Epidemiologia e caracterização molecular dos vírus Dengue circulantes no Rio Grande do Norte, 2013-2014

Dengue is an acute infectious disease, usually transmitted by Aedes aegypti mosquitoes. The etiologic agents belong to the family Flaviviridae, genus Flavivirus, and occur as four antigenically related but distinct serotypes designated DENV-1, 2, 3, and 4. In Brazil, the disease represents a national public health problem. The purpose of the present study was to describe epidemiological aspects of dengue in the State of Rio Grande do Norte, from 2013 to 2014. A total of 483 blood or serum samples, collected from January 2013 to December 2014, were studied by RT-PCR for viral detection and typing. The infection was confirmed in 36.44% (176/483) of the cases studied. This study detected the circulation of three serotypes of dengue virus in Rio Grande do Norte, DENV-1, 2, and 4. The predominant serotype in 2013-2014 was the DENV-4, representing 83.51% (81/97) and 68.35% (54/79) of the positive cases, respectively. Regarding the spatial distribution, most of the cases occurred in Natal and Caicó, with 9.28% (9/97) and 18.99% (15/79), respectively. The months with the biggest viral circulation in RN were March 2013 and May 2014. The female gender was the most affected, representing 69.07% (67/97) in 2013 and 54.43% (43/79) in 2014. The most affected age groups were 21-30 years (2013) and 11-20 years (2014) with 25.77% (25/97) and 20.25% (16/79) positive cases, respectively. Phylogenetic analysis indicated that genotype V (DENV-1) and genotype II (DENV-4) circulated in the State. Our results provide information about the dynamics of DENV in the Rio Grande do Norte, important for the development of disease control strategies.

Infecções por enterobacteriaceae resistente aos carbapenêmicos em hospital de ensino: epidemiologia e caracterização molecular

Introduction: The production of KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) has become an important mechanism of carbapenem-resistance among Enterobacteriaceae strains. In Brazil, KPC is already widespread and its incidence has increased significantly, reducing treatment options. The “perfect storm” combination of the absence of new drug developmentand the emergence of multidrug-resistant strains resulted in the need for the use of older drugs, with greater toxicity, such as polymyxins. Aims: To determine the occurrence of carbapenemase-producing strains in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolated from patients with nosocomial infection/colonization during September/2014 to August/2015, to determine the risk factors associated with 30-day- mortality and the impact of inappropriate therapy. Materials and Methods: We performed a case control study to assess the risk factors (comorbidities, invasive procedures and inappropriate antimicrobial therapy) associated with 30-day-mortality, considering the first episode of infection in 111 patients. The resistance genes blaKPC, blaIMP, blaVIM and blaNDM-1 were detected by polymerase chain reaction technique. Molecular typing of the strains involved in the outbreak was performed by pulsed field gel electrophoresis technique. The polymyxin resistance was confirmed by the microdilution broth method. Results: 188 episodes of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections/colonizations were detected; of these, 122 strains were recovered from the hospital laboratory. The presence of blaKPC gene were confirmed in the majority (74.59%) of these isolates. It was not found the presence of blaIMP , blaVIM and blaNDM-1 genes. K. pneumoniae was the most frequent microorganism (77,13%), primarily responsible for urinary tract infections (21,38%) and infections from patients of the Intensive Care Unit (ICU) (61,38%). Multivariate statistical analysis showed as predictors independently associated with mortality: dialysis and bloodstream infection. The Kaplan-Meier curve showed a lower probability of survival in the group of patients receiving antibiotic therapy inappropriately. Antimicrobial use in adult ICU varied during the study period, but positive correlation between increased incidence of strains and the consumption was not observed. In May and July 2015, the occurrence rates of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae KPC-producing per 1000 patient-days were higher than the control limit established, confirming two outbreaks, the first caused by colistin-susceptible KPC-producing K. pneumoniae isolates, with a polyclonal profile and the second by a dominant clone of colistin-resistant (≥ 32 μg/mL) KPC-producing K. pneumoniae. The cross transmission between patients became clear by the temporal and spatial relationships observed in the second outbreak, since some patients occupied the same bed, showing problems in hand hygiene adherence among healthcare workers and inadequate terminal disinfection of environment. The outbreak was contained when the ICU was closed to new admissions. Conclusions: The study showed an endemicity of K. pneumoniae KPC-producing in adult ICU, progressing to an epidemic monoclonal expansion, resulted by a very high antibiotic consumption of carbapenems and polymyxins and facilitated by failures in control measures the unit.

