HARNESSING iNKT CELLS WITH RECOMBINANT CD1d FUSION PROTEINS TO REDIRECT INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY TO THE TUMOR

Les thérapies du cancer, comme la radiothérapie et la chimiothérapie, sont couramment utilisées mais ont de nombreux effets secondaires. Ces thérapies invasives pour le patient nécessitent d'être améliorées et de nombreuses avancées ont été faites afin d'adapter et de personnaliser le traitement du cancer. L'immunothérapie a pour but de renforcer le système immunitaire du patient et de le rediriger de manière spécifique contre la tumeur. Dans notre projet, nous activons les lymphocytes Invariant Natural Killer T (iNKT) afin de mettre en place une immunothérapie innovatrice contre le cancer. Les cellules iNKT sont une unique sous-population de lymphocytes T qui ont la particularité de réunir les propriétés de l'immunité innée ainsi qu'adaptative. En effet, les cellules iNKT expriment à leur surface des molécules présentes aussi sur les cellules tueuses NK, caractéristique de l'immunité innée, ainsi qu'un récepteur de cellules T (TCR) qui représente l'immunité adaptative. Les cellules iNKT reconnaissent avec leur TCR des antigènes présentés par la molécule CD1d. Les antigènes sont des protéines, des polysaccharides ou des lipides reconnus par les cellules du système immunitaire ou les anticorps pour engendrer une réponse immunitaire. Dans le cas des cellules iNKT, l'alpha-galactosylceramide (αGC) est un antigène lipidique fréquemment utilisé dans les études cliniques comme puissant activateur. Après l'activation des cellules iNKT avec l'αGC, celles-ci produisent abondamment et rapidement des cytokines. Ces cytokines sont des molécules agissant comme des signaux activateurs d'autres cellules du système immunitaire telles que les cellules NK et les lymphocytes T. Cependant, les cellules iNKT deviennent anergiques après un seul traitement avec l'αGC c'est à dire qu'elles ne peuvent plus être réactivées, ce qui limite leur utilisation dans l'immunothérapie du cancer. Dans notre groupe, Stirnemann et al ont publié une molécule recombinante innovante, composée de la molécule CD1d soluble et chargée avec le ligand αGC (αGC/sCD1d). Cette protéine est capable d'activer les cellules iNKT tout en évitant l'anergie. Dans le système immunitaire, les anticorps sont indispensables pour combattre une infection bactérienne ou virale. En effet, les anticorps ont la capacité de reconnaître et lier spécifiquement un antigène et permettent l'élimination de la cellule qui exprime cet antigène. Dans le domaine de l'immunothérapie, les anticorps sont utilisés afin de cibler des antigènes présentés seulement par la tumeur. Ce procédé permet de réduire efficacement les effets secondaires lors du traitement du cancer. Nous avons donc fusionné la protéine recombinante αGC/CD1d à un fragment d'anticorps qui reconnaît un antigène spécifique des cellules tumorales. Dans une étude préclinique, nous avons démontré que la protéine αGC/sCD1d avec un fragment d'anticorps dirigé contre la tumeur engendre une meilleure activation des cellules iNKT et entraîne un effet anti-tumeur prolongé. Cet effet anti-tumeur est augmenté comparé à une protéine αGC/CD1d qui ne cible pas la tumeur. Nous avons aussi montré que l'activation des cellules iNKT avec la protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur améliore l'effet anti- tumoral d'un vaccin pour le cancer. Lors d'expériences in vitro, la protéine αGC/sCD1d-anti- tumeur permet aussi d'activer les cellules humaines iNKT et ainsi tuer spécifiquement les cellules tumorales humaines. La protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur représente une alternative thérapeutique prometteuse dans l'immunothérapie du cancer. - Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT), dont les effets anti-tumoraux ont été démontrés, sont de puissants activateurs des cellules Natural Killer (NK), des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T. Cependant, une seule injection du ligand de haute affinité alpha-galactosylceramide (αGC) n'induit une forte activation des cellules iNKT que durant une courte période. Celle-ci est alors suivie d'une longue phase d'anergie, limitant ainsi leur utilisation pour la thérapie. Comme alternative prometteuse, nous avons montré que des injections répétées d'αGC chargé sur une protéine recombinante de CD1d soluble (αGC/sCD1d) chez la souris entraînent une activation prolongée des cellules iNKT, associée à une production continue de cytokine. De plus, le maintien de la réactivité des cellules iNKT permet de prolonger l'activité anti-tumorale lorsque la protéine αGC/sCD1d est fusionnée à un fragment d'anticorps (scFv) dirigé contre la tumeur. L'inhibition de la croissance tumorale n'est optimale que lorsque les souris sont traitées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv ciblant la tumeur, la protéine αGC/sCD1d-scFv non-appropriée étant moins efficace. Dans le système humain, les protéines recombinantes αGC/sCD1d-anti-HER2 et anti-CEA sont capables d'activer et de faire proliférer des cellules iNKT à partir de PBMCs issues de donneurs sains. De plus, la protéine αGC/sCD1d-scFv a la capacité d'activer directement des clones iNKT humains en l'absence de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), contrairement au ligand αGC libre. Mais surtout, la lyse des cellules tumorales par les iNKT humaines n'est obtenue que lorsqu'elles sont incubées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv anti- tumeur. En outre, la redirection de la cytotoxicité des cellules iNKT vers la tumeur est supérieure à celle obtenue avec une stimulation par des CPA chargées avec l'αGC. Afin d'augmenter les effets anti-tumoraux, nous avons exploité la capacité des cellules iNKT à activer l'immunité adaptive. Pour ce faire, nous avons combiné l'immunothérapie NKT/CD1d avec un vaccin anti-tumoral composé d'un peptide OVA. Des effets synergiques ont été obtenus lorsque les traitements avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 étaient associés avec le CpG ODN comme adjuvant pour la vaccination avec le peptide OVA. Ces effets ont été observés à travers l'activation de nombreux lymphocytes T CD8+ spécifique de la tumeur, ainsi que par la forte expansion des cellules NK. Les réponses, innée et adaptive, élevées après le traitement avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 combinée au vaccin OVA/CpG ODN étaient associées à un fort ralentissement de la croissance des tumeurs B16- OVA-HER2. Cet effet anti-tumoral corrèle avec l'enrichissement des lymphocytes T CD8+ spécifiques observé à la tumeur. Afin d'étendre l'application des protéines αGC/sCD1d et d'améliorer leur efficacité, nous avons développé des fusions CD1d alternatives. Premièrement, une protéine αGC/sCD1d dimérique, qui permet d'augmenter l'avidité de la molécule CD1d pour les cellules iNKT. Dans un deuxième temps, nous avons fusionné la protéine αGC/sCD1d avec un scFv dirigé contre le récepteur 3 du facteur de croissance pour l'endothélium vasculaire (VEGFR-3), afin de cibler l'environnement de la tumeur. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la thérapie médiée par la protéine recombinante αGC/sCD1d-scFv est une approche prometteuse pour rediriger l'immunité innée et adaptive vers le site tumoral. - Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are potent activators of Natural Killer (NK), dendritic cells (DC) and T lymphocytes, and their anti-tumor activities have been well demonstrated. However, a single injection of the high affinity CD1d ligand alpha-galactosylceramide (αGC) leads to a strong but short-lived iNKT cell activation followed by a phase of long-term anergy, limiting the therapeutic use of this ligand. As a promising alternative, we have demonstrated that when αGC is loaded on recombinant soluble CD1d molecules (αGC/sCD1d), repeated injections in mice led to the sustained iNKT cell activation associated with continued cytokine secretion. Importantly, the retained reactivity of iNKT cell led to prolonged antitumor activity when the αGC/sCD1d was fused to an anti-tumor scFv fragments. Optimal inhibition of tumor growth was obtained only when mice were treated with the tumor-targeted αGC/CD1d-scFv fusion, whereas the irrelevant αGC/CD1d-scFv fusion was less efficient. When tested in a human system, the recombinant αGC/sCD1d-anti-HER2 and -anti-CEA fusion proteins were able to expand iNKT cells from PBMCs of healthy donors. Furthermore, the αGC/sCD1d-scFv fusion had the capacity to directly activate human iNKT cells clones without the presence of antigen-presenting cells (APCs), in contrast to the free αGC ligand. Most importantly, tumor cell killing by human iNKT cells was obtained only when co- incubated with the tumor targeted sCD1d-antitumor scFv, and their direct tumor cytotoxicity was superior to the bystander killing obtained with αGC-loaded APCs stimulation. To further enhance the anti-tumor effects, we exploited the ability of iNKT cells to transactivate the adaptive immunity, by combining the NKT/CD1d immunotherapy with a peptide cancer vaccine. Interestingly, synergistic effects were obtained when the αGC/sCD1d- anti-HER2 fusion treatment was combined with CpG ODN as adjuvant for the OVA peptide vaccine, as seen by higher numbers of activated antigen-specific CD8 T cells and NK cells, as compared to each regimen alone. The increased innate and adaptive immune responses upon combined tumor targeted sCD1d-scFv treatment and OVA/CpG vaccine were associated with a strong delay in B16-OVA-HER2 melanoma tumor growth, which correlated with an enrichment of antigen-specific CD8 cells at the tumor site. In order to extend the application of the CD1d fusion, we designed alternative CD1d fusion proteins. First, a dimeric αGC/sCD1d-Fc fusion, which permits to augment the avidity of the CD1d for iNKT cells and second, an αGC/sCD1d fused to an anti vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) scFv, in order to target tumor stroma environment. Altogether, these results demonstrate that the iNKT-mediated immunotherapy via recombinant αGC/sCD1d-scFv fusion is a promising approach to redirect the innate and adaptive antitumor immune response to the tumor site.

