimiques: débit, conductivité électrique, pH et température. De plus, des échantillons d'eaux ont été prélevés pour l'analyse mensuelle des isotopes stables de l'hydrogène et de l'oxygène (δ2Η, δ180). Avec ces analyses, ainsi que par la mesure des concentrations des gaz rares dissous dans les eaux et de leurs rapports isotopiques que nous avons effectués dans certains cas spécifiques, il était possible d'expliquer l'origine des différents eaux souterraines, les divers modes de recharge des nappes souterraines, la présence de possible phénomènes de mélange et, en général, de mieux expliquer les circulations d'eaux dans le sous-sol. Le travail, même en constituant qu'une réponse partielle à une question très complexe, a permis d'atteindre certains importants objectifs. D'abord, nous avons testé avec succès l'applicabilité des méthodes géophysiques indirectes (TRE et électromagnétiques de type VLF) pour prédire la présence d'eaux souterraines dans le sous-sol des massifs rocheux. De plus, nous avons démontré l'utilité de l'analyse des gaz rares, des isotopes stables et de l'analyses des ions majeurs pour la détection de failles et pour comprendre l'origine des eaux souterraines (eau de pluie par le haut ou eau remontant des profondeurs). En conclusion, avec cette recherche, on a montré que l'intégration des ces informations (géophysiques et géochimiques) permet le développement de modèles conceptuels appropriés, qui permettant d'expliquer comment l'eau souterraine circule. Ces modèles permettent de prévoir les infiltrations d'eau dans les tunnels et de prédire la vulnérabilité de sources et des autres ressources en eau lors de construction de tunnels.

The VAD connection : connecting ventricular assist devices to the aorta in silico

Les systèmes d'assistance ventriculaire sont apparus durant la dernière décade comme une approche thérapeutique efficace du traitement de l'insuffisance cardiaque terminale, en particulier dans le contexte de manque de donneurs d'organes. Néanmoins, et ceci malgré les progrès techniques majeurs, les taux de complications restent élevés et sont en partie liés à la configuration géométrique, en particulier le site d'implantation de la cannule de sortie à l'aorte thoracique. Bien que l'anastomose à l'aorte descendante permette une chirurgie moins invasive, les bénéfices de cette technique sont toujours controversés, comparée à la méthode standard de l'aorte ascendante, en raison du risque thrombo-embolique possiblement augmenté et des modifications hémodynamiques induites au niveau de l'arc aortique. Dans ce travail, nous comparons in silico en terme de débit et pression les deux possibilités anastomotiques. Nous développons un réseau de modèles mathématiques unidimensionnels, et l'appliquons à diverses situations cliniques, pour différents stades d'insuffisance cardiaque et de vitesses de rotation de la machine. Les données initiales sont obtenues grâce à un modèle OD (c'est-à-dire qui dépend uniquement du temps mais pas de l'espace) du système cardiovasculaire comprenant une assistance circulatoire, validé avec des données cliniques. Les simulations réalisées montrent que les deux méthodes sont similaires, en terme de débit et courbes de pression, ceci pour tous les cas cliniques étudiés. Ces résultats numériques soutiennent la possibilité d'utiliser la technique d'anastomose à l'aorte thoracique descendante, permettant une chirurgie moins invasive. Sur un plan plus fondamental, le système cardiovasculaire peut être simulé par le biais de multiples modèles de niveau de complexité différents, au prix d'un coût computationnel toujours plus élevé. Nous évaluons les avantages de modèles géométriques à plusieurs échelles (uni- et tridimensionnelle) avec données provenant de patients, comparés à des modèles simplifiés. Les résultats montrent que ces modèles de dimensions hétérogènes apportent un bénéfice important en terme de ressources de calcul, tout en conservant une précision acceptable. En conclusion, ces résultats encourageant montrent la relevance des études numériques dans le domaine médical, tant sur le plan fondamental et la compréhension des mécanismes physiopathologiques, que sur le plan applicatif et le développement de nouvelles thérapeutiques.

Modélisation hydrologique des précipitations et des crues extrêmes dans les bassins versants alpin

Les crues et les risques de débordement des barrages, notamment des digues en terre, en cas de fortes précipitations, préoccupent depuis longtemps les autorités et la population. Les études réalisées dans les dernières années ont montré que le réchauffement global du climat s'est accompagné d'une augmentation de la fréquence des fortes précipitations et des crues en Suisse et dans de nombreuses régions du globe durant le 20ème siècle. Les modèles climatiques globaux et régionaux prévoient que la fréquence des fortes précipitations devrait continuer à croître durant le 21éme siècle en Suisse et dans le monde. Cela rend les recherches actuelles sur la modélisation des pluies et des crues à une échelle fine encore plus importantes. En Suisse, pour assurer une bonne protection sur le plan humain et économique, des cartes de précipitations maximales probables (PMP) ont été réalisées. Les PMP ont été confrontées avec les précipitations extrêmes mesurées dans les différentes régions du pays. Ces PMP sont ensuite utilisées par les modèles hydrologiques pour calculer des crues maximales probables (PMF). Cette la méthode PMP-PMF nécessite toutefois un certain nombre de précautions. Si elle est appliquée d'une manière incorrecte ou sur la base de données insuffisantes, elle peut entraîner une surestimation des débits de crue, notamment pour les grands bassins et pour les régions montagneuses entraînant des surcoûts importants. Ces problèmes résultent notamment du fait que la plupart des modèles hydrologiques répartissent les précipitations extrêmes (PMP) de manière uniforme dans le temps sur l'ensemble du bassin versant. Pour remédier ce problème, cette thèse a comme objectif principal de développer un modèle hydrologique distribué appelé MPF (Modeling Precipitation Flood) capable d'estimer la PMF de manière réaliste à partir de la PMP distribuée de manière spatio-temporelle à l'aide des nuages. Le modèle développé MPF comprend trois parties importantes. Dans la première partie, les précipitations extrêmes calculées par un modèle météorologique à une méso-échelle avec une résolution horizontale de 2 km, sont réparties à une échelle locale (25 ou 50 m) de manière non-uniforme dans l'espace et dans le temps. La deuxième partie concerne la modélisation de l'écoulement de l'eau en surface et en subsurface en incluant l'infiltration et l'exfiltration. Et la troisième partie inclut la modélisation de la fonte des neiges, basée sur un calcul de transfert de chaleur. Le modèle MPF a été calibré sur des bassins versants alpins où les données de précipitations et du débit sont disponibles pour une période considérablement longue, qui inclut plusieurs épisodes de fortes pluies avec des débits élevés. À partir de ces épisodes, les paramètres d'entrée du modèle tel que la rugosité du sol et la largeur moyenne des cours d'eau dans le cas d'écoulement de surface ont pu être estimés. Suivant la même procédure, les paramètres utilisés dans la simulation des écoulements en subsurface sont également estimés indirectement, puisque des mesures directes de l'écoulement en subsurface et de l'exfiltration sont difficiles à obtenir. Le modèle de distribution spatio-temporelle de la pluie a aussi été validé en utilisant les images radar avec la structure de la pluie provoquée par un nuage supercellulaire. Les hyétogrammes obtenus sur plusieurs points du terrain sont très proches de ceux enregistrées avec les images radar. Les résultats de la validation du modèle sur les épisodes de fortes crues présentent une bonne synchronisation entre le débit simulé et le débit observé. Cette corrélation a été mesurée avec trois critères d'efficacité, qui ont tous donné des valeurs satisfaisantes. Cela montre que le modèle développé est valide et il peut être utilisé pour des épisodes extrêmes tels que la PMP. Des simulations ont été faites sur plusieurs bassins ayant comme données d'entrée la pluie de type PMP. Des conditions variées ont été utilisées, comme la situation du sol saturé, ou non-saturé, ou la présence d'une couche de neige sur le terrain au moment de la PMP, ce qui conduit à une estimation de PMF pour des scénarios catastrophiques. Enfin, les résultats obtenus montrent comment mieux estimer la valeur de la crue de sécurité des barrages, à partir d'une pluie extrême dix-millennale avec une période de retour de 10'000 ans.

Lentiviral vector-mediated gene transfer in adult mouse photoreceptors is impaired by the presence of a physical barrier

RESUME L'utilisation de la thérapie génique dans l'approche d'un traitement des maladies oculaires dégénératives, plus particulièrement de la rétinite pigmentaire, semble être très prometteuse (Acland et al. 2001). Parmi les vecteurs développés, les vecteurs lentiviraux (dérivé du virus humain HIV-1), permettent la transduction des photorécepteurs après injection sous-rétinienne chez la souris durant les premiers jours de vie. Cependant l'efficacité du transfert de gène est nettement plus limitée dans ce type cellulaire après injection chez l'adulte (Kostic et al. 2003). L'objet de notre étude est de déterminer si la présence d'une barrière physique produite au cours du développement, située entre les photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire ainsi qu'entre les photorécepteurs eux-mêmes, est responsable de: la diminution de l'entrée en masse du virus dans les photorécepteurs, minimisant ainsi son efficacité chez la souris adulte. De précédentes recherches, chez le lapin, ont décrit la capacité d'enzymes spécifiques comme la Chondroïtinase ABC et la Neuraminidase X de modifier la structure de la matrice entourant les photorécepteurs (Inter Photoreceptor Matrix, IPM) par digestion de certains de ses constituants suite à leur injection dans l'espace sous-rétinien (Yao et al. 1990). Considérant l'IPM comme une barrière physique, capable de réduire l'efficacité de transduction des photorécepteurs chez la souris adulte, nous avons associé différentes enzymes simultanément à l'injection sous-rétinienne de vecteurs lentiviraux afin d'améliorer la transduction virale en fragilisant I'IPM, la rendant ainsi plus perméable à la diffusion du virus. L'injection sous-rétinienne de Neuraminidase X et de Chondroïtinase ABC chez la souris induit des modifications structurales de l'IPM qui se manifestent respectivement par la révélation ou la disparition de sites de liaison de la peanut agglutinin sur les photorécepteurs. L'injection simultanée de Neuraminidase X avec le vecteur viral contenant le transgène thérapeutique augmente significativement le nombre de photorécepteurs transduits (environ cinq fois). Nous avons en fait démontré que le traitement enzymatique augmente principalement la diffusion du lentivirus dans l'espace situé entre l'épithélium pigmentaire et les photorécepteurs. Le traitement à la Chondroïtinase ABC n'entraîne quant à elle qu'une légère amélioration non significative de la transduction. Cette étude montre qu'une meilleure connaissance de l'IPM ainsi que des substances capables de la modifier (enzymes, drogues etc.) pourrait aider à élaborer de nouvelles stratégies afin d'améliorer la distribution de vecteurs viraux dans la rétine adulte.