Role of the c-Jun N-terminal Kinase signaling in pancreatic β-cells

L'insuline est une hormone qui diminue la concentration de sucre dans le sang et qui est produite par la cellule β du pancréas. Un défaut de production de cette hormone est une des causes principales du diabète. Cette perte de production d'insuline est la conséquence à la fois, de la réduction du nombre de cellules β et du mauvais fonctionnement des cellules β restantes. L'inflammation, en activant la voie de signalisation «c-Jun N-terminal Kinase» (JNK) contribue au déclin de ces cellules. Cette voie de signalisation est activée par des protéines telles que des kinases qui reçoivent le signal de stress. Dans ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à étudier le rôle de «Dual leucine zipper bearing kinase» (DLK) comme protéine capable de relayer le stress inflammatoire vers l'activation de la voie JNK dans les cellules β-pancréatiques. Nous montrons que DLK est présente dans les cellules β-pancréatiques et qu'elle agit effectivement comme un activateur de la voie de signalisation de JNK. En outre, DLK joue un rôle clé dans le contrôle de l'expression de l'insuline, de la sécrétion de l'insuline en réponse au glucose et au maintien de la survie des cellules β. Si l'expression de cette protéine diminue, la cellule produit moins d'insuline et sera plus sensible à la mort en réponse au stress inflammatoire. A l'inverse si l'expression de DLK est augmentée, la cellule β produit et secrète plus d'insuline. Des variations de l'expression de DLK sont par ailleurs, associées à l'état de santé de la cellule β. Chez la ratte en gestation ou la souris obèse, dans lesquelles la cellule β produit plus d'insuline, l'expression de DLK est augmentée. En revanche dans les cellules β des patients diabétiques, l'expression de DLK est diminuée par rapport aux cellules non malades. En résumé, DLK est nécessaire pour le bon fonctionnement de la cellule β-pancréatique et son expression corrèle avec le degré de santé des cellules, faisant que cette protéine pourrait être une cible thérapeutique potentiel. Les cellules β-pancréatiques ont la capacité de réguler la sécrétion d'insuline en s'adaptant précisément au stimulus et à la glycémie. La fonction de la cellule β est cruciale dans l'homéostasie du glucose puisque sa dysfonction et sa mort mènent au développement des diabètes de type 1 et 2. De nombreuses études suggèrent que l'inflammation pourrait avoir un rôle dans la dysfonction et la destruction de ces cellules dans le diabète de type 2. L'excès chronique de cytokines proinflammatoires accélère le dysfonctionnement de la cellule β pancréatique par un mécanisme qui implique la voie de signalisation «c-Jun N-terminal Kinase» (JNK). L'activation de cette voie est organisée par des protéines d'échafaudages. Elle se fait par trois étapes successives de phosphorylation impliquant une «Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase» (MAP3K), une MAP2K et JNK. Dans ce travail de thèse nous montrons l'expression abondante et spécifique de la MAP3K «Dual Leucine Zipper Bearing Kinase» (DLK) dans les cellules β pancréatiques. Cela est la conséquence de l'absence du répresseur transcriptionnel «Repressor Element 1 Silencing Transcription». Nous montrons également que DLK régule l'activation de JNK et qu'il s'avère nécessaire pour la fonction et la survie de la cellule β pancréatique par un mécanisme impliquant le facteur de transcription PDX-1. L'invalidation de l'expression de DLK diminue l'expression de l'insuline et potentialise l'apoptose induite par des cytokines proinflammatoires. A l'inverse, la surexpression de DLK augmente l'expression et la sécrétion d'insuline induites par le glucose. Par conséquent des niveaux d'expression appropriés de DLK sont déterminants pour la fonction et la survie de la cellule β pancréatique. L'obésité et la grossesse sont caractérisées par une hyperinsulinémie qui résulte d'une augmentation de la production et de la sécrétion de l'insuline. L'expression de DLK est augmentée dans des îlots de rattes gestantes et des souris obèses comparés à leurs contrôles respectifs. A l'inverse, dans des sujets diabétiques, l'expression de DLK est diminuée. Ensemble ces résultats montrent l'importance de DLK dans l'adaptation des îlots par un mécanisme qui pourrait impliquer la voie de signalisation de JNK. Des défauts dans cette voie régulée par DLK pourraient contribuer au dysfonctionnement et la mort de la cellule β pancréatique et par conséquent au développement du diabète. L'étude détaillée du mécanisme par lequel DLK active la voie de signalisation JNK et régule la fonction de la cellule β pancréatique pourrait ouvrir la voie des nouvelles thérapies ciblant l'amélioration de la fonction de la cellule β dans le diabète. - Pancreatic β-cells are evidently plastic in their ability to regulate insulin secretion. The quantity of insulin released by these cells varies according to the stimulus, and the prevailing glucose concentration, β-cell function is pivotal in glucose homeostasis, as their dysfunction, and death can lead to development of type 1 and type 2 diabetes. There are numerous reports so far underlying the role of inflammation in dysfunction, and destruction of β-cells, in both type 1 and type 2 diabetes. Chronic excess of pro¬inflammatory cytokines promotes a β-cell decline, via induction of the c-Jun N-terminal Kinase (JNK) pathway. The activation of the JNK pathway is organized by a scaffold protein-mediated module in which, a three-step phosphorylation cascade occurs. The latter includes, Mitogen activated protein kinase kinase kinase (MAP3K), MAP2K and JNK. In this thesis, we unveil that the MAP3K Dual Leucine Zipper Bearing Kinase (DLK) is selectively, and highly expressed in pancreatic β-cells, as the result from the absence of the transcriptional repressor named, Repressor Element 1 Silencing Transcription (REST). We show that DLK regulates activation of JNK, and is required for β-cell function and survival by modulating the PDX-1 transcription factor. Silencing of DLK expression diminishes insulin expression, and potentiated cytokine-mediated apoptosis. Conversely, overexpression of DLK increased insulin expression, and glucose-induced insulin secretion. Therefore, an appropriate level of DLK is critical for β-cell function and survival. Obesity and pregnancy are characterized by hyperinsulinemia resulting from an increased production and secretion of insulin. In isolated islets of pregnant rats, and obese mice, the expression of DLK was elevated when compared to their respective controls. However, decreased expression of DLK was observed in islets of individuals with diabetes. Taken together, we highlight the importance of DLK in islet adaptation, and describe a mechanism that may involve the JNK signaling. Deficiency in the JNK pathway regulated by DLK may contribute to β-cell failure and death, and thereby development of diabetes. Unraveling the mechanism whereby DLK activates the JNK pathway, and β-cell function, may pave the way for the design of novel therapies, aiming to improve β-cell function and survival in diabetes in general.

Optimisation of antiretroviral therapy : pharmacokinetic and pharmacogenetic approaches

Les progrès de la thérapie antirétrovirale ont transformé l'infection par le VIH d'une condition inévitablement fatale à une maladie chronique. En dépit de ce succès, l'échec thérapeutique et la toxicité médicamenteuse restent fréquents. Une réponse inadéquate au traitement est clairement multifactorielle et une individualisation de la posologie des médicaments qui se baserait sur les facteurs démographiques et génétiques des patients et sur les taux sanguins totaux, libres et/ou cellulaires des médicaments pourrait améliorer à la fois l'efficacité et la tolérance de la thérapie, cette dernière étant certainement un enjeu majeur pour un traitement qui se prend à vie.L'objectif global de cette thèse était de mieux comprendre les facteurs pharmacocinétiques (PK) et pharmacogénétiques (PG) influençant l'exposition aux médicaments antirétroviraux (ARVs) nous offrant ainsi une base rationnelle pour l'optimisation du traitement antiviral et pour l'ajustement posologique des médicaments chez les patients VIH-positifs. Une thérapie antirétrovirale adaptée au patient est susceptible d'augmenter la probabilité d'efficacité et de tolérance à ce traitement, permettant ainsi une meilleure compliance à long terme, et réduisant le risque d'émergence de résistance et d'échec thérapeutique.A cet effet, des méthodes de quantification des concentrations plasmatiques totales, libres et cellulaires des ARVs ainsi que de certains de leurs métabolites ont été développées et validées en utilisant la chromatographie liquide coupée à la spectrométrie de masse en tandem. Ces méthodes ont été appliquées pour la surveillance des taux d'ARVs dans diverses populations de patients HIV-positifs. Une étude clinique a été initiée dans le cadre de l'étude VIH Suisse de cohorte mère-enfant afin de déterminer si la grossesse influence la cinétique des ARVs. Les concentrations totales et libres du lopînavir, de l'atazanavir et de la névirapine ont été déterminées chez les femmes enceintes suivies pendant leur grossesse, et celles-ci ont été trouvées non influencées de manière cliniquement significative par la grossesse. Un ajustement posologique de ces ARVs n'est donc pas nécessaire chez les femmes enceintes. Lors d'une petite étude chez des patients HIV- positifs expérimentés, la corrélation entre l'exposition cellulaire et plasmatique des nouveaux ARVs, notamment le raltégravir, a été déterminée. Une bonne corrélation a été obtenue entre taux plasmatiques et cellulaires de raltégravir, suggérant que la surveillance des taux totaux est un substitut satisfaisant. Cependant, une importante variabilité inter¬patient a été observée dans les ratios d'accumulation cellulaire du raltégravir, ce qui devrait encourager des investigations supplémentaires chez les patients en échec sous ce traitement. L'efficacité du suivi thérapeutique des médicaments (TDM) pour l'adaptation des taux d'efavirenz chez des patients avec des concentrations au-dessus de la cible thérapeutique recommandée a été évaluée lors d'une étude prospective. L'adaptation des doses d'efavirenz basée sur le TDM s'est montrée efficace et sûre, soutenant l'utilisation du TDM chez les patients avec concentrations hors cible thérapeutique. L'impact des polymorphismes génétiques des cytochromes P450 (CYP) 2B6, 2A6 et 3A4/5 sur la pharmacocinétique de l'efavirenz et de ces métabolites a été étudié : un modèle de PK de population intégrant les covariats génétiques et démographiques a été construit. Les variations génétiques fonctionnelles dans les voies de métabolisation principales (CYP2B6) et accessoires {CYP2A6et 3A4/S) de l'efavirenz ont un impact sur sa disposition, et peuvent mener à des expositions extrêmes au médicament. Un? ajustement des doses guidé par le TDM est donc recommandé chez ces patients, en accord avec les polymorphismes génétiques.Ainsi, nous avons démonté qu'en utilisant une approche globale tenant compte à la fois des facteurs PK et PG influençant l'exposition aux ARVs chez les patients infectés, il est possible, si nécessaire, d'individualiser la thérapie antirétrovirale dans des situations diverses. L'optimisation du traitement antirétroviral contribue vraisemblablement à une meilleure efficacité thérapeutique à iong terme tout en réduisant la survenue d'effets indésirables.Résumé grand publicOptimisation de la thérapie antirétrovirale: approches pharmacocinétiques et pharmacogénétiquesLes progrès effectués dans le traitement de l'infection par le virus de llmmunodéficienoe humaine acquise (VIH) ont permis de transformer une affection mortelle en une maladie chronique traitable avec des médicaments de plus en plus efficaces. Malgré ce succès, un certain nombre de patients ne répondent pas de façon optimale à leur traitement etyou souffrent d'effets indésirables médicamenteux entraînant de fréquentes modifications dans leur thérapie. Il a été possible de mettre en évidence que l'efficacité d'un traitement antirétroviral est dans la plupart des cas corrélée aux concentrations de médicaments mesurées dans le sang des patients. Cependant, le virus se réplique dans la cellule, et seule la fraction des médicaments non liée aux protéines du plasma sanguin peut entrer dans la cellule et exercer l'activité antirétrovirale au niveau cellulaire. Il existe par ailleurs une importante variabilité des concentrations sanguines de médicament chez des patients prenant pourtant la même dose de médicament. Cette variabilité peut être due à des facteurs démographiques et/ou génétiques susceptibles d'influencer la réponse au traitement antirétroviral.Cette thèse a eu pour objectif de mieux comprendre les facteurs pharmacologiques et génétiques influençant l'efficacité et ta toxicité des médicaments antirétroviraux, dans le but d'individualiser la thérapie antivirale et d'améliorer le suivi des patients HIV-positifs.A cet effet, des méthodes de dosage très sensibles ont été développées pour permettre la quantification des médicaments antirétroviraux dans le sang et les cellules. Ces méthodes analytiques ont été appliquées dans le cadre de diverses études cliniques réalisées avec des patients. Une des études cliniques a recherché s'il y avait un impact des changements physiologiques liés à la grossesse sur les concentrations des médicaments antirétroviraux. Nous avons ainsi pu démontrer que la grossesse n'influençait pas de façon cliniquement significative le devenir des médicaments antirétroviraux chez les femmes enceintes HIV- positives. La posologie de médicaments ne devrait donc pas être modifiée dans cette population de patientes. Par ailleurs, d'autres études ont portés sur les variations génétiques des patients influençant l'activité enzymatique des protéines impliquées dans le métabolisme des médicaments antirétroviraux. Nous avons également étudié l'utilité d'une surveillance des concentrations de médicament (suivi thérapeutique) dans le sang des patients pour l'individualisation des traitements antiviraux. Il a été possible de mettre en évidence des relations significatives entre l'exposition aux médicaments antirétroviraux et l'existence chez les patients de certaines variations génétiques. Nos analyses ont également permis d'étudier les relations entre les concentrations dans le sang des patients et les taux mesurés dans les cellules où le virus HIV se réplique. De plus, la mesure des taux sanguins de médicaments antirétroviraux et leur interprétation a permis d'ajuster la posologie de médicaments chez les patients de façon efficace et sûre.Ainsi, la complémentarité des connaissances pharmacologiques, génétiques et virales s'inscrit dans l'optique d'une stratégie globale de prise en charge du patient et vise à l'individualisation de la thérapie antirétrovirale en fonction des caractéristiques propres de chaque individu. Cette approche contribue ainsi à l'optimisation du traitement antirétroviral dans la perspective d'un succès du traitement à long terme tout en réduisant la probabilité des effets indésirables rencontrés. - The improvement in antirétroviral therapy has transformed HIV infection from an inevitably fatal condition to a chronic, manageable disease. However, treatment failure and drug toxicity are frequent. Inadequate response to treatment is clearly multifactorial and, therefore, dosage individualisation based on demographic factors, genetic markers and measurement of total, free and/or cellular drug level may increase both drug efficacy and tolerability. Drug tolerability is certainly a major issue for a treatment that must be taken indefinitely.The global objective of this thesis aimed at increasing our current understanding of pharmacokinetic (PK) and pharmacogenetic (PG) factors influencing the exposition to antirétroviral drugs (ARVs) in HIV-positive patients. In turn, this should provide us with a rational basis for antiviral treatment optimisation and drug dosage adjustment in HIV- positive patients. Patient's tailored antirétroviral regimen is likely to enhance treatment effectiveness and tolerability, enabling a better compliance over time, and hence reducing the probability of emergence of viral resistance and treatment failure.To that endeavour, analytical methods for the measurement of total plasma, free and cellular concentrations of ARVs and some of their metabolites have been developed and validated using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. These assays have been applied for the monitoring of ARVs levels in various populations of HIV- positive patients. A clinical study has been initiated within the frame of the Mother and Child Swiss HIV Cohort Study to determine whether pregnancy influences the exposition to ARVs. Free and total plasma concentrations of lopinavir, atazanavir and nevirapine have been determined in pregnant women followed during the course of pregnancy, and were found not influenced to a clinically significant extent by pregnancy. Dosage adjustment for these drugs is therefore not required in pregnant women. In a study in treatment- experienced HIV-positive patients, the correlation between cellular and total plasma exposure to new antirétroviral drugs, notably the HIV integrase inhibitor raltegravir, has been determined. A good correlation was obtained between total and cellular levels of raltegravir, suggesting that monitoring of total levels are a satisfactory. However, significant inter-patient variability was observed in raltegravir cell accumulation which should prompt further investigations in patients failing under an integrase inhibitor-based regimen. The effectiveness of therapeutic drug monitoring (TDM) to guide efavirenz dose reduction in patients having concentrations above the recommended therapeutic range was evaluated in a prospective study. TDM-guided dosage adjustment of efavirenz was found feasible and safe, supporting the use of TDM in patients with efavirenz concentrations above therapeutic target. The impact of genetic polymorphisms of cytochromes P450 (CYP) 2B6, 2A6 and 3A4/5 on the PK of efavirenz and its metabolites was studied: a population PK model was built integrating both genetic and demographic covariates. Functional genetic variations in main (CYP2B6) and accessory (2A6, 3A4/5) metabolic pathways of efavirenz have an impact on efavirenz disposition, and may lead to extreme drug exposures. Dosage adjustment guided by TDM is thus required in those patients, according to the pharmacogenetic polymorphism.Thus, we have demonstrated, using a comprehensive approach taking into account both PK and PG factors influencing ARVs exposure in HIV-infected patients, the feasibility of individualising antirétroviral therapy in various situations. Antiviral treatment optimisation is likely to increase long-term treatment success while reducing the occurrence of adverse drug reactions.

Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow-derived mesenchymal stem cells

SUMMARY : Ewing's sarcoma is a member of Ewing's family tumors (ESPY) and the second most common solid bone and soft tissue malignancy of children and young adults. It is associated in 85% of cases with the t(11;22)(q24:q12) chromosomal translocation that generates fusion of the 5' segment of the EWSR1 gene with the 3' segment of the ETS family gene FLI-1. The EWSR1-FLI-1 fusion protein behaves as an aberrant transcriptional activator and is believed to contribute to ESFT development. However, EWSR1-FLI-1 induces growth arrest and apoptosis in normal fibroblasts, and primary cells that are pemissive for its putative oncogenic properties have not been discovered, hampering basic understanding of ESFT biology. Here, we show that EWSR1-FLI-1 alone can transform mouse primary bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and generate tumors that display hallmarks of Ewing's sarcoma, including a small round cell phenotype, expression of ESFT-associated markers, insulin like growth factor-I dependence, and induction or repression of numerous EWSR1-FLI-1 target genes. Consistent with this finding, we tested the possibility that human mesenchymal stem cells (hMSC) might also provide a permissive cellular environment for EWSR1-FLI-1, and could represent the first adequate primary human cellular background for the oncogenic properties of the fusion protein. Indeed, expression of EWSR1-FLI-1 in human mesenchymal stem cells (hMSC) was not only stably maintained without inhibiting proliferation, but induced a gene expression profile bearing striking similarity to that of ESFT, including genes that are among the highest ESFT discriminators. Expression of EWSR1-FLI-1 in hMSCs may recapitulate the initial steps of Ewing's sarcoma development, allowing identification of genes that play an important role early in its pathogenesis. Among relevant candidate transcripts induced by EWSR1-FL/-1 in hMSC we found the polycomb group gene EZH2 which we show to play a critical role in Ewing's sarcoma growth. These observations provide the first identification of candidate primary cells from which ESFTs originate and suggest that EWSR1-FLI-1 expression may constitute the initiating event in ESFT pathogenesis. Le sarcome d' Ewing est un membre de la famille des tumeurs Ewing (ESFT) et représente la deuxième tumeur maligne solide de l'os et des tissus mous chez les enfants et les jeunes adultes. Cette tumeur est associée dans 85% des cas avec la translocation chromosomique t(11;22)(g24:g12), qui génère la fusion entre le segment 5' du gène EWSR1 avec le segment 3' du gène FLI-1, appartenant à la famille des facteurs de transcription ETS. La protéine de fusion EWSR1-FLI-1 qui en dérive joue le rSle d'un facteur de transcription aberrant, et est supposée contribuer de manière décisive au processus de développement des ESFTs. Néanmoins, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des fibroblastes normaux induit un arrêt de croissance et leur apoptose, et les cellules primaires permissives pour les propriétés oncogéniques attribuées à la translocation n'ont pas encore été identifiées, empêchant la compréhension de la biologie de base du sarcome d'Ewing. Dans ce travail on montre que l'expression de EWSR1-FLI-1 uniquement est capable de transformer des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de la souris, pour générer des tumeurs qui présentent les caractéristiques du sarcome d' Ewing humain, et notamment une morphologie de petites cellules bleues et rondes, l'expression de marqueurs associés aux ESFTs, une dépendance du facteur de croissance IGF-1, et l'induction ou la répression de nombreux gènes cibles connus de EWSR1-FLI-1. Sur la base de ces observations, on a testé la possibilité que les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) puissent aussi fournir un environnement cellulaire permissif pour EWSR1-FLI-1 ; et représenter le premier background cellulaire humain adéquat pour la manifestation du pouvoir oncogénique de la protéine de fusion. En effet, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des cellules souches mésenchymateuses humaines s'est révélée non seulement maintenue, mais elle a induit un profil d'expression génétique étonnamment similaire à celui des ESFTs humains, incluant les gènes qui ont été rapportés comme étant les plus discriminatifs pour ces tumeurs. L'expression de EWSR1-FLI-1 dans les hMSCs pourrait récapituler les étapes initiales du développement du sarcome d' Ewing, et de ce fait consentir à identifier les gènes qui jouent un rôle crucial dans sa pathogenèse précoce. Parmi les transcrits relevant indults par EWSR1-FL/-9 dans les hMSCs nous avons découvert le gène du groupe des polycomb EZH2, que nous avons par la suite démontré jouer un rôle essentiel dans la croissance du sarcome de Ewing. Ces observations apportent pour la première fois l'identification d'une cellule primaire candidate pour représenter la cellule d'origine des ESFTs, et en même temps suggèrent que l'expression de EWSR1-FLI-1 peut constituer l'événement initial dans la pathogenèse du sarcome d' Ewing.