Computational and statistical analysis of copy number variants in normal and cancer genomes

AbstractAlthough the genomes from any two human individuals are more than 99.99% identical at the sequence level, some structural variation can be observed. Differences between genomes include single nucleotide polymorphism (SNP), inversion and copy number changes (gain or loss of DNA). The latter can range from submicroscopic events (CNVs, at least 1kb in size) to complete chromosomal aneuploidies. Small copy number variations have often no (lethal) consequences to the cell, but a few were associated to disease susceptibility and phenotypic variations. Larger re-arrangements (i.e. complete chromosome gain) are frequently associated with more severe consequences on health such as genomic disorders and cancer. High-throughput technologies like DNA microarrays enable the detection of CNVs in a genome-wide fashion. Since the initial catalogue of CNVs in the human genome in 2006, there has been tremendous interest in CNVs both in the context of population and medical genetics. Understanding CNV patterns within and between human populations is essential to elucidate their possible contribution to disease. But genome analysis is a challenging task; the technology evolves rapidly creating needs for novel, efficient and robust analytical tools which need to be compared with existing ones. Also, while the link between CNV and disease has been established, the relative CNV contribution is not fully understood and the predisposition to disease from CNVs of the general population has not been yet investigated.During my PhD thesis, I worked on several aspects related to CNVs. As l will report in chapter 3, ! was interested in computational methods to detect CNVs from the general population. I had access to the CoLaus dataset, a population-based study with more than 6,000 participants from the Lausanne area. All these individuals were analysed on SNP arrays and extensive clinical information were available. My work explored existing CNV detection methods and I developed a variety of metrics to compare their performance. Since these methods were not producing entirely satisfactory results, I implemented my own method which outperformed two existing methods. I also devised strategies to combine CNVs from different individuals into CNV regions.I was also interested in the clinical impact of CNVs in common disease (chapter 4). Through an international collaboration led by the Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) and the Imperial College London I was involved as a main data analyst in the investigation of a rare deletion at chromosome 16p11 detected in obese patients. Specifically, we compared 8,456 obese patients and 11,856 individuals from the general population and we found that the deletion was accounting for 0.7% of the morbid obesity cases and was absent in healthy non- obese controls. This highlights the importance of rare variants with strong impact and provides new insights in the design of clinical studies to identify the missing heritability in common disease.Furthermore, I was interested in the detection of somatic copy number alterations (SCNA) and their consequences in cancer (chapter 5). This project was a collaboration initiated by the Ludwig Institute for Cancer Research and involved other groups from the Swiss Institute of Bioinformatics, the CHUV and Universities of Lausanne and Geneva. The focus of my work was to identify genes with altered expression levels within somatic copy number alterations (SCNA) in seven metastatic melanoma ceil lines, using CGH and SNP arrays, RNA-seq, and karyotyping. Very few SCNA genes were shared by even two melanoma samples making it difficult to draw any conclusions at the individual gene level. To overcome this limitation, I used a network-guided analysis to determine whether any pathways, defined by amplified or deleted genes, were common among the samples. Six of the melanoma samples were potentially altered in four pathways and five samples harboured copy-number and expression changes in components of six pathways. In total, this approach identified 28 pathways. Validation with two external, large melanoma datasets confirmed all but three of the detected pathways and demonstrated the utility of network-guided approaches for both large and small datasets analysis.RésuméBien que le génome de deux individus soit similaire à plus de 99.99%, des différences de structure peuvent être observées. Ces différences incluent les polymorphismes simples de nucléotides, les inversions et les changements en nombre de copies (gain ou perte d'ADN). Ces derniers varient de petits événements dits sous-microscopiques (moins de 1kb en taille), appelés CNVs (copy number variants) jusqu'à des événements plus large pouvant affecter des chromosomes entiers. Les petites variations sont généralement sans conséquence pour la cellule, toutefois certaines ont été impliquées dans la prédisposition à certaines maladies, et à des variations phénotypiques dans la population générale. Les réarrangements plus grands (par exemple, une copie additionnelle d'un chromosome appelée communément trisomie) ont des répercutions plus grave pour la santé, comme par exemple dans certains syndromes génomiques et dans le cancer. Les technologies à haut-débit telle les puces à ADN permettent la détection de CNVs à l'échelle du génome humain. La cartographie en 2006 des CNV du génome humain, a suscité un fort intérêt en génétique des populations et en génétique médicale. La détection de différences au sein et entre plusieurs populations est un élément clef pour élucider la contribution possible des CNVs dans les maladies. Toutefois l'analyse du génome reste une tâche difficile, la technologie évolue très rapidement créant de nouveaux besoins pour le développement d'outils, l'amélioration des précédents, et la comparaison des différentes méthodes. De plus, si le lien entre CNV et maladie a été établit, leur contribution précise n'est pas encore comprise. De même que les études sur la prédisposition aux maladies par des CNVs détectés dans la population générale n'ont pas encore été réalisées.Pendant mon doctorat, je me suis concentré sur trois axes principaux ayant attrait aux CNV. Dans le chapitre 3, je détaille mes travaux sur les méthodes d'analyses des puces à ADN. J'ai eu accès aux données du projet CoLaus, une étude de la population de Lausanne. Dans cette étude, le génome de plus de 6000 individus a été analysé avec des puces SNP et de nombreuses informations cliniques ont été récoltées. Pendant mes travaux, j'ai utilisé et comparé plusieurs méthodes de détection des CNVs. Les résultats n'étant pas complètement satisfaisant, j'ai implémenté ma propre méthode qui donne de meilleures performances que deux des trois autres méthodes utilisées. Je me suis aussi intéressé aux stratégies pour combiner les CNVs de différents individus en régions.Je me suis aussi intéressé à l'impact clinique des CNVs dans le cas des maladies génétiques communes (chapitre 4). Ce projet fut possible grâce à une étroite collaboration avec le Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) et l'Impérial College à Londres. Dans ce projet, j'ai été l'un des analystes principaux et j'ai travaillé sur l'impact clinique d'une délétion rare du chromosome 16p11 présente chez des patients atteints d'obésité. Dans cette collaboration multidisciplinaire, nous avons comparés 8'456 patients atteint d'obésité et 11 '856 individus de la population générale. Nous avons trouvés que la délétion était impliquée dans 0.7% des cas d'obésité morbide et était absente chez les contrôles sains (non-atteint d'obésité). Notre étude illustre l'importance des CNVs rares qui peuvent avoir un impact clinique très important. De plus, ceci permet d'envisager une alternative aux études d'associations pour améliorer notre compréhension de l'étiologie des maladies génétiques communes.Egalement, j'ai travaillé sur la détection d'altérations somatiques en nombres de copies (SCNA) et de leurs conséquences pour le cancer (chapitre 5). Ce projet fut une collaboration initiée par l'Institut Ludwig de Recherche contre le Cancer et impliquant l'Institut Suisse de Bioinformatique, le CHUV et les Universités de Lausanne et Genève. Je me suis concentré sur l'identification de gènes affectés par des SCNAs et avec une sur- ou sous-expression dans des lignées cellulaires dérivées de mélanomes métastatiques. Les données utilisées ont été générées par des puces ADN (CGH et SNP) et du séquençage à haut débit du transcriptome. Mes recherches ont montrées que peu de gènes sont récurrents entre les mélanomes, ce qui rend difficile l'interprétation des résultats. Pour contourner ces limitations, j'ai utilisé une analyse de réseaux pour définir si des réseaux de signalisations enrichis en gènes amplifiés ou perdus, étaient communs aux différents échantillons. En fait, parmi les 28 réseaux détectés, quatre réseaux sont potentiellement dérégulés chez six mélanomes, et six réseaux supplémentaires sont affectés chez cinq mélanomes. La validation de ces résultats avec deux larges jeux de données publiques, a confirmée tous ces réseaux sauf trois. Ceci démontre l'utilité de cette approche pour l'analyse de petits et de larges jeux de données.Résumé grand publicL'avènement de la biologie moléculaire, en particulier ces dix dernières années, a révolutionné la recherche en génétique médicale. Grâce à la disponibilité du génome humain de référence dès 2001, de nouvelles technologies telles que les puces à ADN sont apparues et ont permis d'étudier le génome dans son ensemble avec une résolution dite sous-microscopique jusque-là impossible par les techniques traditionnelles de cytogénétique. Un des exemples les plus importants est l'étude des variations structurales du génome, en particulier l'étude du nombre de copies des gènes. Il était établi dès 1959 avec l'identification de la trisomie 21 par le professeur Jérôme Lejeune que le gain d'un chromosome supplémentaire était à l'origine de syndrome génétique avec des répercussions graves pour la santé du patient. Ces observations ont également été réalisées en oncologie sur les cellules cancéreuses qui accumulent fréquemment des aberrations en nombre de copies (telles que la perte ou le gain d'un ou plusieurs chromosomes). Dès 2004, plusieurs groupes de recherches ont répertorié des changements en nombre de copies dans des individus provenant de la population générale (c'est-à-dire sans symptômes cliniques visibles). En 2006, le Dr. Richard Redon a établi la première carte de variation en nombre de copies dans la population générale. Ces découvertes ont démontrées que les variations dans le génome était fréquentes et que la plupart d'entre elles étaient bénignes, c'est-à-dire sans conséquence clinique pour la santé de l'individu. Ceci a suscité un très grand intérêt pour comprendre les variations naturelles entre individus mais aussi pour mieux appréhender la prédisposition génétique à certaines maladies.Lors de ma thèse, j'ai développé de nouveaux outils informatiques pour l'analyse de puces à ADN dans le but de cartographier ces variations à l'échelle génomique. J'ai utilisé ces outils pour établir les variations dans la population suisse et je me suis consacré par la suite à l'étude de facteurs pouvant expliquer la prédisposition aux maladies telles que l'obésité. Cette étude en collaboration avec le Centre Hospitalier Universitaire Vaudois a permis l'identification d'une délétion sur le chromosome 16 expliquant 0.7% des cas d'obésité morbide. Cette étude a plusieurs répercussions. Tout d'abord elle permet d'effectuer le diagnostique chez les enfants à naître afin de déterminer leur prédisposition à l'obésité. Ensuite ce locus implique une vingtaine de gènes. Ceci permet de formuler de nouvelles hypothèses de travail et d'orienter la recherche afin d'améliorer notre compréhension de la maladie et l'espoir de découvrir un nouveau traitement Enfin notre étude fournit une alternative aux études d'association génétique qui n'ont eu jusqu'à présent qu'un succès mitigé.Dans la dernière partie de ma thèse, je me suis intéressé à l'analyse des aberrations en nombre de copies dans le cancer. Mon choix s'est porté sur l'étude de mélanomes, impliqués dans le cancer de la peau. Le mélanome est une tumeur très agressive, elle est responsable de 80% des décès des cancers de la peau et est souvent résistante aux traitements utilisés en oncologie (chimiothérapie, radiothérapie). Dans le cadre d'une collaboration entre l'Institut Ludwig de Recherche contre le Cancer, l'Institut Suisse de Bioinformatique, le CHUV et les universités de Lausanne et Genève, nous avons séquencés l'exome (les gènes) et le transcriptome (l'expression des gènes) de sept mélanomes métastatiques, effectués des analyses du nombre de copies par des puces à ADN et des caryotypes. Mes travaux ont permis le développement de nouvelles méthodes d'analyses adaptées au cancer, d'établir la liste des réseaux de signalisation cellulaire affectés de façon récurrente chez le mélanome et d'identifier deux cibles thérapeutiques potentielles jusqu'alors ignorées dans les cancers de la peau.