The role of Pten in the Hematopoietic System and the Hematopoietic Stem Cells

Résumé Identification, localisation et activation des cellules souches hématopoiétiques dormantes in vivo Les cellules souches somatiques sont présentes dans la majorité des tissus régénératifs comme la peau, l'épithélium intestinal et le système hématopoiétique. A partir d'une seule cellule, elles ont les capacités de produire d'autres cellules souches du même type (auto-renouvellement) et d'engendrer un ensemble défini de cellules progénitrices différenciées qui vont maintenir ou réparer leur tissu hôte. Les cellules souches adultes les mieux caractérisées sont les cellules souches hématopoiétiques (HSC), localisées dans la moelle osseuse. Un des buts de mon travail de doctorat était de caractériser plus en profondeur la localisation des HSCs endogènes in vivo. Pour ce faire, la technique "label retaining assay", se basant sur la division peu fréquentes et sur la dormance des cellules souches, a été utilisée. Après un marquage des souris avec du BrdU (analogue à l'ADN) suivi d'une longue période sans BrdU, les cellules ayant incorporés le marquage ("label retaining cells" LCRs) ont pu être identifiées dans la moelle osseuse. Ces cellules LCRs étaient enrichies 300 fois en cellules de phenotype HSC et, en utilisant de la cytofluorométrie, il a pu être montré qu'environ 15% de toutes les HSCs d'une souris restent dormantes durant plusieures semaines. Ces HSCs dormantes à long terme ne sont probablement pas impliquées dans la maintenance de 'hématopoièse. Par contre, on assiste à l'activation rapide de ces HSCs dormantes lors d'une blessure, comme une ablation myéloide. Elles re-entrent alors en cycle cellulaire et sont essentielles pour une génération rapide des cellules progénitrices et matures qui vont remplacer les cellules perdues. De plus, la détection des LCRs, combinée avec l'utilisation du marqueur de HSCs c-kit, peut être utilisée pour la localisation des HSCs dormantes présentes dans la paroi endostéale de la cavité osseuse. De manière surprenante, les LCRs c-kit+ ont surtout étés trouvées isolées en cellule unique, suggérant que le micro-environement spécifique entourant et maintenant les HSCs, appelé niche, pourrait être très réduit et abriter une seule HSC par niche. Rôles complexes du gène supresseur de tumeur Pten dans le système hématopoiétique La phosphatase PTEN disparaît dans certains cancers héréditaires ou sporadiques humains, comme les gliomes, les cancers de l'utérus ou du sein. Pten inhibe la voie de signalisation de la PI3-kinase et joue un rôle clé dans l'apoptose, la croissance, la prolifération et la migration cellulaire. Notre but était d'étudier le rôle de Pten dans les HSC normale et durant la formation de leucémies. Pour ce faire, nous avons généré un modèle murin dans lequel le gène Pten peut être supprimé dans les cellules hématopoiétiques, incluant les HSCs. Ceci a été possible en croissant l'allèle conditionnelle ptenflox soit avec le transgène MxCre inductible par l'interféron α soit avec le transgène Scl-CreERt inductible par le tamoxifen. Ceci permet la conversion de l'allèle ptenflox en l'allèle nul PtenΔ dans les HSCs et les autres types cellulaires hématopoiétiques. Les souris mutantes Pten développent une splénomégalie massive causée par une expansion dramatiques de toutes les cellules myéloides. De manière interessante, alors que le nombre de HSCs dans la moelle osseuse diminue progressivement, le nombre des HSCs dans la rate augmente de manière proportionnelle. Etrangement, les analyses de cycle cellulaire ont montrés que Pten n'avait que peu ou pas d'effet sur la dormance des HSCs ou sur leur autorenouvellement. En revanche, une augmentation massive du niveau de la cytokine de mobilisation G-CSF a été détéctée dans le serum sanguin, suggérant que la suppression de Pten stimulerait la mobilisation et la migration des HSC de la moelle osseuse vers la rate. Finallement, la transplantation de moelle osseuse délétée en Pten dans des souris immuno-déficientes montre que Pten fonctionnerait comme un suppresseur de tumeur dans le système hématopoiétique car son absence entraîne la formation rapide de leucémies lymphocytaires. Summary Identification, localization and activation of dormant hematopoietic stun cells in vivo Somatic stem cells are present in most self-renewing tissues including the skin, the intestinal epithelium and the hematopoietic system. On a single cell basis they have the capacity to produce more stem cells of the same phenotype (self-renewal) and to give rise to a defined set of mature differentiated progeny, responsible for the maintenance or repair of the host tissue. The best characterized adult stem cell is the hematopoietic stem cell (HSC) located in the bone marrow. One goal of my thesis work was to further characterize the location of endogenous HSCs in vivo. To do this, a technique called "label retaining assay» was used which takes advantage of the fact that stem cells (including HSCs) divide very infrequently and can be dormant for months. After labeling mice with the DNA analogue BrdU followed by a long BrdU free "chase", BrdU "label retaining cells" (CRCs) could be identified in the bone marrow. These CRCs were 300-fold enriched for phenotypic HSCs and by using flow cytometry analysis it could be shown that about 15% of all HSCs in the mouse are dormant for many weeks. Our results suggest that these long-term dormant HSCs are unlikely to be involved in homeostatic maintenance. However they are rapidly activated and reenter the cell cycle in response to injury signals such as myeloid ablation. In addition, detection of LRCs in combination with the HSC marker c-Kit could be used to locate engrafted dormant HSCs close to the endosteal lining of the bone marrow cavities. Most surprisingly, c-Kit+LRCs were found predominantly as single cells suggesting that the specific stem cell maintaining microenvironment, called niche, has limited space and may house only single HSCs. Complex roles of the tumor suppressor gene Pten in the hematopoietic system. The phosphatase PTEN is lost in hereditary and sporadic forms of human cancers, including gliomas, endometrial and breast cancers. Pten inhibits the PI3-kina.se pathway and plays a key role in apoptosis, cell growth, proliferation and migration. Our aim was to study the role of Pten in normal HSCs and during leukemia formation. To do this, we generated a mouse model in which the Pten gene can be deleted in hematopoietic cells including HSCs. This was achieved by crossing the conditional ptenflox allele with either the interferona inducible MxCre or the tamoxifen inducible Scl-CreERT transgene. This allowed the conversion of the ptenflox allele into a pterr' null allele in HSCs and other hematopoietic cell types. As a result Pten mutant mice developed massive splenomegaly due to a dramatic expansion of all myeloid cells. Interestingly, while the number of bone marrow HSCs progressively decreased, the number of HSCs in the spleen increased to a similar extent. Unexpectedly, extensive cell cycle analysis showed that Pten had little or no effect on HSC dormancy or HSC self-renewal. Instead, dramatically increased levels of the mobilizing cytokine G-CSF were detected in the blood serum suggesting that loss-of Pten stimulates mobilization and migration of HSC from the BM to the spleen. Finally, transplantation of Pten deficient BM cells into immuno-compromised mice showed that Pten can function as a tumor suppressor in the hematopoietic system and that its absence leads to the rapid formation of T cell leukemia.

Role of NOX enzymes in phagocyte response and signaling upon Chlamydia infection

Les membres de l'ordre des Chlamydiales peuvent infecter un choix étendu d'animaux, insectes, et protistes. Comme toutes bactéries intracellulaires obligatoires, les Chlamydiales ont besoin d'une cellule hôte pour se répliquer. Chaque fois qu'une cellule est infectée une lutte commence entre les mécanismes de défense de la cellule et l'arsenal de facteurs de virulence de la bactérie. Dans cette thèse nous nous sommes intéressés à déterminer le rôle de deux mécanismes de l'immunité innée de l'hôte. En premier, nous avons étudié les NADPH oxidases, une source de molécules superoxydantes (MSO). Leur rôle dans la restriction de la réplication de Waddlia chondrophila et Estrella iausannensis a été étudié dans l'organisme modèle Dictyostelium discoideum et les macrophages humains. Différentes protéines Nox étaient nécessaires pour contrôler la réplication de W. chondrophila ou E. Iausannensis. De plus, nous avons déterminé que parmi les Chlamydiales, cinq espèces possédaient une catalase. Cette enzyme peut dégrader l'eau oxygénée, une MSO. L'activité de la catalase a été démontrée in vitro et dans les corps élémentaires. Avant de pouvoir étudier le rôle de NOX2 dans des macrophages infectés avec E. Iausannensis, nous avons dû établir la capacité de la bactérie à se répliquer clans les macrophages avec son trafic intracellulaire. Le deuxième mécanisme d'immunité innée que nous avons étudié est l'autophagie. Dans les cellules infectées l'autophagie permet de digérer les bactéries envahissantes. Deux protéines de la voie autophagique (Atg1 et Atg8) jouent un rôle dans la restriction de la croissance de W. chondrophila dans D. discoideum. D'avantage d'études sur l'immunité innée et les bactéries apparentés aux Chlamydia sont indispensables, car les réponses paraissent être spécifiques pour chaque espèce. - Members of the Chlamydiales order are able to infect a large variety of animals, insects, and protists. These obligate intracellular bacteria require a host cell for replication. Each time a cell is infected a struggle begins between the virulence arsenal of the bacteria and the defense mechanisms activated by the host. Each bacterial species will exhibit a selection of virulence factors that will allow it to overcome the defense of the host in some species, but not others. In this thesis we were interested in dissecting the role of two host innate immunity mechanisms. First we determined the role of NADPH oxidases, a source of reactive oxygen species (ROS), in restricting replication of Waddlia chondrophila and EstreHa lausannensis in the model organism Dictyostelium discoideum and human macrophages. Different Nox proteins were required to restrict growth of W. chondrophila and E. lausannensis. Additionally, we determined that five Chlamydia- related bacterial species encode for catalase, an enzyme that is able to degrade hydrogen peroxide, a ROS. The activity of the catalase was demonstrated in vitro and in elementary bodies. To study the role of NOX2 in macrophages for E. lausannensis we first had to determine the ability of E. lausannensis to grow in macrophages. Besides demonstrating its replication we also determined the intracellular trafficking of E. lausannensis. The second innate immunity mechanism studied was autophagy. Through autophagy bacteria can be targeted to degradation. Atg1 and Atg8, two autophagic proteins appeared restrict W. chondrophila replication in D. discoideum. More studies on innate immunity and Chlamydia-related bacteria are required. It appears that the responses to innate immunity are species specific and it will be difficult to generalize data obtained for W. chondrophila to the Chlamydiales order.

Experimental approaches in the targeting of photodynamic therapeutics

RÉSUMÉ : Chez l'homme, le manque de sélectivité des agents thérapeutiques représente souvent une limitation pour le traitement des maladies. Le ciblage de ces agents pour un tissu défini pourrait augmenter leur sélectivité et ainsi diminuer les effets secondaires en comparaison d'agents qui s'accumuleraient dans tout le corps. Cela pourrait aussi améliorer l'efficacité des traitements en permettant d'avoir une concentration localisée plus importante. Le ciblage d'agents thérapeutiques est un champ de recherche très actif. Les stratégies sont généralement basées sur les différences entre cellules normales et malades. Ces différences peuvent porter soit sur l'expression des molécules à leurs surfaces comme des récepteurs ou des transporteurs, soit sur les activités enzymatiques exprimées. Le traitement thérapeutique choisi ici est la thérapie photodynamique et est déjà utilisé pour le traitement de certains cancers. Cette thérapie repose sur l'utilisation de molécules qui réagissent à la lumière, les photosensibilisants. Elles absorbent l'énergie lumineuse et réagissent avec l'oxygène pour former des radicaux toxiques pour les cellules. Les photosensibilisants utilisés ici sont de deux natures : (i) soit ils sont tétrapyroliques (comme les porphyrines et chlorines), c'est à dire qu'ils sont directement activables par la lumière ; (ii) soit ce sont des prodrogues de photosensibilisants comme l'acide 5aminolévulinique (ALA) qui est transformé dans la cellule en protoporphyrine IX photosensibilisante. Dans le but d'augmenter la sélectivité des photosensibilisants, nous avons utilisé deux stratégies différentes : (i) le photosensibilisant est modifié par le greffage d'un agent de ciblage ; (ii) le photosensibilisant est incorporé dans des structures moléculaires de quelques centaines de nanomètres. Les sucres et l'acide folique sont des agents de ciblage largement établis et ont été utilisés ici car leurs récepteurs sont surexprimés à la surface de nombreuses cellules malades. Ainsi, des dérivés sucres ou acide folique de l'ALA ont été synthétisés et évalués in vitro sur de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses. La stratégie utilisant l'acide folique est apparue incompatible avec l'utilisation de l'ALA puisque aucune photosensibilité n'a été induite par le composé. La stratégie utilisant les sucres a, par ailleurs, provoquée de bonnes photosensibilités mais pas d'augmentation de sélectivité. En parallèle, la combinaison entre les propriétés anticancéreuses des complexes métalliques au ruthénium avec les propriétés photosensibilisantes des porphyrines, a été évaluée. En effet, les thérapies combinées ont émergé il y a une dizaine d'années et représentent aujourd'hui de bonnes alternatives aux monothérapies classiques. Des ruthenium(I1)-arènes complexés avec la tetrapyridylporphyrine ont ainsi présenté de bonnes cytotoxicités et de bonnes phototoxicités pour des cellules de mélanomes. Des porphyrines ont aussi été compléxées avec des noyaux de diruthénium et ce type de dérivé a présenté de bonnes phototoxicités et une bonne sélectivité pour les cellules cancéreuses de l'appareil reproducteur féminin. L'incorporation de photosensibilisants tétrapyroliques a finalement été effectuée en utilisant des nanoparticules (NP) biocompatibles composées de chitosan et de hyaluronate. L'effet de ces NP a été évalué pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde (PR). Les NP ont d'abord été testées in vitro avec des macrophages de souris et les résultats ont mis en évidence de bonnes sélectivités et photosensibilités pour ces cellules. In vivo chez un modèle marin de la PR, l'utilisation de ces NP a révélé un plus grand temps de résidence des NP dans le genou de la souris en comparaison du temps obtenu avec le photosensibilisant seul. Le traitement par PDT a aussi démontré une bonne efficacité par ailleurs égale à celle obtenue avec les corticoïdes utilisés en clinique. Pour finir, les NP ont aussi démontré une bonne efficacité sur les myelomonocytes phagocytaires humains et sur les cellules contenues dans le liquide synovial de patients présentant une PR. Tous ces résultats suggèrent que les deux stratégies de ciblage peuvent être efficaces pour les agents thérapeutiques. Afm d'obtenir de bons résultats, il est toutefois nécessaire de réaliser une analyse minutieuse de la cible et du mode d'action de l'agent thérapeutique. Concernant les perspectives, la combinaison des deux stratégies c'est à dire incorporer des agents thérapeutiques dans des nanostructures porteuses d'agents de ciblage, représente probablement une solution très prometteuse. SUMMARY : In humans, the lack of selectivity of drugs and their high effective concentrations often represent limitations for the treatment of diseases. Targeting the therapeutical agents to a defined tissue could enhance their selectivity and then diminish their side effects when compared to drugs that accumulate in the entire body and could also improve treatment efûciency by allowing a localized high concentration of the agents. Targeting therapeutics to defined cells in human pathologies is a main challenge and a very active field of research. Strategies are generally based on the different behaviors and patterns of expression of diseased cells compared to normal cells such as receptors, proteases or trans-membrane carriers. The therapeutic treatment chosen here is the photodynamic therapy and is already used in the treatment of many cancers. This therapy relies on the administration of a photosensitizer (PS) which will under light, react with oxygen and induce formation of reactive oxygen species which are toxic for cells. The PSs used here are either tetrapyrolic (i. e. porphyries and chlorins) or prodrugs of PS (5-aminolevulinic acid precursor of the endogenous protoporphyrin Imo. In order to improve PS internalization and selectivity, we have used two different strategies: the modification of the PSs with diseased cell-targeting agents as well as their encapsulation into nanostructures. Sugars and folic acid are well established as targeting entities for diseased cells and were used here since their transporters are overexpressed on the surface of many cancer cells. Therefore sugar- and folic acid-derivatives of 5-aminolevulinic acid (ALA) were synthesized and evaluated in vitro in several cancer cell lines. The folic acid strategy appeared to be incompatible with ALA since no photosensitivity was induced while the strategy with sugars induced good photosensitivites but no increase of selectivity. Alternatively, the feasibility of combining the antineoplastic properties of ruthenium complexes with the porphyrin's photosensitizing properties, was evaluated since combined therapies have emerged as good alternatives to classical treatments. Tetrapyridylporphyrins complexed to ruthenium (I17 arenes presented good cytotoxicities and good phototoxicities toward melanoma cells. Porphyries were also complexed to diruthenium cores and this type of compound presented good phototoxicities and good selectivity for female reproductive cancer cells. The encapsulation of tetrapyrolic PSs was finally investigated using biocompatible nanogels composed of chitosan and hyaluronate. The behavior of these nanoparticles was evaluated for the treatment of rheumatoid arthritis (RA). They were first tested in vitro in mouse macrophages and results revealed good selectivities and phototoxicities toward these cells. In vivo in mice model of RA, the use of such nanoparticles instead of free PS showed longer time of residence in mice knees. Photodynamic protocols also demonstrated good efficiency of the treatment comparable to the corticoid injection used in the clinic. Finally our system was also efficient in human cells using phagocytic myelomonocytes or using cells of synovial fluids taken from patients with RA. Altogether, these results revealed that both strategies of modification or encapsulation of drugs can be successful in the targeting of diseased cells. However, a careful analysis of the target and of the mode of action of the drug, are needed in order to obtain good results. Looking ahead to the future, the combination of the two strategies (i.e. drugs loaded into nanostructures bearing the targeting agents) would represent probably the best solution.

Genomics of "chlamydia"-related bacteria

AbstractThe Chlamydiales order is an important bacterial phylum that comprises some of the most successful human pathogens such as Chlamydia trachomatis, the leading infectious cause of blindness worldwide. Since some years, several new bacteria related to Chlamydia have been discovered in clinical or environmental samples and might represent emerging pathogens. The genome sequencing of classical Chlamydia has brought invaluable information on these obligate intracellular bacteria otherwise difficult to study due to the lack of tools to perform basic genetic manipulation. The recent emergence of high-throughput sequencing technologies yielding millions of reads in a short time lowered the costs of genome sequencing and thus represented a unique opportunity to study Chlamydia-re\ated bacteria. Based on the sequencing and the analysis of Chlamydiales genomes, this thesis provides significant insights into the genetic determinants of the intracellular lifestyle, the pathogenicity, the metabolism and the evolution of Chlamydia-related bacteria. A first approach showed the efficacy of rapid sequencing coupled to proteomics to identify immunogenic proteins. This method, particularly useful for an emerging pathogen such as Parachlamydia acanthamoebae, enabled us to discover good candidates for the development of diagnostic tools that would permit to evaluate at larger scale the role of this bacterium in disease. Second, the complete genome of Waddlia chondrophila, a potential agent of miscarriage, encodes numerous virulence factors to manipulate its host cell and resist to environmental stresses. The reconstruction of metabolic pathways showed that the bacterium possesses extensive capabilities compared to related organisms. However, it is still incapable of synthesizing some essential components and thus has to import them from its host. Third, the genome comparison of Protochlamydia naegleriophila to its closest known relative Protochlamydia amoebophila revealed a particular evolutionary dynamic with the occurrence of an unexpected genome rearrangement. Fourth, a phylogenetic analysis of P. acanthamoebae and Legionella drancourtii identified several genes probably exchanged by horizontal gene transfer with other intracellular bacteria that might occur within their amoebal host. These genes often encode mechanisms for resistance to metal or toxic compounds. As a whole, the analysis of the different genomes enabled us to highlight a large diversity in size, GC percentage, repeat content as well as plasmid organization. The abundant genomic data obtained during this thesis have a wide impact since they provide the necessary bases for detailed investigations on countless aspects of the biology and the evolution of Chlamydia-related bacteria, whether in wet lab or by bioinformatical analyses.RésuméL'ordre des Chlamydiales est un important phylum bactérien qui comprend de nombreuses espèces pathogènes pour l'homme et les animaux, dont Chlamydia trachomatis, responsable du trachome, la cause majeure de cécité d'origine infectieuse à travers le monde. Durant ces dernières décennies, de nombreuses bactéries apparentées aux Chlamydia ont été découvertes dans des échantillons environnementaux ou cliniques mais leur éventuel rôle pathogène dans le développement de maladies reste peu connu. Ces bactéries sont des intracellulaires obligatoires car elles ont besoin d'une cellule hôte pour se multiplier, ce qui rend leur étude particulièrement difficile. Le développement de nouvelles technologies permettant de séquencer le génome d'un organisme rapidement et à moindre coût ainsi que l'essor des méthodes d'analyse s'y rapportant représentent une opportunité exceptionnelle d'étudier ces organismes. Dans ce contexte, cette thèse démontre l'utilité de la génomique pour développer de nouveaux outils diagnostiques ainsi que pour étudier le métabolisme de ces bactéries, leurs facteurs de virulence et leur évolution.Ainsi, une première approche a illustré l'utilité d'un séquençage rapide pour obtenir les informations nécessaires à l'identification de protéines qui sont reconnues par des anticorps humains ou animaux. Cette méthode, particulièrement utile pour un pathogène émergent tel que Parachlamydia acanthamoebae, a permis de découvrir de bons candidats pour le développement d'un outil diagnostique qui permettrait d'évaluer à plus large échelle le rôle de cette bactérie notamment dans la pneumonie. L'analyse du contenu génique de Waddlia chondrophila, un autre germe qui pourrait être impliqué dans les avortements et tes fausses-couches, a en outre mis en évidence la présence de nombreux facteurs connus qui lui permettent de manipuler son hôte. Cette bactérie possède de plus grandes capacités métaboliques que les autres Chlamydia, mais elle est incapable de synthétiser certains composants et doit donc les importer de son hôte pour subvenir à ses besoins. La comparaison du génome de Protochlamydia naegleriophila à son plus proche parent, Protochlamydia amoebophila, a dévoilé une évolution dynamique particulière avec l'occurrence d'un réarrangement majeur inattendu après la séparation de ces deux espèces. En outre, ces études ont montré l'occurrence de plusieurs transferts de gène avec d'autres organismes plus éloignés, notamment d'autres intracellulaires d'amibes, souvent pour l'acquisition de mécanismes de résistances à des composés toxiques. Les données génomiques acquises durant ce travail posent les fondements nécessaires a de nombreuses analyses qui permettront progressivement de mieux comprendre de nombreux aspects de ces bactéries fascinantes.

Characterization of the effects of IL-17F on CHO cell line generation

CHO is the most commonly used mammalian host for the generation of cell lines allowing for the production of high quality therapeutic proteins. The generation of such cell lines is a lengthy and resource-intensive process requiring extensive screening in order to isolate candidates with optimal characteristics, such as growth, stability and productivity. For this reason, the biotechnology industry invests much effort in attempts to optimize CHO expression systems in order to streamline and shorten the cell line selection process. Based on preliminary observations of a facilitated selection of CHO-GS cell lines expressing members of the IL-17 cytokine family, this study investigates the use of IL-17F as a novel enhancing factor for CHO cell line generation. Using two different CHO expression systems (exploiting GS and DHFR-based selection), we demonstrated that IL-17F expression caused a significant increase in the occurrence of colonies during the selection process. All colonies selected produced substantial amounts of IL-17F, suggesting that benefits were conferred, during selection, to those cells expressing the cytokine. Furthermore, transgene expression levels were significantly increased when the selection pressure was raised to a level that would not normally be permissive for colony selection (i.e. 100 |o.M MSX for the CHO-GS expression system or 1000 nM MTX for the CHO-DHFR system). Finally, IL-17F expression was also found to enhance the rate of appearance of clones during single cell subcloning in the absence of selection pressure. Overall, these benefits have the potential to allow a substantial reduction in the length of cell line generation while significantly increasing cell line productivity. Nevertheless, we found that the high IL-17F expression levels required to convey enhancing effects was a limitation when attempting to co-express IL-17F and a recombinant soluble protein of therapeutic interest from independent CMV promoters within the same expression vector. In order to understand and overcome this limitation, studies were designed to characterize the IL-17F enhancing effect at the molecular and cellular level. Regular supplementation of recombinant biologically-active IL-17F into the culture medium during cell line selection was not able to reproduce the enhancing effects of endogenous IL-17F expression. In addition, increased IL-17F expression correlated with increased CHO-GS selection transgene expression at the single cell level. This data suggested a possible effect of IL-17F on viral promoter activity or transgene mRNA stability. It also provided direct evidence that the cells expressing the highest amounts of IL-17F obtained the most benefit. Overall data obtained from these study implied that IL-17F may act through an intracellular mechanism, possibly exerted during secretion. We therefore initiated experiments designed to determine the specific compartment(s) within which IL-17F triggers its effect. This work has identified IL-17F as a potentially powerful tool to optimize the CHO cell line generation process. The characterization of this enhancing effect at the molecular level has given us several insights into overcoming the current limitations, thus paving the way for the development of a viable technology that can be exploited within the biotechnology industry. - La CHO est la cellule hôte de mammifere la plus couramment utilisée dans la création de lignée cellulaire produisant des protéines thérapeutiques de haute qualité. La génération de ces lignées cellulaires est un processus long et exigeant l'utilisation de techniques de sélection robustes afin d'isoler des candidats possédants les caractéristiques optimales de croissance, de productivité et de stabilité d'expression. Les industries biopharmaceutiques ont investi beaucoup d'efforts afin d'optimiser les systèmes d'expression CHO dans le but raccourcir la longueur du procédé de sélection de lignées cellulaires et aussi d'en augmenter l'efficacité. A partir d'observations préliminaires obtenues lors de la génération de lignées cellulaires CHO- GS exprimant une cytokine appartenant à la famille des IL-17, nous avons réalisé une étude portant sur l'utilisation de l'IL-17F humaine (IL-17F) comme nouveau facteur d'optimisation pour la génération de lignées cellulaires CHO. Nous avons démontré, en utilisant les deux systèmes de sélection et d'expression CHO couramment utilisés (le premier exploitant la GS et l'autre basée sur la DHFR), que l'expression de l'IL-17F permet une augmentation significative de la fréquence d'apparition de colonies durant le processus de sélection de lignées cellulaires. Les différentes colonies sélectionnées expriment des quantités substantielles d'IL-17F, suggérant un effet bénéfique lors de la sélection qui serait exclusivement conféré aux cellules exprimant la cytokine. En outre, le niveau d'expression du transgene se trouve significativement augmenté lorsque la pression de sélection est portée à un niveau habituellement trop élevé pour permettre la sélection de colonies (soit 100 |JM MSX pour le système d'expression CHO-GS ou 1000 nM MTX pour le système CHO- DHFR). Enfin, l'expression d'IL-17F permet également d'améliorer la vitesse d'apparition de clones pendant une étape de sous-clonage en l'absence de pression de sélection. L'ensemble de ces effets bénéfiques permettent une réduction substantielle de la durée de génération de lignées cellulaires tout en augmentant considérablement la productivité des lignées obtenues. Néanmoins, nous avons constaté que la nécessité d'exprimer des niveaux élevés d'IL-17F afin obtenir l'ensemble de ses effets bénéfiques devient une contrainte lors de l'utilisation d'un vecteur d'expression composé de deux promoteurs CMV indépendants pour la co-expression de la cytokine et d'une protéine soluble présentant un intérêt thérapeutique. Afin de mieux comprendre et de surmonter cette limitation, plusieurs études ont été effectuées dans le but de mieux caractériser l'effet de IL-17F au niveau subcellulaire. L'apport régulier en IL-17F recombinante et biologiquement active dans le milieu de culture lors de la sélection de lignées cellulaires ne permet pas de reproduire les effets bénéfiques observés par l'expression endogène d'IL-17F. En outre, nous avons constaté que, lors de l'utilisation du système CHO- GS, l'augmentation d'expression de 1TL-17F est corrélée à un accroissement de l'expression du marqueur de sélection au niveau cellulaire. Ces résultats suggèrent un possible effet d'IL- 17F sur l'activité des promoteurs viraux et ainsi fournissent une preuve directe que les cellules exprimant de haut niveau d'IL-17F sont celles qui en profitent le plus. L'ensemble de ces observations mettrait en avant que l'effet d'IL-17F se ferait selon un mécanisme intracellulaire. Nous avons donc étudié le(s) compartiment(s) spécifique(s) dans lequel IL-17F pourrait exercer son effet. Ce travail a permis de définir IL-17F comme un puissant outil pour l'optimisation des procédés de génération de lignées cellulaires CHO. La caractérisation de cette amélioration de l'effet au niveau moléculaire nous a donné plusieurs indications sur la manière de dépasser les limitations actuelles, ouvrant ainsi la voie au développement d'une technologie viable qui peut être exploitée pars l'industrie biotechnologique.