Pharmacokinetic and pharmacodynamic assessment of valganciclovir in solid organ transplant recipients

RESUME : Valganciclovir (Valcyte®) is an orally administered ester prodrug of the standard anticytomegalovirus (CMV) drug ganciclovir. This drug enabled an important reduction of the burden of CMV morbidity and mortality in solid organ transplant recipients. Prevention of CMV infection and treatment of CMV disease requires drug administration during many weeks. Oral drug administration is therefore convenient. Valganciclovir has been developed to overcome the poor oral availability of ganciclovir, which limits its concentration exposure after oral administration and thus its efficacy. This prodrug crosses efficiently the intestinal barrier, is then hydrolyzed into ganciclovir, providing exposure similar to intravenous ganciclovir. Valganciclovir is now preferred for the prophylaxis and treatment of CMV infection in solid organ transplant recipients. Nevertheless, adequate dosage adjustment is necessary to optimize its use, avoiding either insufficient or exaggerate exposure related to differences in its pharmacokinetic profile between patients. The main goal of this thesis was to better describe the pharmacokinetic and pharmacodynamic profile of valganciclovir in solid organ transplant recipients, to assess their reproducibility and their predictability, and thus to evaluate the current recommendations for valganciclovir dosage adjustment and the potential contribution of routine therapeutic drug monitoring (TDM) to patients' management. A total of 437 ganciclovir plasma concentration data from 65 transplant patients (41 kidney, 12 lung, 10 heart and 2 liver recipients, 58 under oral valganciclovir prophylaxis, 8 under oral valganciclovir treatment and 2 under intravenous ganciclovir) were measured using a validated chromatographic method (HPLC) developed for this study. The results were analyzed by non-linear mixed effect modeling (NONMEM). A two-compartment model with first-order absorption appropriately described the data. Systemic clearance was markedly influenced by GFR, with further differences between graft types and sex (CL/GFR = 1.7 in kidney, 0.9 in heart and 1.2 in lung and liver recipients) with interpatient variability (CV%) of 26% and interoccasion variability of 12%. Body weight and sex influenced central volume of distribution (V1 = 0.34 l/kg in males and 0.27 l/kg in females) with an interpatient variability of 20%. Residual intrapatient variability was 21 %. No significant drug interaction influenced GCV disposition. VGC prophylactic efficacy and tolerability were good, without detectable dependence on GCV profile. In conclusion, this analysis highlights the importance of thorough adjustment of VGC dosage to renal function and body weight. Considering the good predictability and reproducibility of GCV profile after oral VGC in solid organ transplant recipients, routine TDM does not appear to be clinically indicated. However, GCV plasma measurement may still be helpful in specific clinical situations such as documentation of appropriate exposure in patients with potentially compromised absorption, or lack of response to CMV disease treatment, or under renal replacement therapy. RESUME : Le valganciclovir (Valcyte®) est un promédicament oral du ganciclovir qui est un anti-infectieux de référence contre les infections à cytomegalovirus (CMV). Cet antiviral a permis de réduire les effets délétères de cette infection jusqu'ici responsable d'une importante morbidité et mortalité chez les transplantés d'organe. La prévention et le traitement de l'infection à CMV sont donc nécessaires mais requièrent l'administration d'un agent antiviral sur une longue période. Un médicament administré par voie orale représente donc un avantage évident. Le valganciclovir a été développé dans le but d'améliorer la faible absorption orale du ganciclovir, et donc son efficacité. Cet ester valylique du ganciclovir traverse plus facilement la barrière gastro-intestinale, puis est hydrolysé en ganciclovir dans la circulation sanguine, produisant une exposition comparable à celle d'une perfusion intraveineuse de ganciclovir. De ce fait, le valganciclovir est devenu largement utilisé pour la prophylaxie mais aussi le traitement de l'infection à CMV. Néanmoins une utilisation optimale de ce nouveau médicament nécessite de bonnes connaissances sur son profil pharmacocinétique afin d'établir un schéma de dose adapté pour éviter tant une surexposition qu'une sous-exposition résultant des différences d'élimination entre les patients. Le but de cette thèse a été d'étudier le profil pharmacocinétique et pharmacodynamique du valganciclovir chez les transplantés d'organe ainsi que sa reproductibilité et sa prédictibilité. Il s'agissait d'apprécier de manière critique le schéma actuellement recommandé pour l'adaptation des doses de valganciclovir, mais aussi la contribution éventuelle d'un suivi des concentrations sanguines en routine. Un total de 437 taux sanguins de ganciclovir ont été mesurés, provenant de 65 patients transplantés d'organe (41 rénaux, 12 pulmonaires, 10 cardiaques et 2 hépatiques, 58 sous une prophylaxie orale de valganciclovir, 8 sous un traitement de valganciclovir et 2 sous un traitement intraveineux). Une méthode de chromatographie liquide à haute performance a été développée et validée pour cette étude. Les résultats ont été ensuite analysés par modélisation non linéaire à effets mixtes (NONMEM). Un modèle à deux compartiments avec absorption de premier ordre a permis de décrire les données. La clairance systémique était principalement influencée par le débit de filtration glomérulaire (GFR), avec une différence entre les types de greffe et les sexes (CL/GFR = 1.7 chez les greffés rénaux, 0.9 pour les greffés cardiaques et 1.2 pour le groupe des greffés pulmonaires et hépatiques) avec un variabilité inter-individuelle de 26% (CV%) et une variabilité inter-occasion de 12%. Le poids corporel ainsi que le sexe avaient une influence sur le volume central de distribution (V1 = 0.34 l/kg chez les hommes et 0.27 l/kg chez les femmes) avec une variabilité inter-individuelle de 20%. La variabilité intra-individuelle résiduelle était de 21 %. Aucune interaction médicamenteuse n'a montré d'influence sur le profil du ganciclovir. La prophylaxie avec le valganciclovir s'est révélée efficace et bien tolérée. En conclusion, cette analyse souligne l'importance d'une adaptation de la dose du valganciclovir à la fonction rénale et au poids du patient. Au vu de la bonne reproductibilité et prédictibilité du profil pharmacocinétique du ganciclovir chez les patients transplantés recevant du valganciclovir, un suivi des concentrations sanguines en routine ne semble pas cliniquement indiqué. Néanmoins, la mesure des taux plasmatiques de ganciclovir peut être utile dans certaines situations particulières, comme la vérification d'une exposition appropriée chez des patients susceptibles d'absorption insuffisante, ou ne répondant pas au traitement d'une infection à CMV ou encore sous épuration extra-rénale. RESUME LARGE PUBLIC : Le valganciclovir est un précurseur capable de libérer du ganciclovir, récemment développé pour améliorer la faible absorption orale de ce dernier. Une fois le valganciclovir absorbé, le ganciclovir libéré dans la circulation sanguine devient efficace contre les infections à cytomégalovirus. Ce virus largement répandu est responsable de maladies insidieuses et parfois graves chez les personnes présentant une baisse des défenses immunitaires, comme les greffés d'organe recevant un traitement anti-rejet. Le ganciclovir est administré pendant plusieurs mois consécutifs soit pour prévenir une infection après la transplantation, soit pour traiter une infection déclarée. La facilité d'administration du valganciclovir par voie orale représente un avantage sur une administration du ganciclovir par perfusion, qui nécessite une hospitalisation. Toutefois, la voie orale peut être une source supplémentaire de variabilité chez les patients, avec un impact potentiel sur l'efficacité ou la toxicité du médicament. Le but de cette étude a été - de décrire le devenir de ce médicament dans le corps humain (dont l'étude relève de la discipline de la pharmacocinétique) - de définir les facteurs cliniques pouvant expliquer les différences de concentration sanguine observées entre les patients sous une posologie donnée - d'explorer les relations entre les concentrations du médicament dans le sang et son efficacité ou la survenue d'effets indésirables (dont l'étude relève de la discipline de la pharmacodynamie). Cette étude a nécessité le développement et la validation, d'une méthode d'analyse pour mesurer la concentration sanguine du ganciclovir, puis son application à 437 échantillons provenant de 65 patients transplantés d'organe solide (41 rénaux, 12 pulmonaires, 10 cardiaques et 2 hépatiques) recevant du valganciclovir. Les résultats des mesures effectuées ont été analysés à l'aide d'un outil mathématique afin d'élaborer un modèle du devenir du médicament dans le sang chez chaque patient et à chaque occasion. Cette étude a permis d'évaluer chez des patients recevant le valganciclovir, la vitesse à laquelle l'organisme absorbe, distribue, puis élimine le médicament. La vitesse d'élimination dépendait étroitement de la fonction rénale, du type de greffe et du sexe alors que la distribution dépendait du poids et du sexe du patient. La variabilité non expliquée par ces facteurs cliniques était modérée et vraisemblablement sans conséquence clinique évidente soit sur l'efficacité ou la tolérance, qui se révèlent très satisfaisantes chez les patients de l'étude. Les observations n'ont pas révélé de relation entre les concentrations de médicament et l'efficacité thérapeutique ou la survenue d'effets indésirables, confirmant que les doses relativement faibles utilisées dans notre collectif de patients suffisaient à produire une exposition reproductible à des concentrations adéquates. En conclusion, le profil (et par conséquent l'absorption) du valganciclovir chez les patients transplantés semble bien prédictible après une adaptation de la dose à la fonction rénale et au poids du patient. Un contrôle systématique des concentrations sanguines n'est probablement pas indiqué en routine, mais cette mesure peut présenter un intérêt dans certaines conditions particulières.

Insulin resistance in mice lacking neuronal nitric oxide synthase is related to an alpha-adrenergic mechanism

Rapport de synthèse : Le monoxyde d'azote (NO) joue un rôle important dans la régulation de l'homéostasie du système cardiovasculaire et du glucose. Les souris déficientes pour le gène codant l'isoforme neuronale de la synthase de monoxyde d'azote (nNOS) sont résistantes à l'insuline, mais les mécanismes sous-jacents sont inconnus. Le manque de NO produit par la nNOS pourrait être à l'origine d'une diminution de la perfusion du muscle squelettique et ainsi d'une diminution de l'apport de substrat. Alternativement, le déficit de nNOS normalement hautement exprimé dans le tissu musculaire squelettique pourrait directement y perturber la consommation de glucose. Finalement l'absence de l'action sympatholytique du NO neuronal pourrait diminuer la sensibilité à l'insuline. Afin de tester ces hypothèses nous avons étudié, chez des souris déficientes en nNOS et des souris-contrôle, la consommation corporelle totale de glucose et le flux musculaire squelettique pendant des clamps hyperinsulinémiques euglycémiques in vivo, ainsi que la consommation de glucose dans le muscle squelettique in vitro. De plus nous avons analysé les effets d'une inhibition alpha-adrénergique sur la consommation de glucose pendant les clamps hyperinsulinémiques euglycémiques in vivo. Le taux de perfusion de glucose pendant les clamps était grossièrement 15 pourcent plus bas (P<0.001) chez les souris déficientes en nNOS que chez les souris-contrôle. Cette résistance à l'insuline chez les souris déficientes en nNOS n'était due ni à une stimulation déficiente du flux sanguin musculaire par l'insuline ni à un défaut intrinsèque de la consommation de glucose du muscle (qui étaient comparables dans les deux groupes), mais à un mécanisme alpha-adrénergique, car l'administration de phentolamine rétablissait la sensibilité à l'insuline chez les souris déficientes en nNOS. Ces résultats suggèrent qu'une hyperactivité sympathique, potentiellement due à la perte de l'inhibition neuronale centrale du flux sympathique par le NO provenant de nNOS, contribue à la résistance à l'insuline des souris déficientes en nNOS. Par ailleurs ces résultats tendent à prouver qu'un défaut de production de NO provoquerait une résistance à l'insuline par des mécanismes différents selon l'isoforme de NO synthase déficiente (par exemple chez les souris déficientes pour la forme endothéliale de NO synthase, il a été montré que la résistance à l'insuline est due à un défaut de stimulation de la perfusion musculaire par l'insuline et à un défaut du signalling de l'insuline dans la cellule musculaire squelettique). Chez l'être humain il est établi que les états de résistance à l'insuline sont associés à une synthèse défectueuse et/ou une mauvaise biodisponibilité du NO, ainsi qu'à une hyperactivité sympathique. Nous spéculons que la perte d'inhibition centrale du flux sympathique représente un mécanisme contribuant à la résistance à l'insuline et ses complications cardiovasculaires chez l'être humain.

Persistent left superior vena cava in cardiac congenital surgery

La persistance d'une veine cave supérieure gauche (VCSG) est une entité relativement fréquente dans le cadre des malformations cardiaques congénitales. Le but de cette étude est d'analyser à quel moment le diagnostic de la persistance de la VCSG est effectué, à quel moment le diagnostic des éventuelles anomalies du sinus coronarien associées est effectué, et de l'impact global de la persistance d'une VCSG sur la mortalité et la morbidité des patients après chirurgie cardiaque pour une malformation cardiaque congénitale. Analyse rétrospective d'une cohorte d'enfants ayant subi une chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle pour une malformation cardiaque congénitale. Trois-cent septante et un patients ont été inclus dans l'étude avec un âge médian de 2.75 ans (IQR 0.65-6.63). Parmi eux, 47 patients présentaient une persistance de la VCSG (12.7%), et cette persistance de la VCSG a été identifiée par échocardiographie dans le cadre du bilan préopératoire chez 39 patients (83%). Trois patients (6.4%) présentant une persistance de la VCSG, ont développé après chirurgie cardiaque, une obstruction significative de la voie d'entrée du ventricule gauche qui a aboutit à un débit cardiaque anormal ou à une hypertension pulmonaire secondaire. Chez huit patients (17%), la persistance de la VCSG, était associée à un défaut partiel ou total de fermeture du sinus coronarien et dans deux cas (4%) à une atrésie de l'ostium du sinus coronarien. La durée de la ventilation mécanique était plus courte de façon significative dans le groupe contrôle (1.2 vs. 3.0 jours, p = 0.004), tandis que la durée de séjour aux soins intensifs ne différait pas. La mortalité était significativement moins élevée dans le groupe contrôle que dans le groupe de patient avec persistance de la VCSG (2.5 vs. 10.6 %, p = 0.004). Les résultats de cette étude montrent que la persistance de la VCSG en association avec une malformation cardiaque congénitale augmente le risque de mortalité chez les enfants qui subissent une chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle. La mise en évidence d'une persistance de la VCSG et des anomalies associées, s'impose pour éviter des complications pendant et après une chirurgie cardiaque.

EADock : design of a new molecular docking algorithm and some of its applications

3 Summary 3. 1 English The pharmaceutical industry has been facing several challenges during the last years, and the optimization of their drug discovery pipeline is believed to be the only viable solution. High-throughput techniques do participate actively to this optimization, especially when complemented by computational approaches aiming at rationalizing the enormous amount of information that they can produce. In siiico techniques, such as virtual screening or rational drug design, are now routinely used to guide drug discovery. Both heavily rely on the prediction of the molecular interaction (docking) occurring between drug-like molecules and a therapeutically relevant target. Several softwares are available to this end, but despite the very promising picture drawn in most benchmarks, they still hold several hidden weaknesses. As pointed out in several recent reviews, the docking problem is far from being solved, and there is now a need for methods able to identify binding modes with a high accuracy, which is essential to reliably compute the binding free energy of the ligand. This quantity is directly linked to its affinity and can be related to its biological activity. Accurate docking algorithms are thus critical for both the discovery and the rational optimization of new drugs. In this thesis, a new docking software aiming at this goal is presented, EADock. It uses a hybrid evolutionary algorithm with two fitness functions, in combination with a sophisticated management of the diversity. EADock is interfaced with .the CHARMM package for energy calculations and coordinate handling. A validation was carried out on 37 crystallized protein-ligand complexes featuring 11 different proteins. The search space was defined as a sphere of 15 R around the center of mass of the ligand position in the crystal structure, and conversely to other benchmarks, our algorithms was fed with optimized ligand positions up to 10 A root mean square deviation 2MSD) from the crystal structure. This validation illustrates the efficiency of our sampling heuristic, as correct binding modes, defined by a RMSD to the crystal structure lower than 2 A, were identified and ranked first for 68% of the complexes. The success rate increases to 78% when considering the five best-ranked clusters, and 92% when all clusters present in the last generation are taken into account. Most failures in this benchmark could be explained by the presence of crystal contacts in the experimental structure. EADock has been used to understand molecular interactions involved in the regulation of the Na,K ATPase, and in the activation of the nuclear hormone peroxisome proliferatoractivated receptors a (PPARa). It also helped to understand the action of common pollutants (phthalates) on PPARy, and the impact of biotransformations of the anticancer drug Imatinib (Gleevec®) on its binding mode to the Bcr-Abl tyrosine kinase. Finally, a fragment-based rational drug design approach using EADock was developed, and led to the successful design of new peptidic ligands for the a5ß1 integrin, and for the human PPARa. In both cases, the designed peptides presented activities comparable to that of well-established ligands such as the anticancer drug Cilengitide and Wy14,643, respectively. 3.2 French Les récentes difficultés de l'industrie pharmaceutique ne semblent pouvoir se résoudre que par l'optimisation de leur processus de développement de médicaments. Cette dernière implique de plus en plus. de techniques dites "haut-débit", particulièrement efficaces lorsqu'elles sont couplées aux outils informatiques permettant de gérer la masse de données produite. Désormais, les approches in silico telles que le criblage virtuel ou la conception rationnelle de nouvelles molécules sont utilisées couramment. Toutes deux reposent sur la capacité à prédire les détails de l'interaction moléculaire entre une molécule ressemblant à un principe actif (PA) et une protéine cible ayant un intérêt thérapeutique. Les comparatifs de logiciels s'attaquant à cette prédiction sont flatteurs, mais plusieurs problèmes subsistent. La littérature récente tend à remettre en cause leur fiabilité, affirmant l'émergence .d'un besoin pour des approches plus précises du mode d'interaction. Cette précision est essentielle au calcul de l'énergie libre de liaison, qui est directement liée à l'affinité du PA potentiel pour la protéine cible, et indirectement liée à son activité biologique. Une prédiction précise est d'une importance toute particulière pour la découverte et l'optimisation de nouvelles molécules actives. Cette thèse présente un nouveau logiciel, EADock, mettant en avant une telle précision. Cet algorithme évolutionnaire hybride utilise deux pressions de sélections, combinées à une gestion de la diversité sophistiquée. EADock repose sur CHARMM pour les calculs d'énergie et la gestion des coordonnées atomiques. Sa validation a été effectuée sur 37 complexes protéine-ligand cristallisés, incluant 11 protéines différentes. L'espace de recherche a été étendu à une sphère de 151 de rayon autour du centre de masse du ligand cristallisé, et contrairement aux comparatifs habituels, l'algorithme est parti de solutions optimisées présentant un RMSD jusqu'à 10 R par rapport à la structure cristalline. Cette validation a permis de mettre en évidence l'efficacité de notre heuristique de recherche car des modes d'interactions présentant un RMSD inférieur à 2 R par rapport à la structure cristalline ont été classés premier pour 68% des complexes. Lorsque les cinq meilleures solutions sont prises en compte, le taux de succès grimpe à 78%, et 92% lorsque la totalité de la dernière génération est prise en compte. La plupart des erreurs de prédiction sont imputables à la présence de contacts cristallins. Depuis, EADock a été utilisé pour comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la Na,K ATPase et dans l'activation du peroxisome proliferatoractivated receptor a (PPARa). Il a également permis de décrire l'interaction de polluants couramment rencontrés sur PPARy, ainsi que l'influence de la métabolisation de l'Imatinib (PA anticancéreux) sur la fixation à la kinase Bcr-Abl. Une approche basée sur la prédiction des interactions de fragments moléculaires avec protéine cible est également proposée. Elle a permis la découverte de nouveaux ligands peptidiques de PPARa et de l'intégrine a5ß1. Dans les deux cas, l'activité de ces nouveaux peptides est comparable à celles de ligands bien établis, comme le Wy14,643 pour le premier, et le Cilengitide (PA anticancéreux) pour la seconde.

Characterization of the molecular mechanisms of insulin exocytosis and of their adaptation to physiopathological conditions