Systems biology of plants : from intraspecific genome variation to computational morphodynamics

Recently, the introduction of second generation sequencing and further advance-ments in confocal microscopy have enabled system-level studies for the functional characterization of genes. The degree of complexity intrinsic to these approaches needs the development of bioinformatics methodologies and computational models for extracting meaningful biological knowledge from the enormous amount of experi¬mental data which is continuously generated. This PhD thesis presents several novel bioinformatics methods and computational models to address specific biological questions in Plant Biology by using the plant Arabidopsis thaliana as a model system. First, a spatio-temporal qualitative analysis of quantitative transcript and protein profiles is applied to show the role of the BREVIS RADIX (BRX) protein in the auxin- cytokinin crosstalk for root meristem growth. Core of this PhD work is the functional characterization of the interplay between the BRX protein and the plant hormone auxin in the root meristem by using a computational model based on experimental evidence. Hyphotesis generated by the modelled to the discovery of a differential endocytosis pattern in the root meristem that splits the auxin transcriptional response via the plasma membrane to nucleus partitioning of BRX. This positional information system creates an auxin transcriptional pattern that deviates from the canonical auxin response and is necessary to sustain the expression of a subset of BRX-dependent auxin-responsive genes to drive root meristem growth. In the second part of this PhD thesis, we characterized the genome-wide impact of large scale deletions on four divergent Arabidopsis natural strains, through the integration of Ultra-High Throughput Sequencing data with data from genomic hybridizations on tiling arrays. Analysis of the identified deletions revealed a considerable portion of protein coding genes affected and supported a history of genomic rearrangements shaped by evolution. In the last part of the thesis, we showed that VIP3 gene in Arabidopsis has an evo-lutionary conserved role in the 3' to 5' mRNA degradation machinery, by applying a novel approach for the analysis of mRNA-Seq data from random-primed mRNA. Altogether, this PhD research contains major advancements in the study of natural genomic variation in plants and in the application of computational morphodynamics models for the functional characterization of biological pathways essential for the plant. - Récemment, l'introduction du séquençage de seconde génération et les avancées dans la microscopie confocale ont permis des études à l'échelle des différents systèmes cellulaires pour la caractérisation fonctionnelle de gènes. Le degrés de complexité intrinsèque à ces approches ont requis le développement de méthodologies bioinformatiques et de modèles mathématiques afin d'extraire de la masse de données expérimentale générée, des information biologiques significatives. Ce doctorat présente à la fois des méthodes bioinformatiques originales et des modèles mathématiques pour répondre à certaines questions spécifiques de Biologie Végétale en utilisant la plante Arabidopsis thaliana comme modèle. Premièrement, une analyse qualitative spatio-temporelle de profiles quantitatifs de transcripts et de protéines est utilisée pour montrer le rôle de la protéine BREVIS RADIX (BRX) dans le dialogue entre l'auxine et les cytokinines, des phytohormones, dans la croissance du méristème racinaire. Le noyau de ce travail de thèse est la caractérisation fonctionnelle de l'interaction entre la protéine BRX et la phytohormone auxine dans le méristème de la racine en utilisant des modèles informatiques basés sur des preuves expérimentales. Les hypothèses produites par le modèle ont mené à la découverte d'un schéma différentiel d'endocytose dans le méristème racinaire qui divise la réponse transcriptionnelle à l'auxine par le partitionnement de BRX de la membrane plasmique au noyau de la cellule. Cette information positionnelle crée une réponse transcriptionnelle à l'auxine qui dévie de la réponse canonique à l'auxine et est nécessaire pour soutenir l'expression d'un sous ensemble de gènes répondant à l'auxine et dépendant de BRX pour conduire la croissance du méristème. Dans la seconde partie de cette thèse de doctorat, nous avons caractérisé l'impact sur l'ensemble du génome des délétions à grande échelle sur quatre souches divergentes naturelles d'Arabidopsis, à travers l'intégration du séquençage à ultra-haut-débit avec l'hybridation génomique sur puces ADN. L'analyse des délétions identifiées a révélé qu'une proportion considérable de gènes codant était affectée, supportant l'idée d'un historique de réarrangement génomique modelé durant l'évolution. Dans la dernière partie de cette thèse, nous avons montré que le gène VÏP3 dans Arabidopsis a conservé un rôle évolutif dans la machinerie de dégradation des ARNm dans le sens 3' à 5', en appliquant une nouvelle approche pour l'analyse des données de séquençage d'ARNm issue de transcripts amplifiés aléatoirement. Dans son ensemble, cette recherche de doctorat contient des avancées majeures dans l'étude des variations génomiques naturelles des plantes et dans l'application de modèles morphodynamiques informatiques pour la caractérisation de réseaux biologiques essentiels à la plante. - Le développement des plantes est écrit dans leurs codes génétiques. Pour comprendre comment les plantes sont capables de s'adapter aux changements environnementaux, il est essentiel d'étudier comment leurs gènes gouvernent leur formation. Plus nous essayons de comprendre le fonctionnement d'une plante, plus nous réalisons la complexité des mécanismes biologiques, à tel point que l'utilisation d'outils et de modèles mathématiques devient indispensable. Dans ce travail, avec l'utilisation de la plante modèle Arabidopsis thalicinci nous avons résolu des problèmes biologiques spécifiques à travers le développement et l'application de méthodes informatiques concrètes. Dans un premier temps, nous avons investigué comment le gène BREVIS RADIX (BRX) régule le développement de la racine en contrôlant la réponse à deux hormones : l'auxine et la cytokinine. Nous avons employé une analyse statistique sur des mesures quantitatives de transcripts et de produits de gènes afin de démontrer que BRX joue un rôle antagonisant dans le dialogue entre ces deux hormones. Lorsque ce-dialogue moléculaire est perturbé, la racine primaire voit sa longueur dramatiquement réduite. Pour comprendre comment BRX répond à l'auxine, nous avons développé un modèle informatique basé sur des résultats expérimentaux. Les simulations successives ont mené à la découverte d'un signal positionnel qui contrôle la réponse de la racine à l'auxine par la régulation du mouvement intracellulaire de BRX. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons analysé le génome entier de quatre souches naturelles d'Arabidopsis et nous avons trouvé qu'une grande partie de leurs gènes étaient manquant par rapport à la souche de référence. Ce résultat indique que l'historique des modifications génomiques conduites par l'évolution détermine une disponibilité différentielle des gènes fonctionnels dans ces plantes. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons analysé les données du transcriptome de la plante où le gène VIP3 était non fonctionnel. Ceci nous a permis de découvrir le rôle double de VIP3 dans la régulation de l'initiation de la transcription et dans la dégradation des transcripts. Ce rôle double n'avait jusqu'alors été démontrée que chez l'homme. Ce travail de doctorat supporte le développement et l'application de méthodologies informatiques comme outils inestimables pour résoudre la complexité des problèmes biologiques dans la recherche végétale. L'intégration de la biologie végétale et l'informatique est devenue de plus en plus importante pour l'avancée de nos connaissances sur le fonctionnement et le développement des plantes.

The tumour suppressor LATS2 interacts with both Signalosome and E3 ubiquitin ligases : implications in control of cell cycle progression