Résumé large public Le glucose est une source d'énergie essentielle pour notre organisme, indispensable pour le bon fonctionnement des cellules de notre corps. Les cellules β du pancréas sont chargées de réguler l'utilisation du glucose et de maintenir la glycémie (taux de glucose dans le sang) à un niveau constant. Lorsque la glycémie augmente, ces dernières sécrètent l'insuline, une hormone favorisant l'absorption, l'utilisation et le stockage du glucose. Une sécrétion insuffisante d'insuline provoque une élévation anormale du taux de glucose dans le sang (hyperglycémie) et peut mener au développement du diabète sucré. L'insuline est sécrétée dans le sang par un mécanisme particulier appelé exocytose. Une meilleure compréhension de ce mécanisme est nécessaire dans l'espoir de trouver des nouvelles thérapies pour traiter les 170 millions de personnes atteintes de diabète sucré à travers le monde. L'implication de diverses protéines, comme les SNAREs ou Rabs a déjà été démontrée. Cependant leurs mécanismes d'action restent, à ce jour, peu compris. De plus, l'adaptation de la machinerie d'exocytose à des conditions physiopathologiques, comme l'hyperglycémie, est encore à élucider. Le but de mon travail de thèse a été de clarifier le rôle de deux protéines, Noc2 et Tomosyn, dans l'exocytose ; puis de déterminer les effets d'une exposition prolongée à un taux élevé de glucose sur l'ensemble des protéines de la machinerie d'exocytose. Noc2 est un partenaire potentiel de deux Rabs connues pour leur implication dans les dernières étapes de l'exocytose, Rab3 et Rab27. Grâce à l'étude de différents mutants de Noc2, j'ai montré que l'interaction avec Rab27 permet à la protéine de s'associer avec les organelles de la cellule β contenant l'insuline. De plus, en diminuant sélectivement l'expression de Noc2, j'ai déterminé l'importance de cette protéine pour le bon fonctionnement du processus d'exocytose et le relâchement de l'insuline. Quant à Tomosyn, une protéine interagissant avec les protéines SNAREs, j'ai démontré son importance dans la sécrétion d'insuline en diminuant de manière sélective son expression dans les cellules β. Ensuite, grâce à une combinaison d'approches moléculaires et de microscopie, j'ai mis en évidence le rôle de Tomosyn dans les dernières étapes de l'exocytose. Enfin, puisque la sécrétion d'insuline est diminuée lors d'une hyperglycémie prolongée, j'ai analysé l'adaptation de la machinerie d'exocytose à ces conditions. Ceci m'a permis de découvrir que l'expression de quatre protéines essentielles pour le processus d'exocytose, Noc2, Rab3, Rab27 et Granuphilin, est fortement diminuée lors d'une hyperglycémie chronique. L'ensemble de ces données met en évidence l'importance de Noc2 et Tomosyn dans la sécrétion d'insuline. L'inhibition, par un taux élevé de glucose, de l'expression de Noc2 et d'autres protéines indispensables pour l'exocytose suggère que ce phénomène pourrait contribuer au développement du diabète sucré. Résumé L'exocytose d'insuline, en réponse au glucose circulant dans le sang, est la fonction principale de la cellule β. Celle-ci permet de stabiliser le taux de glucose sanguin (glycémie). Le diabète de type 2 est caractérisé par une glycémie élevée due, principalement, à un défaut de sécrétion d'insuline en réponse au glucose. La compréhension des mécanismes qui contrôlent l'exocytose d'insuline est essentielle pour clarifier les causes du diabète sucré. Plusieurs composants impliqués dans ce processus ont été identifiés. Ceux-ci incluent les SNAREs Syntaxin-1, VAMP2 et SNAP25 et les GTPases Rab3 et Rab27 qui jouent un rôle dans les dernières étapes de l'exocytose. Pendant mon travail de thèse, j'ai étudié le rôle de Noc2, un des partenaires de Rab3 et Rab27, dans l'exocytose d'insuline. Nous avons déterminé que Noc2 s'associe aux granules de sécrétion d'insuline grâce à son interaction avec Rab27. La diminution de l'expression de Noc2 dans la lignée cellulaire β INS-1E, par ARN interférence, influence négativement la sécrétion d'insuline stimulée par différents sécrétagogues et prouve que cette protéine Noc2 est essentielle pour l'exocytose d'insuline. L'interaction avec Munc13, une protéine impliquée dans l'arrimage des vésicules, suggère que Noc2 participe au recrutement des granules d'insuline à la membrane plasmique. Ensuite, j'ai analysé l'adaptation de la machinerie d'exocytose à des concentrations supraphysiologiques de glucose. Le niveau d'expression de Rab3 et Rab27 et de leurs effecteurs Granuphilin/S1p4 et Noc2 est fortement diminué par une exposition prolongée des cellules β à haut glucose. L'effet observé est en relation avec l'induction de l'expression de ICER, un facteur de transcription surexprimé dans des conditions d'hyperglycémie et également dans des modèles génétiques de diabète de type 2. La surexpression de ICER dans des cellules INS-1E diminue l'expression de Rab3, Rab27, Granuphilin/Slp4 et Noc2 et par conséquent l'exocytose d'insuline. Ainsi, l'induction de ICER, après une exposition prolongée à haut glucose, régule négativement l'expression de protéines essentielles pour l'exocytose et altère la sécrétion d'insuline. Ce mécanisme pourrait contribuer au dysfonctionnement de l'exocytose d'insuline dans le diabète de type 2. Dans la dernière partie de ma thèse, j'ai investigué le rôle de la protéine Tomosyn-1 dans la formation du complexe SNARE. Cette protéine a une forte affinité pour Syntaxin-1 et contient un domaine SNARE. Tomosyn-1 est concentrée dans les régions cellulaires enrichies en granules de sécrétion. La diminution sélective de l'expression de Tomosyn-1 induit une réduction de l'exocytose stimulée par différents sécrétagogues. Cet effet est dû à un défaut de fusion des granules avec la membrane plasmique. Ceci nous indique que Tomosyn-1 intervient dans une phase importante de la préparation des vésicules à la fusion, qui est nécessaire à l'exocytose. Abstract: Insulin exocytosis from pancreatic β-cells plays a central role in blood glucose homeostasis. Diabetes mellitus is a complex metabolic disorder characterized by secretory dysfunctions in pancreatic β-cells and release of amounts of insulin that are inappropriate to maintain blood glucose concentration within normal physiological ranges. To define the causes of β-cell failure a basic understanding of the molecular mechanisms that control insulin exocytosis is essential. Some of the molecular components involved in this process have been identified, including the SNARE proteins VAMP2, Syntaxin-1 and SNAP25 and the two GTPases, Rab3 and Rab27, that regulate the final steps of insulin secretion. I first investigated the role of Noc2, a potential Rab3 and Rab27 partner, in insulin secretion. I found that Noc2 associates with Rab27 and is recruited by this GTPase on insulin- containing granules. Silencing of the Noc2 gene by RNA interference led to a strong impairment in the capacity of the β-cell line INS-1E to respond to secretagogues, indicating that appropriate levels of the protein are essential for insulin exocytosis. I also showed that Noc2 interacts with Munc13, a protein that controls vesicle priming, suggesting a possible involvement of Noc2 in the recruitment of secretory granules at the plasma membrane. In the second part of my thesis, I investigated the adaptation of the molecular machinery of exocytosis to physiopathological conditions. I found that the expression of Rab3, Rab27 and of their effectors Granuphilin/Slp4 and Noc2 is dramatically decreased by chronic exposure of β-ce1ls to supraphysiological glucose levels. The observed glucotoxic effect is a consequence of the induction of ICER, a transcriptional repressor that is increased by prolonged hyperglycemia and in genetic models of type 2 diabetes. Overexpression of ICER reduced Granuphilin, Noc2, Rab3 and Rab27 levels and inhibited exocytosis. These results suggest that the presence of inappropriate levels of ICER diminishes the expression of a group of proteins essential for exocytosis and contributes to defective insulin release in type 2 diabetes. In the last part of my thesis, I focused my attention on the role of Tomosyn-1, a Syntaxin-1 binding protein possessing a SNARE-like motif, in the control of SNARE complex assembly. I found that Tomosyn-1 is concentrated in cellular compartments enriched in insulin-containing secretory granules. Silencing of Tomosyn-1 did not affect the number of secretory granules docked at the plasma membrane but decreased their release probability, resulting in a reduction in stimulus-induced insulin exocytosis. These findings suggest that Tomosyn-1 is involved in a post-docking event that prepares secretory granules for fusion and is necessary to sustain exocytosis in response to insulin secretagogues.

Characterization of GLUT8 and GLUT9, two novel glucose transporter isoforms

Summary Prevalence of type 2 diabetes is increasing worldwide at alarming rates, probably secondarily to that of obesity. As type 2 diabetes is characterized by blood hyperglycemia, controlling glucose entry into tissues from the bloodstream is key to maintain glycemia within acceptable ranges. In this context, several glucose transporter isoforms have been cloned recently and some of them have appeared to play important regulatory roles. Better characterizing two of them (GLUT8 and GLUT9) was the purpose of my work. The first part of my work was focused on GLUT8, which is mainly expressed in the brain and is able to transport glucose with high affinity. GLUT8 is retained intracellularly at basal state depending on an N-terminal dileucine motif, thus implying that cell surface expression may be induced by extracellular triggers. In this regard, I was interested in better defining GLUT8 subcellular localization at basal state and in finding signals promoting its translocation, using an adenoviral vector expressing a myc epitope-tagged version of the transporter, thus allowing expression and detection of cell-surface GLUT8 in primary hippocampal neurons and PC 12 cells. This tool enabled me to found out that GLUT8 resides in a unique compartment different from lysosomes, endoplasmic reticulum, endosomes and the Golgi. In addition, absence of GLUT8 translocation following pharmacological activation of several signalling pathways suggests that GLUT8 does not ever translocate to the cell surface, but would rather fulfill its role in its unique intracellular compartment. The second part of my work was focused on GLUT9, which -contrarily to GLUT8 - is unable to transport glucose, but retains the ability to bind glucose-derived cross-linker molecules, thereby suggesting that it may be a glucose sensor rather than a true glucose transporter. The aim of the project was thus to define if GLUT9 triggers intracellular signals when activated. Therefore, adenoviral vectors expressing GLUTS were used to infect both ßpancreatic and liver-derived cell lines, as GLUTS is endogenously expressed in the liver. Comparison of gene expression between cells infected with the GLUTS-expressing adenovirus and cells infected with a GFP-expressing control adenovirus ended up in the identification of the transcription factor HNF4α as being upregulated in aGLUT9-dependent manner. Résumé La prévalence du diabète de type 2 augmente de façon alarmante dans le monde entier, probablement secondairement à celle de l'obésité. Le diabète de type 2 étant caractérisé par une glycémie sanguine élevée, l'entrée du glucose dans les tissus depuis la circulation sanguine constitue un point de contrôle important pour maintenir la glycémie à des valeurs acceptables. Dans ce contexte, plusieurs isoformes de transporteurs au glucose ont été clonées récemment et certaines d'entre elles sont apparues comme jouant d'importants rôles régulateurs. Mieux caractériser deux d'entre elles (GLUT8 et GLUT9) était le but de mon travail. La première partie de mon travail a été centrée sur GLUT8, qui est exprimé principalement dans le cerveau et qui peut transporter le glucose avec une haute affinité. GLUT8 est retenu intracellulairement à l'état basal de façon dépendante d'un motif dileucine N-terminal, ce qui implique que son expression à la surface cellulaire pourrait être induite par des stimuli extracellulaires. Dans cette optique, je me suis intéressé à mieux définir la localisation subcellulaire de GLUT8 à l'état basal et à trouver des signaux activant sa translocation, en utilisant comme outil un vecteur adénoviral exprimant une version marquée (tag myc) du transporteur, me permettant ainsi d'exprimer et de détecter GLUT8 à la surface cellulaire dans des neurones hippocampiques primaires et des cellules PC12. Cet outil m'a permis de montrer que GLUT8 réside dans un compartiment unique différent des lysosomes, du réticulum endoplasmique, des endosomes, ainsi que du Golgi. De plus, l'absence de translocation de GLUT8 à la suite de l'activation pharmacologique de plusieurs voies de signalisation suggère que GLUT8 ne transloque jamais à la membrane plasmique, mais jouerait plutôt un rôle au sein même de son compartiment intracellulaire unique. La seconde partie de mon travail a été centrée sur GLUT9, lequel -contrairement à GLUT8 -est incapable de transporter le glucose, mais conserve la capacité de se lier à des molécules dérivées du glucose, suggérant que ce pourrait être un senseur de glucose plutôt qu'un vrai transporteur. Le but du projet a donc été de définir si GLUT9 active des signaux intracellulaires quand il est lui-même activé. Pour ce faire, des vecteurs adénoviraux exprimant GLUT9 ont été utilisés pour infecter des lignées cellulaires dérivées de cellules ßpancréatiques et d'hépatocytes, GLUT9 étant exprimé de façon endogène dans le foie. La comparaison de l'expression des gènes entre des cellules infectées avec l'adénovirus exprimant GLUT9 et un adénovirus contrôle exprimant la GFP a permis d'identifier le facteur de transcription HNF4α comme étant régulé de façon GLUT9-dépendante. Résumé tout public Il existe deux types bien distincts de diabète. Le diabète de type 1 constitue environ 10 des cas de diabète et se déclare généralement à l'enfance. Il est caractérisé par une incapacité du pancréas à sécréter une hormone, l'insuline, qui régule la concentration sanguine du glucose (glycémie). Il en résulte une hyperglycémie sévère qui, si le patient n'est pas traité à l'insuline, conduit à de graves dommages à divers organes, ce qui peut mener à la cécité, à la perte des membres inférieurs, ainsi qu'à l'insuffisance rénale. Le diabète de type 2 se déclare plus tard dans la vie. Il n'est pas causé par une déficience en insuline, mais plutôt par une incapacité de l'insuline à agir sur ses tissus cibles. Le nombre de cas de diabète de type 2 augmente de façon dramatique, probablement à la suite de l'augmentation des cas d'obésité, le surpoids chronique étant le principal facteur de risque de diabète. Chez l'individu sain, le glucose sanguin est transporté dans différents organes (foie, muscles, tissu adipeux,...) où il est utilisé comme source d'énergie. Chez le patient diabétique, le captage de glucose est altéré, expliquant ainsi l'hyperglycémie. Il est ainsi crucial d'étudier les mécanismes permettant ce captage. Ainsi, des protéines permettant l'entrée de glucose dans la cellule depuis le milieu extracellulaire ont été découvertes depuis une vingtaine d'années. La plupart d'entre elles appartiennent à une sous-famille de protéines nommée GLUT (pour "GLUcose Transporters") dont cinq membres ont été caractérisés et nommés selon l'ordre de leur découverte (GLUT1-5). Néanmoins, la suppression de ces protéines chez la souris par des techniques moléculaires n'affecte pas totalement le captage de glucose, suggérant ainsi que des transporteurs de glucose encore inconnus pourraient exister. De telles protéines ont été isolées ces dernières années et nommées selon l'ordre de leur découverte (GLUT6-14). Durant mon travail de thèse, je me suis intéressé à deux d'entre elles, GLUT8 et GLUT9, qui ont été découvertes précédemment dans le laboratoire. GLUT8 est exprimé principalement dans le cerveau. La protéine n'est pas exprimée à la surface de la cellule, mais est retenue à l'intérieur. Des mécanismes complexes doivent donc exister pour déplacer le transporteur à la surface cellulaire, afin qu'il puisse permettre l'entrée du glucose dans la cellule. Mon travail a consisté d'une part à définir où se trouve le transporteur à l'intérieur de la cellule, et d'autre part à comprendre les mécanismes capables de déplacer GLUT8 vers la surface cellulaire, en utilisant des neurones exprimant une version marquée du transporteur, permettant ainsi sa détection par des méthodes biochimiques. Cela m'a permis de montrer que GLUT8 est localisé dans une partie de la cellule encore non décrite à ce jour et qu'il n'est jamais déplacé à la surface cellulaire, ce qui suggère que le transporteur doit jouer un rôle à l'intérieur de la cellule et non à sa surface. GLUT9 est exprimé dans le foie et dans les reins. Il ressemble beaucoup à GLUT8, mais ne transporte pas le glucose, ce qui suggère que ce pourrait être un récepteur au glucose plutôt qu'un transporteur à proprement parler. Le but de mon travail a été de tester cette hypothèse, en comparant des cellules du foie exprimant GLUT9 avec d'autres n'exprimant pas la protéine. Par des méthodes d'analyses moléculaires, j'ai pu montrer que la présence de GLUT9 dans les cellules du foie augmente l'expression de HNF4α, une protéine connue pour réguler la sécrétion d'insuline dans le pancréas ainsi que la production de glucose dans le foie. Des expériences complémentaires seront nécessaires afin de mieux comprendre par quels mécanismes GLUT9 influence l'expression de HNF4α dans le foie, ainsi que de définir l'importance de GLUT9 dans la régulation de la glycémie chez l'animal entier.

A role for the transcriptional repressor ICER in the molecular pathogenesis of type 2 diabetes

AbstractType 2 diabetes (T2D) is a metabolic disease which affects more than 200 millions people worldwide. The progression of this affection reaches nowadays epidemic proportions, owing to the constant augmentation in the frequency of overweight, obesity and sedentary. The pathogenesis of T2D is characterized by reduction in the action of insulin on its target tissues - an alteration referred as insulin resistance - and pancreatic β-cell dysfunction. This latter deterioration is defined by impairment in insulin biosynthesis and secretion, and a loss of β-cell mass by apoptosis. Environmental factors related to T2D, such as chronic elevation in glucose and free fatty acids levels, inflammatory cytokines and pro-atherogenic oxidized low- density lipoproteins (LDL), contribute to the loss of pancreatic β-cell function.In this study, we have demonstrated that the transcription factor Inducible Cyclic AMP Early Repressor (ICER) participates to the progression of both β-cell dysfunction and insulin resistance. The expression of this factor is driven by an alternative promoter and ICER protein represents therefore a truncated product of the Cyclic AMP Response Element Modulator (CREM) family which lacks transactivation domain. Consequently, the transcription factor ICER acts as a passive repressor which reduces expression of genes controlled by the cyclic AMP and Cyclic AMP Response Element Binding protein (CREB) pathway.In insulin-secreting cells, the accumulation of reactive oxygen species caused by environmental factors and notably oxidized LDL - a process known as oxidative stress - induces the transcription factor ICER. This transcriptional repressor hampers the secretory capacity of β-cells by silencing key genes of the exocytotic machinery. In addition, the factor ICER reduces the expression of the scaffold protein Islet Brain 1 (IB 1 ), thereby favouring the activation of the c-Jun N-terminal Kinase (JNK) pathway. This triggering alters in turn insulin biosynthesis and survival capacities of pancreatic β-cells.In the adipose tissue of mice and human subjects suffering from obesity, the transcription factor ICER contributes to the alteration in insulin action. The loss in ICER protein in these tissues induces a constant activation of the CREB pathway and the subsequent expression of the Activating Transcription Factor 3 (ATF3). In turn, this repressor reduces the transcript levels of the glucose transporter GLUT4 and the insulin-sensitizer peptide adiponectin, thereby contributing to the diminution in insulin action.In conclusion, these data shed light on the important role of the transcriptional repressor ICER in the pathogenesis of T2D, which contributes to both alteration in β-cell function and aggravation of insulin resistance. Consequently, a better understanding of the molecular mechanisms responsible for the alterations in ICER levels is required and could lead to develop new therapeutic strategies for the treatment of T2D.RésuméLe diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique qui affecte plus de 200 millions de personnes dans le monde. La progression de cette affection atteint aujourd'hui des proportions épidémiques imputables à l'augmentation rapide dans les fréquences du surpoids, de l'obésité et de la sédentarité. La pathogenèse du DT2 se caractérise par une diminution de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles - un processus nommé insulino-résistance - ainsi qu'une dysfonction des cellules β pancréatiques sécrétrices d'insuline. Cette dernière détérioration se définit par une réduction de la capacité de synthèse et de sécrétion de l'insuline et mène finalement à une perte de la masse de cellules β par apoptose. Des facteurs environnementaux fréquemment associés au DT2, tels l'élévation chronique des taux plasmatiques de glucose et d'acides gras libres, les cytokines pro-inflammatoires et les lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées, contribuent à la perte de fonction des cellules β pancréatiques.Dans cette étude, nous avons démontré que le facteur de transcription « Inducible Cyclic AMP Early Repressor » (ICER) participe à la progression de la dysfonction des cellules β pancréatiques et au développement de Pinsulino-résistance. Son expression étant gouvernée par un promoteur alternatif, la protéine d'ICER représente un produit tronqué de la famille des «Cyclic AMP Response Element Modulator » (CREM), sans domaine de transactivation. Par conséquent, le facteur ICER agit comme un répresseur passif qui réduit l'expression des gènes contrôlés par la voie de l'AMP cyclique et des « Cyclic AMP Response Element Binding protein » (CREB).Dans les cellules sécrétrices d'insuline, l'accumulation de radicaux d'oxygène libres, soutenue par les facteurs environnementaux et notamment les LDL oxydées - un processus appelé stress oxydatif- induit de manière ininterrompue le facteur de transcription ICER. Ainsi activé, ce répresseur transcriptionnel altère la capacité sécrétoire des cellules β en bloquant l'expression de gènes clés de la machinerie d'exocytose. En outre, le facteur ICER favorise l'activation de la cascade de signalisation « c-Jun N- terminal Kinase » (JNK) en réduisant l'expression de la protéine « Islet Brain 1 » (IB1), altérant ainsi les fonctions de biosynthèse de l'insuline et de survie des cellules β pancréatiques.Dans le tissu adipeux des souris et des sujets humains souffrant d'obésité, le facteur de transcription ICER contribue à l'altération de la réponse à l'insuline. La disparition de la protéine ICER dans ces tissus entraîne une activation persistante de la voie de signalisation des CREB et une induction du facteur de transcription « Activating Transcription Factor 3 » (ATF3). A son tour, le répresseur ATF3 inhibe l'expression du transporteur de glucose GLUT4 et du peptide adipocytaire insulino-sensibilisateur adiponectine, contribuant ainsi à la diminution de l'action de l'insuline en conditions d'obésité.En conclusion, à la lumière de ces résultats, le répresseur transcriptionnel ICER apparaît comme un facteur important dans la pathogenèse du DT2, en participant à la perte de fonction des cellules β pancréatiques et à l'aggravation de l'insulino-résistance. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires responsables de l'altération des niveaux du facteur ICER pourrait permettre le développement de nouvelles stratégies de traitement du DT2.Résumé didactiqueL'énergie nécessaire au bon fonctionnement de l'organisme est fournie par l'alimentation, notamment sous forme de sucres (glucides). Ceux-ci sont dégradés en glucose, lequel sera distribué aux différents organes par la circulation sanguine. Après un repas, le niveau de glucose sanguin, nommé glycémie, s'élève et favorise la sécrétion d'une hormone appelée insuline par les cellules β du pancréas. L'insuline permet, à son tour, aux organes, tels le foie, les muscles et le tissu adipeux de capter et d'utiliser le glucose ; la glycémie retrouve ainsi son niveau basai.Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique qui affecte plus de 200 millions de personnes dans le monde. Le développement de cette affection est causée par deux processus pathologiques. D'une part, les quantités d'insuline secrétée par les cellules β pancréatiques, ainsi que la survie de ces cellules sont réduites, un phénomène connu sous le nom de dysfonction des cellules β. D'autre part, la sensibilité des tissus à l'insuline se trouve diminuée. Cette dernière altération, l'insulino-résistance, empêche le transport et l'utilisation du glucose par les tissus et mène à une accumulation de ce sucre dans le sang. Cette stagnation de glucose dans le compartiment sanguin est appelée hyperglycémie et favorise l'apparition des complications secondaires du diabète, telles que les maladies cardiovasculaires, l'insuffisance rénale, la cécité et la perte de sensibilité des extrémités.Dans cette étude, nous avons démontré que le facteur ICER qui contrôle spécifiquement l'expression de certains gènes, contribue non seulement à la dysfonction des cellules β, mais aussi au développement de l'insulino-résistance. En effet, dans les cellules β pancréatiques en conditions diabétiques, l'activation du facteur ICER altère la capacité de synthèse et de sécrétion d'insuline et réduit la survie ces cellules.Dans le tissu adipeux des souris et des sujets humains souffrant d'obésité, le facteur ICER contribue à la perte de sensibilité à l'insuline. La disparition d'ICER altère l'expression de la protéine qui capte le glucose, le transoprteur GLUT4, et l'hormone adipocytaire favorisant la sensibilité à l'insuline, nommée adiponectine. Ainsi, la perte d'ICER participe à la réduction de la captation de glucose par le tissue adipeux et au développement de l'insulino-résistance au cours de l'obésité.En conclusion, à la lumière de ces résultats, le facteur ICER apparaît comme un contributeur important à la progression du DT2, en soutenant la dysfonction des cellules β pancréatiques et l'aggravation de l'insulino-résistance. Par conséquent, l'étude des mécanismes responsables de la dérégulation du facteur ICER pourrait permettre le développement de nouvelles stratégies de traitement du DT2.