SUMMARY LATS2 is a member of the Lats tumour suppressor gene family. The human LATS2 gene is located at chromosome 13q11-12, which has been shown to be a hot spot (67%) for LOH in nonsmall cell lung cancer. Both lats mosaic flies and LATS1 deficient mice spontaneously develop tumours, an observation that is explained by the function of LATS1 in suppressing tumourigenesis by negatively regulating cell proliferation by modulating Cdc2/Cyclin A activity. LATS1 also plays a critical role in maintenance of ploidy through its action on the spindle assembly checkpoint. Initial insights into the function of LATS2 reveals that the protein is involved in the G2/M transition of the cell cycle, whereby it controls the phosphorylation status of Cdc25C. The aim of the present study was to identify LATS2 interacting partners that would provide a more thorough understanding of the molecular pathways in which the protein is involved. The yeast two-hybrid system identified a number of candidate genes that interact with LATS2. Most of the interactions were confirmed biochemically by GST-pull down assays that enabled us to demonstrate that LATS2 is an integral component of the Signalosome complex. The Signalosome is thought to be required for the establishment of functional Cullin-based E3 ubiquitin ligases, the substrate-recognition elements of the ubiquitin-mediated protein proteolytic pathway. The findings that LATS2 also interacts with all of the components of the E3 enzymes allows us to postulate that LATS2 is probably involved in the regulation of this Signalosome-E3 super-complex. In addition, the discovery that LATS2 associates with multiple protein kinases localised at the cellular membrane and in various signalling cascades supports the idea that LATS2 functions as an integrator of signals which allows it to monitor the activity of these pathways and translate these signals through its action on the Signalosome. Furthermore, the observation that a kinase-dead LATS2 mutant arrests at the G2/M phase of the cell cycle, demonstrates that the protein, through the action of its kinase domain, is crucial for progression through the cell cycle, an action in accordance to its proposed role as a regulator of E3 ubiquitin ligases. The findings presented herein provide evidence that LATS2 associates with the Signalosome-E3 ubiquitin ligases super-complex which governs protein stability. Any alteration of the protein would have a strong impact on pathways that modulate cell proliferation, as shown by its implication in tumourigenesis. RESUME LATS2 est un membre de la famille de gènes suppresseurs de tumeurs LATS. Le gène humain LATS2 est situé sur le chromosome 13q11-12, une région qui s'est avérée être un point sensible (67%) dans la perte d'hétérozigosité (LOH) notamment pour le cancer du poumon. Le fait que des tumeurs se développent spontanément chez les souris qui sont déficientes pour le gène LATS1 ainsi que dans des cellules mutantes pour LATS chez la Drosophile, est expliqué Par la fonction de LATS1, qui est de supprimer l'apparition de tumeurs en réprimant la prolifération cellulaire à travers sa capacité à réguler l'activité de Cdc2/Cyciine A. LATS1 joue également un rôle important au niveau du maintient de la ploïdie de la cellule, au travers de son action sur les points de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique. Les premières études du gène LATS2 indiquent que la protéine est, par son contrôle des réactions de phosphorylation de la Cdc25C, impliquée dans la transition 021M. Le but de cette étude était d'identifier les protéines qui interagissent avec LATS2, en vue d'obtenir une compréhension plus approfondie des mécanismes moléculaires dans lesquels LATS2 se trouve engagée. Le système de double-hybride chez la levure a permis l'identification d'un grand nombre de gènes qui interagissent avec LATS2. La plupart des interactions ont été confirmées par GST «pull clown», une technique in vitro qui a permis de démontrer que LATS2 est un composant intégral du Signalosome. Ce complexe est supposé réguler l'activité des E3 ubiquitine-rigases, les éléments responsables du recrutement des substrats qui doivent être recyclés par la voie de dégradation ubiquitine-dépendante. Les résultats obtenus indiquent également que LATS2 interagit avec tous les composants des enzymes E3, ce qui nous permet de soumettre l'idée selon laquelle la protéine LATS2 est en fait impliquée dans la régulation du complexe Signalosorne-E3. De plus, la découverte que LATS2 se trouve associée à plusieurs protéines kinases localisées au niveau de la membrane cellulaire, ainsi que dans diverses voies de transduction, confirment l'idée que LATS2 fonctionne en tant que molécule qui intègre les signaux en provenance de ces différentes voies cellulaires. De ce fait, il lui serait possible de coordonner la destruction des protéines au moyen du complexe Signalosome, permettant ainsi de réprimer l'activité des voies de signalisation. En outre, l'introduction d'une mutation dans le domaine kinase de LATS2 résulte en l'arrêt du cycle cellulaire en G2/M, ce qui montre que la protéine, au travers de son domaine kinase, est cruciale pour le bon fonctionnement du cycle cellulaire, ceci en accord avec son rôle proposé comme régulateur des E3 ubiquitine-ligases. Les résultats présentés dans ce manuscrit démontrent que la protéine LATS2 se trouve associée au complexe Signalosome-E3 qui régule la dégradation des protéines. La moindre modification de la protéine engendrerait des répercussions importantes au niveau des voies de transduction qui contrôlent fa prolifération ceilulaire, ce qui atteste du rôle déterminant que joue LAT32 dans la tumorigénèse.

Chemotherapy induces tumor metastasis and dormancy

Chemotherapy is widely used as a systemic treatment modality in cancer patients and provides survival benefits for a significant fraction of treated patients H However, some patients suffer from cancer relapse and rapidly progress to metastasis, suggesting that following chemotherapy their residual tumor developed a more aggressive phenotype 4 5. Although some molecular mechanisms involved in chemo-resistance and chemotherapy-induced metastatic relapse have been reported, more investigations and understanding of these processes are necessary before any translation into the clinic might be considered. By using the syngeneic metastatic 4T1 murine breast cancer model, we observed that chemotherapy treatment and selection of chemotherapy-resistant cancer cells in vitro can induces two opposite phenotypes: a dormant one and a relapsing-metastatic one. Previous studies in our laboratory demonstrated that irradiation of mammary gland promotes tumor metastasis, at least in part, by inducing the recruitment of CD11b+ cells to both the primary tumor and the lungs at a pre-metastatic stage. In this study we found that CD11b+ cells may also play important roles in chemotherapy-induced tumor metastasis and dormancy in vivo. Tumor cells expressing the stem cell marker Sca-1 were enriched by chemotherapy treatment in vitro, as well as in tumor metastasis in vivo. Furthermore, tumor-derived CD11b+ cells were capable to maintain and expand this population in vitro. These results suggest that the expansion of a tumor cell population with stem cell features might be a mechanism by which chemotherapy induces metastasis. On the other hand, the same drug treatment in vitro generated resistant cells with a dormant phenotype. Dormant tumor cells were able to induce an in vivo immune- inflammatory response in the draining lymph node, which is normally absent due to the immunosuppressive effects of tumor-recruited myeloid derived- suppressor cells (MDSCs). Genome-wide gene expression analysis revealed the enrichment of invasion and metastasis-related genes in the relapsing metastatic tumor cells and immune response-related genes in the dormant tumor cells. Interestingly, CD11b+ cells derived from the microenvironment of growing-metastatic tumors, but not CD11b+ cells derived from the spleen of tumor-free mice, were able to instigate outgrowth of dormant tumor cells in vivo. Also, dormant cells formed growing and metastatic tumors when injected into immune-compromised NGS mice. These results point to a role of chemotherapy in enabling treated tumor cells to acquire immune response-inducing capabilities, while impairing the recruitment of CD11b+ cells and their differentiation into an immune-suppressive cell. The molecular mechanisms underneath these effects are being further investigated. In conclusion, results obtained in this model indicate that chemotherapy can induce a dormant phenotype in cancer cells and that this state of dormancy can be broken by MDSCs educated by relapsing tumors. Understanding the mechanism beyond these effects, in particular unraveling the genetic or epigenetic determinants of dormancy vs relapse, might open the way to therapies aimed and maintaining residual cells escaping chemotherapy in a state of sustained dormancy. - La chimiothérapie est un traitement systémique largement utilisé chez les patients cancéreux qui donne un avantage de survie significatif pour une bonne partie de patients traités (1-3). Cependant, certains patients souffrent d'une rechute et progressent ensuite vers la métastase. Ceci suggère que leur tumeur résiduelle a développé un phénotype agressif suite à la chimiothérapie (4-5). Bien que certains mécanismes moléculaires impliqués dans la chimiorésistance et la rechute métastatique ont été identifiés, d'avantage d'études sont nécessaires afin de mieux comprendre ce phénomène et de développer des nouvelles thérapies cliniques. En utilisant un modèle syngénique de cancer du sein métastatique chez la sourie (4T1), nous avons observé que la sélection des cellules cancéreuses résistantes à la chimiothérapie in vitro peut induire deux phénotypes opposés: un phénotype de dormance et un phénotype de progression métastatique. Une étude précédente issue de notre laboratoire a démontré que l'irradiation de la glande mammaire favorise la métastase de tumeurs recourants suite au recrutement de cellules CD11b+ dans la tumeur primaire et dans les poumons pré-métastatiques. Dans notre étude nous avons constaté que les cellules CD11b+ peuvent également jouer un rôle important dans la formation de métastases induites par la chimiothérapie ainsi que dans le maintien de la dormance in vivo. Nous avons également observé un enrichissement de cellules tumorales exprimant le marqueur de cellule souche Sca-1 parmi les cellules tumorales résistantes à la chimiothérapie et dans les cellules qui on formé des métastases in vivo. Des cellules CD11b+ dérivées du microenvironnement tumorale favorisent l'expansion de la population de cellules tumorales Sca-1+ in vitro. Ces résultats suggèrent que l'expansion d'une population de cellules tumorales avec des caractéristiques de cellules souches pourrait constituer un mécanisme par lequel la chimiothérapie induit des métastases dans des tumeurs récurrentes. D'autre part le même traitement de chimiothérapie peut générer des cellules résistantes avec un phénotype dormant. Les expériences in vivo indiquent que les cellules tumorales dormantes induisent une réponse immunitaire inflammatoire dans le ganglion lymphatique de drainage, qui est normalement réprimée par des cellules myéloïdes suppressives de tumeur (MDSC). Une analyse d'expression de gènes a révélé l'enrichissement de gènes liés à l'invasion et à la métastase dans les cellules tumorales récurrentes et des gènes liés à la réponse immunitaire dans les cellules tumorales dormantes. Les cellules CD11b+ issues du microenvironnement des tumeurs récurrents ont incité la croissance des cellules tumorales dormantes in vivo, tandis que les cellules CD11b+ dérivées de la rate de souris non porteuses de tumeur ne l'étaient pas. Les mécanismes moléculaires sous-jacents restent à découvrir. En conclusion, les résultats obtenus dans ce modèle indiquent que la chimiothérapie pourrait favoriser non seulement l'induction d'une dormance cellulaire, mais également que les cellules dormantes seraient adroits de induire une réponse immunitaire capable les maintenir dans un état de dormance prolongé. Un déséquilibre dans cette réponse immunitaire pourrait des lors briser cet état de dormance et induire une progression tumorale. Comprendre les mécanismes responsables de ces effets, en particulier l'identification des déterminants génétiques ou épigénétiques liés à la dormance vs la rechute, pourraient ouvrir la voie à des nouvelles thérapies visant le maintien d'un état de dormance permanente des cellules résiduelles après chimiothérapie.

Molecular mechanisms for the transcriptional regulation of the Connexin36 gene expression in insulin-secreting cells