Differential miRNA and IncRNA expression in embryonic stem cells lacking the Notch1 receptor

Embryonic stem (ES) cells-derived cardiomyocytes represent an attractive source of cells in cell replacement therapies for heart disease. However, controlled cardiogenic differentiation of ES cells requires a complete understanding of the complex molecular mechanisms regulating the differentiation process. We have previously shown that differentiation of ES cells into cardiomyocytes is favored by inactivation of the Notch 1 receptor pathway. In the present study, we therefore compared two ES cell lines, one with normal Notchl expression and one carrying deleted Notchl receptor alleles (Notchl-deleted ES cells) in order to identify genes responsible for the increased propensity of Notchl-deleted ES cells to produce cardiomyocytes. Using RNA-sequencing, we found approximately 300 coding and noncoding transcripts, which are differently expressed in undifferentiated Notchl-deleted ES cells. Since accumulating evidences indicate that long noncoding RNAs (IncRNAs) play important roles in ES cell pluripotency and differentiation, we focused our analysis on modulated IncRNAs. In particular, two IncRNAs, named here lnc 1230 and lnc 1335, are highly induced in the absence of Notchl receptor expression. These represent therefore prime candidates that could favor cardiogenic commitment in undifferentiated ES cells. Indeed, we demonstrate that forced expression of these two IncRNAs in wild-type ES cells result in a significant increase of the number of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in the differentiated progeny of these ES cells. Furthermore, we also identify several microRNAs that are differentially modulated in absence of Notchl expression. Among these are miR-142-5p and miR- 381-3p. Interestingly, both lncl230 and lncl335 are targets of these two microRNAs. Altogether, these data suggest that Notchl-dependent noncoding gene networks, implicating microRNAs and IncRNAs, control embryonic stem cell commitment into the mesodermal and cardiac lineages already at the undifferentiated state. - Les cardiomyocytes issus cellules souches embryonnaires sont une source très prometteuse pour les thérapies cellulaire de remplacement dans le cadre des maladies cardiaques. Cependant, l'utilisation de telles cellules requiert une compréhension poussée des mécanismes moléculaire régulant la différenciation. Nous avons par le passé démontré que la différenciation des cellules souches embryonnaires en cardiomyocytes est favorisée par l'inactivation de la voie d'activation intracellulaire dépendante du récepteur Notch 1. Nous avons donc comparé deux lignées de cellules souches embryonnaires, une présentant une voie d'activation Notchl normale et une chez laquelle les allèles codant pour le récepteur Notchl avaient été invalidés, de façon à identifier les gènes impliqués dans la capacité augmentée des cellules déficientes à produire des cardiomyocytes. En utilisant du séquençage d'ARN à haut débit, nous avons trouvé environ 300 gènes différemment exprimés dans les cellules déficientes pour Notchl. Par ailleurs, des évidences de plus en plus nombreuses suggèrent qu'une nouvelle classe de molécules appelée « long noncoding RNAs » joue un rôle prépondérant dans la maintenance de l'état non différencié et de la capacité de différenciation des cellules souches embryonnaires. Nous avons trouvé que plusieurs « long noncoding RNAs » étaient modulés en l'absence de Notchl, et en particulier deux molécules que nous avons appelées lncl230 et lncl335. Ces derniers représentent des candidats potentiels devant permettre de favoriser la production de cardiomyocytes. Nous avons en effet démontré que la surexpression de ces deux candidats dans des cellules souches embryonnaires résultait en une surproduction de cardiomyocytes. De plus, nous avons également identifié plusieurs microRNAs dont l'expression était modulée dans les cellules souches embryonnaires déficientes dans la voie Notchl. De façon intéressante, parmi ces microRNAs, le miR-142-5p et le miR-381-3p sont capables de cibler lncl230 and lncl335. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent donc que des réseaux d'interaction dépendant de la voie d'activation Notch 1 et impliquant des ARNs non codant existent dans les cellules souches embryonnaires pour réguler leur différenciation en différent types cellulaires spécifiques.

Role of CLOCK and circadian rhythms in calcium homeostasis

Le maintien d'une concentration sanguine constante de calcium est d'une importance cruciale et trois organes participent à la balance calcique normale : les reins, les intestins et les os. La concentration plasmatique de calcium est strictement régulée par l'hormone parathyroïdienne (PTH) et par la vitamine D. Des variations circadiennes de la PTH, de la vitamine D ainsi que du calcium plasmatique ont été décrites précédemment chez l'humain ainsi que chez le rat. Ces rythmes de PTH dans le sérum sont importants pour la régulation du remodelage de l'os. En effet, il a été montré chez les souris C57BL/6J que des injections de PTH une fois par jour mènent à une augmentation de la densité minérale de l'os alors que l'infusion en continu de PTH est associée à une diminution de cette densité. La vitamine D joue également un rôle fondamental dans la physiologie osseuse, car un déficit en vitamine D peut conduire à une ostéomalacie. Cependant la fonction des oscillations de vitamine D au niveau de l'homéostasie osseuse reste inconnue. L'horloge circadienne est un système interne de contrôle biologique du temps générant des rythmes de 24 heures dans l'expression des gènes, ainsi que dans la physiologie et le comportement. Ce contrôle s'opère par des boucles rétroactives positives et négatives de l'expression de gènes circadiens tels que CLOCK, BMAL1, CRY1 et 2 ou PERI et 2. Dans ce travail, nous avons émis l'hypothèse que l'homéostasie calcique est sous le contrôle de l'horloge circadienne. Dans un premier temps, nous avons montré chez les souris C57BL/6J des variations journalières des concentrations de calcium, de PTH et de vitamine D dans le sang, ainsi que de calcium dans les urines. Nous avons également démontré des changements au niveau de l'expression rénale des gènes importants dans l'homéostasie du calcium, tant au niveau de l'ARN messager que des protéines. Ensuite, pour analyser le rôle du système de l'horloge circadienne dans l'homéostasie du calcium, nous avons étudié des souris dans lesquelles a été supprimé le gène CLOCK crucial pour la fonction de l'horloge et nous avons comparé ces souris à des souris de type sauvage de même portée. Les souris CLOCK-I- étaient hypercalciuriques à chaque moment de la journée. Cependant le rythme circadien de l'excrétion de calcium était préservé. Le taux de calcium plasmatique ne différait pas entre les génotypes, mais les souris CLOCK -/- ne montraient pas de variations journalières de ce paramètre. Une perte du rythme journalier était également observée pour les niveaux de vitamine D, perte qui pourrait être une cause de l'altération de la micro-architecture osseuse révélée chez les souris CLOCK-/-. En effet, ces souris montrent une diminution du nombre de trabécules, de leur volume ainsi que de leur surface, ce qui suggère la présence d'ostéoporose. Nous avons également trouvé que le rythme de l'expression de l'ARN messager de CYP27B1 était aboli dans les reins des souris CLOCK -/-, ce qui peut expliquer l'altération du rythme de la vitamine D. Les taux sanguins de PTH étaient comparables entre les souris CLOCK -/- et de type sauvage. Dans les reins, une augmentation de l'expression de l'ARN messager de TRPV5 et NCX1 a été constatée, ce qui suggérerait une augmentation de la réabsorption de calcium dans le tubule convoluté distal et dans le tubule connecteur. Dans les intestins, la réabsorption calcique était diminuée, chez les souris CLOCK-I-, fait confirmé par une diminution des niveaux d'ARN messager de TRPV6 et PMCAL. En résumé, la suppression du gène CLOCK chez les souris a conduit à une hypercalciurie, une altération du rythme des taux plasmatiques de calcium et de vitamine D et à une détérioration de l'architecture osseuse. Pour conclure, ces résultats montrent que l'horloge circadienne est essentielle à l'homéostasie calcique ainsi qu'à la physiologie des os. - L'ostéoporose affecte environ 22 millions de femmes et 5.5 millions d'hommes en Europe, réduisant significativement leur qualité de vie et a causé 3.5 millions de nouvelles fractures en 2010. Les dépenses totales liées à ces fractures ont atteint 37 milliards d'euro et ce coût devrait augmenter de 25% d'ici à 2025. Le nombre de nouvelles fractures dues à l'ostéoporose à travers le monde est estimé à environ 1000 par heure. Parmi les causes de l'ostéoporose, le déficit én calcium et/ou en vitamine D joue un rôle important, mais il existe également des causes génétiques ou liées à des facteurs comme les hormones sexuelles (estrogènes, testostérone), l'âge, le tabac, le poids corporel, certains médicaments,... La vie est rythmique : ceci est dû à l'alternance naturelle du jour et de la nuit et de ses effets sur le corps. La prise alimentaire, par exemple, est un processus qui a lieu pendant la phase active, qui est prévisible (il se produit toujours au même moment) et qui peut être anticipé par le corps. Pour cela, une horloge interne est présente dans chaque cellule du corps et est synchronisée par la lumière du jour, entre autres stimuli. Cette horloge indique la phase du jour et régule l'expression de gènes impliqués dans les différents processus qui nécessitent une anticipation. Pendant mon travail de thèse, je me suis demandé si des îythmes circadiens (c'est-à-dire d'une durée d'environ 24 heures et indépendants des stimuli externes) étaient observables'pour les gènes régulant les flux de calcium dans le corps et si l'interruption de ces rythmes pouvait mener à des altérations de la qualité de l'os. J'ai d'abord travaillé avec des souris normales et j'ai pu montrer la présence de rythmes au niveau du calcium sanguin et urinaire, mais également au niveau des hormones et gènes qui contrôlent le métabolisme du calcium dans le corps, comme la vitamine D et l'hormone parathyroidienne. De manière intéressante, j'ai observé que la plupart de ces gènes ont un rythme synchronisé. J'ai ensuite utilisé un modèle de souris dans lequel l'horloge interne a été génétiquement invalidée et j'ai montré que ces souris présentent une augmentation de leur excrétion urinaire de calcium et un rythme circadien altéré de la vitamine D dans le sang. Ces souris absorbent aussi moins bien le calcium intestinal et présentent une ostéoporose marquée. Ce travail montre donc que l'horloge interne est nécessaire pour établir un rythme circadiens de certains facteurs influant les flux de calcium dans l'organisme, comme la vitamine D, et que la perturbation de ces rythmes mène à une dérégulation du métabolisme osseux. Ainsi, la perturbation de l'horloge interne peut causer une ostéoporose et une hypercalciurie qui pourraient aboutir à la formation de fractures et de calculs rénaux. L'extrapolation de ces observations chez l'homme ou à des changements plus subtiles des rythmes circadiens, comme le décalage horaire, restent à montrer. Cette recherche a démontré que les rythmes circadiens des mécanismes de régulation des flux de calcium dans l'organisme sont essentiels au maintien d'un squelette normal et suggère que les perturbations des rythmes circadiens pourraient être une nouvelle cause de l'ostéoporose. - Maintaining constant calcium concentration in the plasma is of a crucial importance and three organs participate in normal calcium balance - kidney, gut and bone. Plasma calcium concentration is strictly regulated by parathyroid hormone (PTH) and vitamin D. Circadian variations of PTH, vitamin D and plasma calcium were previously described in humans, as well as in rats. Rhythms in serum PTH are important for balanced bone remodelling. Indeed in C57BL/6J mice, PTH injection once per day leads to an increase in bone mineral density (BMD), whilst continuous infusion is associated with decreased BMD. Vitamin D also plays a crucial role in bone physiology, since the deficiency in vitamin D can lead to rickets/osteomalacia. However, the role of vitamin D rhythms in bone homeostasis remains unknown. The circadian clock is an. internal time-keeping system generating rhythms in gene expression with 24h periodicity, in physiology and in behaviour. It is operated by positive- and negative-feedback loops of circadian genes, such as CLOCK, BMAL1, CRY1 and 2 or PERI and 2. In this work, we hypothesized, that calcium homeostasis is under the control of the circadian clock. First, we showed daily variations in urinary calcium and serum calcium, PTH and l,25(OH)2 vitamin D, together with renal mRNA and protein levels of genes involved in calcium homeostasis in C57BL/6J mice. Second, and to investigate the role of the circadian clock system in calcium handling, we studied mice lacking the gene CLOCK crucial for fonction of the clock system and compared them to the WT littermates. CLOCK-/- mice were hypercalciuric at all timepoints of the day. However, the circadian rhythm of calcium excretion was preserved. Serum calcium levels did not differ between the genotypes, but CLOCK-/- mice did not exhibit daily variation for this parameter. Loss of rhythm was observed also for serum l,25(OH)2 vitamin D levels, which may be one of the causes of altered bone microarchitecture that was revealed in CLOCK-/- mice. They displayed increased trabecular separation and decreased trabecular number, trabecular bone volume and trabecular bone surface, suggestive of osteoporosis. We found that the rhythm of the mRNA expression of CYP27B1 was abolished in the kidney of CLOCK-/- mice, which could induce the altered rhythm of l,25(OH)2 vitamin. Serum PTH levels were comparable between CLOCK-/- and WT mice. In the kidney, increased mRNA expression of TRPV5 and NCX1 suggests increased calcium reabsorption in the distal convoluted and connecting tubule. In the gut, intestinal calcium absorption was decreased in CLOCK¬/- mice, confirmed by decreased mRNA levels of TRPV6 and PMCA1. In summary, deletion of the CLOCK gene in mice conducts to hypercalciuria, alteration of the rhythm in serum calcium and l,25(OH)2D levels, and impainnent of their bone microarchitecture. In conclusion, these data show that the circadian clock system is essential in calcium homeostasis and bone physiology.

Multi-scale systems analysis of plant development : beyond cellular signaling and tissue morphodynamics

Les plantes sont essentielles pour les sociétés humaines. Notre alimentation quotidienne, les matériaux de constructions et les sources énergétiques dérivent de la biomasse végétale. En revanche, la compréhension des multiples aspects développementaux des plantes est encore peu exploitée et représente un sujet de recherche majeur pour la science. L'émergence des technologies à haut débit pour le séquençage de génome à grande échelle ou l'imagerie de haute résolution permet à présent de produire des quantités énormes d'information. L'analyse informatique est une façon d'intégrer ces données et de réduire la complexité apparente vers une échelle d'abstraction appropriée, dont la finalité est de fournir des perspectives de recherches ciblées. Ceci représente la raison première de cette thèse. En d'autres termes, nous appliquons des méthodes descriptives et prédictives combinées à des simulations numériques afin d'apporter des solutions originales à des problèmes relatifs à la morphogénèse à l'échelle de la cellule et de l'organe. Nous nous sommes fixés parmi les objectifs principaux de cette thèse d'élucider de quelle manière l'interaction croisée des phytohormones auxine et brassinosteroïdes (BRs) détermine la croissance de la cellule dans la racine du méristème apical d'Arabidopsis thaliana, l'organisme modèle de référence pour les études moléculaires en plantes. Pour reconstruire le réseau de signalement cellulaire, nous avons extrait de la littérature les informations pertinentes concernant les relations entre les protéines impliquées dans la transduction des signaux hormonaux. Le réseau a ensuite été modélisé en utilisant un formalisme logique et qualitatif pour pallier l'absence de données quantitatives. Tout d'abord, Les résultats ont permis de confirmer que l'auxine et les BRs agissent en synergie pour contrôler la croissance de la cellule, puis, d'expliquer des observations phénotypiques paradoxales et au final, de mettre à jour une interaction clef entre deux protéines dans la maintenance du méristème de la racine. Une étude ultérieure chez la plante modèle Brachypodium dystachion (Brachypo- dium) a révélé l'ajustement du réseau d'interaction croisée entre auxine et éthylène par rapport à Arabidopsis. Chez ce dernier, interférer avec la biosynthèse de l'auxine mène à la formation d'une racine courte. Néanmoins, nous avons isolé chez Brachypodium un mutant hypomorphique dans la biosynthèse de l'auxine qui affiche une racine plus longue. Nous avons alors conduit une analyse morphométrique qui a confirmé que des cellules plus anisotropique (plus fines et longues) sont à l'origine de ce phénotype racinaire. Des analyses plus approfondies ont démontré que la différence phénotypique entre Brachypodium et Arabidopsis s'explique par une inversion de la fonction régulatrice dans la relation entre le réseau de signalisation par l'éthylène et la biosynthèse de l'auxine. L'analyse morphométrique utilisée dans l'étude précédente exploite le pipeline de traitement d'image de notre méthode d'histologie quantitative. Pendant la croissance secondaire, la symétrie bilatérale de l'hypocotyle est remplacée par une symétrie radiale et une organisation concentrique des tissus constitutifs. Ces tissus sont initialement composés d'une douzaine de cellules mais peuvent aisément atteindre des dizaines de milliers dans les derniers stades du développement. Cette échelle dépasse largement le seuil d'investigation par les moyens dits 'traditionnels' comme l'imagerie directe de tissus en profondeur. L'étude de ce système pendant cette phase de développement ne peut se faire qu'en réalisant des coupes fines de l'organe, ce qui empêche une compréhension des phénomènes cellulaires dynamiques sous-jacents. Nous y avons remédié en proposant une stratégie originale nommée, histologie quantitative. De fait, nous avons extrait l'information contenue dans des images de très haute résolution de sections transverses d'hypocotyles en utilisant un pipeline d'analyse et de segmentation d'image à grande échelle. Nous l'avons ensuite combiné avec un algorithme de reconnaissance automatique des cellules. Cet outil nous a permis de réaliser une description quantitative de la progression de la croissance secondaire révélant des schémas développementales non-apparents avec une inspection visuelle classique. La formation de pôle de phloèmes en structure répétée et espacée entre eux d'une longueur constante illustre les bénéfices de notre approche. Par ailleurs, l'exploitation approfondie de ces résultats a montré un changement de croissance anisotropique des cellules du cambium et du phloème qui semble en phase avec l'expansion du xylème. Combinant des outils génétiques et de la modélisation biomécanique, nous avons démontré que seule la croissance plus rapide des tissus internes peut produire une réorientation de l'axe de croissance anisotropique des tissus périphériques. Cette prédiction a été confirmée par le calcul du ratio des taux de croissance du xylème et du phloème au cours de développement secondaire ; des ratios élevés sont effectivement observés et concomitant à l'établissement progressif et tangentiel du cambium. Ces résultats suggèrent un mécanisme d'auto-organisation établi par un gradient de division méristématique qui génèrent une distribution de contraintes mécaniques. Ceci réoriente la croissance anisotropique des tissus périphériques pour supporter la croissance secondaire. - Plants are essential for human society, because our daily food, construction materials and sustainable energy are derived from plant biomass. Yet, despite this importance, the multiple developmental aspects of plants are still poorly understood and represent a major challenge for science. With the emergence of high throughput devices for genome sequencing and high-resolution imaging, data has never been so easy to collect, generating huge amounts of information. Computational analysis is one way to integrate those data and to decrease the apparent complexity towards an appropriate scale of abstraction with the aim to eventually provide new answers and direct further research perspectives. This is the motivation behind this thesis work, i.e. the application of descriptive and predictive analytics combined with computational modeling to answer problems that revolve around morphogenesis at the subcellular and organ scale. One of the goals of this thesis is to elucidate how the auxin-brassinosteroid phytohormone interaction determines the cell growth in the root apical meristem of Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), the plant model of reference for molecular studies. The pertinent information about signaling protein relationships was obtained through the literature to reconstruct the entire hormonal crosstalk. Due to a lack of quantitative information, we employed a qualitative modeling formalism. This work permitted to confirm the synergistic effect of the hormonal crosstalk on cell elongation, to explain some of our paradoxical mutant phenotypes and to predict a novel interaction between the BREVIS RADIX (BRX) protein and the transcription factor MONOPTEROS (MP),which turned out to be critical for the maintenance of the root meristem. On the same subcellular scale, another study in the monocot model Brachypodium dystachion (Brachypodium) revealed an alternative wiring of auxin-ethylene crosstalk as compared to Arabidopsis. In the latter, increasing interference with auxin biosynthesis results in progressively shorter roots. By contrast, a hypomorphic Brachypodium mutant isolated in this study in an enzyme of the auxin biosynthesis pathway displayed a dramatically longer seminal root. Our morphometric analysis confirmed that more anisotropic cells (thinner and longer) are principally responsible for the mutant root phenotype. Further characterization pointed towards an inverted regulatory logic in the relation between ethylene signaling and auxin biosynthesis in Brachypodium as compared to Arabidopsis, which explains the phenotypic discrepancy. Finally, the morphometric analysis of hypocotyl secondary growth that we applied in this study was performed with the image-processing pipeline of our quantitative histology method. During its secondary growth, the hypocotyl reorganizes its primary bilateral symmetry to a radial symmetry of highly specialized tissues comprising several thousand cells, starting with a few dozens. However, such a scale only permits observations in thin cross-sections, severely hampering a comprehensive analysis of the morphodynamics involved. Our quantitative histology strategy overcomes this limitation. We acquired hypocotyl cross-sections from tiled high-resolution images and extracted their information content using custom high-throughput image processing and segmentation. Coupled with an automated cell type recognition algorithm, it allows precise quantitative characterization of vascular development and reveals developmental patterns that were not evident from visual inspection, for example the steady interspace distance of the phloem poles. Further analyses indicated a change in growth anisotropy of cambial and phloem cells, which appeared in phase with the expansion of xylem. Combining genetic tools and computational modeling, we showed that the reorientation of growth anisotropy axis of peripheral tissue layers only occurs when the growth rate of central tissue is higher than the peripheral one. This was confirmed by the calculation of the ratio of the growth rate xylem to phloem throughout secondary growth. High ratios are indeed observed and concomitant with the homogenization of cambium anisotropy. These results suggest a self-organization mechanism, promoted by a gradient of division in the cambium that generates a pattern of mechanical constraints. This, in turn, reorients the growth anisotropy of peripheral tissues to sustain the secondary growth.