Résumé Régulation de l'expression de la Connexin36 dans les cellules sécrétrices d'insuline La communication intercellulaire est en partie assurée via des jonctions communicantes de type "gap". Dans la cellule ß pancréatique, plusieurs observations indiquent que le couplage assuré par des jonctions gap formées parla Connexine36 (Cx36) est impliqué dans le contrôle de la sécrétion de l'insuline. De plus, nous avons récemment démontré qu'un niveau précis d'expression de la Cx36 est nécessaire pour maintenir une bonne coordination de l'ensemble des cellules ß, et permettre ainsi une sécrétion synchrone et contrôlée d'insuline. Le développement du diabète et du syndrome métabolique est partiellement dû à une altération de la capacité des cellules ß à sécréter de l'insuline en réponse à une augmentation de la glycémie. Cette altération est en partie causée par l'augmentation prolongée des taux circulant de glucose, mais aussi de lipides, sous la forme d'acides gras libres, et de LDL (Low Density Lipoproteins), particules assurant le transport des acides gras et du cholestérol dans le sang. Nous avons étudié la régulation de l'expression de la Cx36 dans différentes conditions reflétant la physiopathologie du diabète de type 2 et du syndrome métabolique et démontré qu'une exposition prolongée à des concentrations élevées de glucose, de LDL, ainsi que de palmitate (acide gras saturé le plus abondant dans l'organisme), inhibent l'expression de la Cx36 dans les cellules ß. Cette inhibition implique l'activation de la PKA (Proteine Kinase A), qui stimule à son tour l'expression du facteur de transcription ICER-1 (Inductible cAMP Early Repressor-1). Ce puissant répresseur se fixe spécifiquement sur un motif CRE (cAMP Response Element), situé dans le promoteur du gène de la Cx36, inhibant ainsi son expression. Nous avons de plus démontré que des cytokines pro-inflammatoires, qui pourraient contribuer au développement du diabète, inhibent également l'expression de la Cx36. Cependant, les cytokines agissent indépendamment du répresseur ICER-1, mais selon un mécanisme requérant l'activation de l'AMPK (AMP dependant protein kinase). Sachant qu'un contrôle précis des niveaux d'expression de la Cx36 est un élément déterminant pour une sécrétion optimale de l'insuline, nos résultats suggèrent que la Cx36 pourrait être impliquée dans l'altération de la sécrétion de l'insuline contribuant à l'apparition du diabète de type 2. Summary A particular way by which cells communicate with each other is mediated by gap junctions, transmembrane structures providing a direct pathway for the diffusion of small molecules between adjacent cells. Gap junctional communication is required to maintain a proper functioning of insulin-secreting ß-cells. Moreover, the expression levels of connexin36 (Cx36), the sole gap junction protein expressed in ß-cells, are critical in maintaining glucose-stimulated insulin secretion. Chronic hyperglycemia and hyperlipidemia exert deleterious effects on insulin secretion and may contribute to the progressive ß-cell failure linked to the development of type 2 diabetes and metabolic syndrome. Since modulations of the Cx36 levels might impair ß-cell function, the general aim of this work was to elucidate wether elevated levels of glucose and lipids affect Cx36 expression. The first part of this work was dedicated to the study of the effect of high glucose concentrations on Cx36 expression. We demonstrated that glucose transcriptionally down-regulates the expression of Cx36 in insulin-secreting cells through activation of the protein kinase A (PKA), which in turn stimulates the expression of the inducible cAMP early repressor-1 (ICER-1). This repressor binds to a highly conserved cAMP response element (CRE) located in the Cx36 promoter, thereby inhibiting Cx36 expression. The second part of this thesis consisted in studying the effects of sustained exposure to free fatty acids (FFA) and human lipoproteins on Cx36 levels. The experiments revealed that the most abundant FFA, palmitate, as well as the atherogenic low density lipoproteins (LDL), also stimulate ICER-1 expression, resulting in Cx36 down-regulation. Finally, the third part of the work focused on the consequences of long-term exposure to proinflammatory cytokines on Cx36 content. Interleukin-1 ß (IL-1 ß) inhibits Cx36 expression and its effect is potentialized by tumor necrosis factor α (TNFα) and interferon γ (IFNγ). We further unveiled that the cytokines effect on Cx36 levels requires activation of the AMP dependent protein kinase (AMPK). Prolonged exposures to glucose, palmitate, LDL, and pro-inflammatory cytokines have all been proposed to contribute to the development of diabetes and metabolic syndrome. Since Cx36 expression levels are critical to maintain ß-cell function, Cx36 down-regulation by glucose, lipids, and cytokines might participate to the ß-cell failure associated with diabetes development.

Maturation protéolytique et sécrétion de la rénine: importance fonctionnelle de la pro-région

RÉSUMÉ Le système rénine-angiotensine joue un rôle prépondérant dans la régulation de la pression sanguine et de la balance des sels ainsi que dans d'autres processus physiologiques et pathologiques. Lorsque la pression sanguine est trop basse, les cellules juxtaglomérulaires sécrètent la rénine, qui clivera l'angiotensinogène circulant (sécrété majoritairement par le foie) pour libérer l'angiotensine I, qui sera alors transformée en angiotensine II par l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Ce système est régulé au niveau de la sécrétion de la rénine par le rein. La rénine est une enzyme de type protéase aspartique. Elle est produite sous la forme d'un précurseur inactif de haut poids moléculaire appelé prorénine, qui peut être transformé en rénine active. Si le rôle de la prorégion de la rénine n'est pas encore connu, plusieurs études ont montré qu'elle pourrait être un auto-inhibiteur. Des travaux menés sur d'autres enzymes protéolytique ont mis en évidence un rôle de chaperon de leurs prorégions. Dans la circulation, la prorénine est majoritaire (90%) et la rénine active ne représente que 10% de la rénine circulante. L'enzyme qui transforme, in vivo, la prorénine en rénine active n'est pas connue. De même, l'endroit précis du clivage n'est pas élucidé. Dans ce travail, nous avons généré plusieurs mutants de la prorénine et les avons exprimés dans deux types cellulaires : les CV1 (modèle constitutif) et AtT-20 (modèle régulé). Nous avons montré que la prorégion joue un rôle important aussi bien dans l'acquisition de l'activité enzymatique que dans la sécrétion de la rénine, mais fonctionne différemment d'un type cellulaire à l'autre. Nous avons montré pour la première fois que la prorégion interagit de façon intermoléculaire à l'intérieur de la cellule. Les expériences de complémentation montre que l'interaction favorable de la rénine avec la prorégion dépend de la taille de cette dernière : prorénine (383 acides aminés) > pro62 (62 acides aminés) > pro43 (43 acides aminés). Par ailleurs nos résultats montrent qu'une faible partie de la rénine est dirigée vers la voie de sécrétion régulée classique tandis que la majorité est dirigée vers les lysosomes. Ceci suggère qu'une internalisation de la rénine circulante via le récepteur mannose-6-phosphate est possible. Cette dernière concernerait essentiellement la prorénine (dont les taux circulants sont 10 fois plus élevés que la rénine active). La suite de ce travail porterait sur la confirmation de cette hypothèse et l'identification de son possible rôle physiologique. SUMMARY The renin-angiotensin system is critical for the control of blood pressure and salt balance and other physiological and pathological processes. When blood pressure is too low, renin is secreted by the juxtaglomerular cells. It will cleave the N-terminus of circulating angiotensinogen (mostly secreted by the liver) to angiotensin-1, which is then transformed in angiotensin-II by the angiotensin-converting-enzyme (ACE). This system is regulated at the level of renin release. Renin, an aspartyl protease, is produced from a larger precursor (called prorenin) which is matured into active renin. Although the role of the renin proregion remains unknown, it has been reported that it could act as an autoinhibitor. Works on other proteolytic enzymes showed that their prorégion can act as chaperones. prorenin is the major circulating form of renin, while active renin represents only 10%. The enzyme which transforms, in vivo, the prorenin into active renin is unknown and the exact cleavage site remains to be elucidated. In this study, we generated some prorenin mutants, which were expressed in CV1 cells (constitutive pathway model) or AtT-20 cells (regulated pathway model). We showed that the proregion plays a pivotal role in the enzymatic activity and secretion of renin in a different manner in the two cell types. For the first time, it has been demonstrated that the proregion acts in an intermolecular way into the cell. Complementation assays showed that interaction between renin and proregion depends on the size of the proregion: prorenin (383 amino acids) > pro62 (62 amino acids) > pro43 (43 amino acids). Furthermore, our results showed that only a small amount of the cellular renin pool is targeted to the "canonical" regulated pathway and that the remaining is targeted to the lysosomes. Those results suggest a possible internalizátion of the circulating renin through the mannose-6-phosphate receptor pathway. This would mostly concern the prorenin (whose levels are ten times higher than active renin). Further studies would confirm or infirm this hypothesis and elucidate a potential physiological role.

The interaction of human pathogenic arena viruses with the host cell

SummaryResearch projects presented in this thesis aimed to investigate two major aspects of the arenaviruses life cycle in the host cell: viral entry and the biosynthesis of the viral envelope glycoprotein.Old World arenaviruses (OWAV), such as Lassa virus (LASV) and lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), attach to the cell by binding to their receptor, alpha-dystroglycan. Virions are then internalized by a largely unknown pathway of endocytosis and delivered to the late endosome/lysosome where fusion occurs at low pH. In the major project of my thesis, we sought to identify cellular factors involved in OWAV cell entry. Our work indicates that OWAV cell entry requires microtubular transport and a functional multivesicular body (MVB) compartment. Infection indeed depends on phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K) activity and lysobisphosphatidic acid (LBPA), a lipid found in membranes of intraluminal vesicles (ILVs) of the MVB. We further found a requirement of factors that are part of the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT), involved in the formation of ILVs. This suggests an ESCRT-mediated sorting of virus- receptor complex during the entry process.During viral replication, biosynthesis of viral glycoprotein takes place in the endoplasmic reticulum (ER) of the host cell. When protein load exceeds the folding capacity of the ER, the accumulation of unfolded proteins is sensed by three ER resident proteins, activating transcription factor 6 (ATF6), inositol-requiring enzyme 1 (IRE1) and PKR-like ER kinase (PERK), whose signaling induces the cellular unfolded protein response (UPR). Our results indicate that acute LCMV infection transiently induces the activation of the ATF6 branch of the UPR, whereas the PERK, and IRE1 axis of UPR are neither triggered nor blocked during infection. Our data also demonstrate that activation of ATF6 pathway is required for optimal viral replication during acute infection.The formation of the mature, fusion-active form of arenaviruses glycoproteins requires proteolytic cleavage mediated by the cellular protease subtilisin kexin isozyme-1 (SKI-l)/site-l protease (SIP). We show that targeting the SKI-1/S1P enzymatic activity with specific inhibitors is a powerful strategy to block arenaviruses productive infection. Moreover, characterization of protease function highlights differences in processing between cellular and viral substrates, opening new possibilities in term of drug development against human pathogenic arenaviruses.RésuméLes projets de recherche présentés dans cette thèse visaient à étudier deux aspects du cycle de vie des arenavirus: l'entrée du virus dans la cellule hôte et la biosynthèse de la glycoprotéine durant la réplication virale.Les arenavirus du vieux monde (OWAV), tels que le virus de Lassa (LASV) et le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) s'attachent à la cellule hôte en se liant à leur récepteur, l'alpha-dystroglycane. Les virions sont ensuite intemalisés par une voie d'endocytose inconnue et livrés à l'endosome tardif/lysosome, où le pH acide permet la fusion entre l'enveloppe virale et la membrane du compartiment. Le projet principal de ma thèse consistait à identifier les facteurs cellulaires impliqués dans l'entrée des OWAV dans la cellule hôte. Nos résultats indiquent que l'entrée des OWAV nécessite le transport microtubulaire et la présence d'un corps multivésiculaire (MVB) fonctionnel. L'infection dépend en effet de l'activité de phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K) et de lysobisphosphatidic acid (LBPA), un lipide présent dans les membranes des vésicules intraluminales (ILVs) du MVB. Nous avons également trouvé l'implication de facteurs constituant l'endosomal sorting complex required for sorting (ESCRT) qui joue un rôle dans la formation des ILVs. Ces donnés suggèrent l'incorporation du complexe virus-récepteur dans des ILVs durant le processus d'entrée.Lors de la réplication virale, la biosynthèse de la glycoprotéine virale a lieu dans le réticulum endoplasmique (ER) de la cellule hôte. Lorsque la charge de protéines nouvellement synthétisées excède la capacité de pliage des protéines dans le ER, l'accumulation de protéines mal pliées est détectée par trois facteurs: activating transcription factor 6 (ATF6), inositol-requiring enzyme 1 (IRE1) et PKR-like ER kinase (PERK). Leur signalisation constitue la réponse cellulaire face aux protéines mal pliées (UPR). Nos résultats montrent que l'infection aiguë avec LCMV induit transitoirement l'activation de la voie de signalisation ATF6 alors que les axes PERK et IRE1 de l'UPR ne sont ni induits ni bloqués pendant l'infection. Nos données prouvent également que l'activation de la voie ATF6 est nécessaire à une réplication virale optimale lors de l'infection aiguë avec LCMV.La maturation des glycoprotéines des arenavirus nécessite un clivage protéolytique par la protéase cellulaire subtilisin kexin isozyme-1 (SKI-l)/site-l protease (SIP). Nous avons démontré que le ciblage de l'activité enzymatique de SKI-1/SIΡ avec des inhibiteurs spécifiques est une stratégie prometteuse pour bloquer l'infection par les arenavirus. La caractérisation du mécanisme d'action de la protéase a, par ailleurs, révélé des différences au niveau du clivage entre les substrats cellulaires et viraux, ce qui ouvre de nouvelles perspectives en terme de développement de médicaments contre les arenavirus pathogènes pour l'homme.