Caracterização molecular de cepas de Listeria monocytogenes oriundas de corte bovino e abatedouros frigoríficos de bovinos localizado no Distrito Federal

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2016.

Levantamento e caracterização molecular de vírus e viroide em vinhedos no Município de São Roque, SP.

Cerca de 65 espécies virais infectam videiras no mundo, podendo causar significativos impactos econômicos. O objetivo deste trabalho foi determinar a incidência de vírus e viroide em 9 vinhedos do município de São Roque, SP e caracterizar molecularmente o gene da proteína capsidial (CP) de isolados locais.

Caracterização molecular de bactérias promotoras do crescimento vegetal isoladas de milho por meio da amplificação do Gene nifH perfis de ARDRA.

Há poucas informações a respeito da diversidade e do potencial biotecnológico dos micro-organismos do solo no Semiárido, em especial daqueles envolvidos com processo de fixação biológica de nitrogênio. O objetivo deste trabalho foi determinar a diversidade de uma coleção de bactérias associadas ao milho (Zea mays L.) em solos do Semiárido. As bactérias foram avaliadas quanto à amplificação de um fragmento do gene nifH por meio de PCR e pela técnica de ARDRA. Dentre as 72 bactérias testadas, 47 foram considerados nifH positivos e a análise dos perfis de ARDRA mostrou que o local de origem dos isolados foi fator determinante para o agrupamento das bactérias.

Isolamento e Caracterização Fenotípica e Molecular de Parasitos Leishmania sp. de Pacientes com Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) Atendidos no Hospital Universitário Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba

As leishmanioses são um complexo de doenças infecto-parasitárias endêmicas em 88 países que constituem um grave problema de saúde pública. Diversas espécies do gênero Leishmania são os agentes causadores da doença, dentre elas a espécie L. (V.) braziliensis associada a diferentes quadros clínicos da Leishmaniose Tegumentar Americana. No presente trabalho foram obtidos nove isolados de Leishmania sp. oriundos de LTA, sendo sete isolados (87%) oriundos de pacientes residentes no município de Pilões, um (13%) da cidade de João Pessoa, ambas regiões, do estado da Paraíba. Todos os nove isolados foram identificados como sendo da espécie L. (V.) braziliensis através de PCR específica. As análises de caracterização molecular pela técnica de RAPD-PCR mostraram que esses isolados compartilharam 62,63% revelando diferenças genotípicas entre elas. Contudo, os isolados AF e JSL, ambos provenientes de lesões disseminadas, tiveram o maior percentual de bandas compartilhadas dentre os isolados. Outra técnica molecular utilizada foi o SSR-PCR com o iniciador K7 que também foi capaz de demontrar polimorfismo entre os isolados. Nas análises de PCR-RLFP das regiões ITS1, foram encontradas perfis diferentes entre os isolados, onde MRSS, JMTS, AF, JCTS, JRL apresentaram o mesmo perfil de bandas e os isolados JSL, JCNS, MFTS e JAS tiveram, cada um, perfis de bandas distintos. Na análise de PCR-RLFP da região do gene hsp70, JSL, AF, JCTS, JRL, MFTS apresentaram o mesmo perfil de bandas e os isolados, MRSS, JMTS, JCNS e JAS perfis de bandas distintos. Adicionalmente foram também observadas diferenças fenotípicas entre estes isolados, visto que em dado momento de cultivo, todos apresentaram comportamento diferenciado, além de demonstrarem diferenças quanto à sensibilidade às drogas utilizadas na terapêutica das leishmanioses. Portanto estes estudos revelam que os isolados de L. (V.) braziliensis obtidos no estado da Paraíba demonstraram um significativo polimorfismo genético, revelando um alto nível de variação intraespecífica.

Caracterização fenotípica e molecular de genitores de feijão tipo carioca quanto à resistência a patógenos

O objetivo deste estudo foi a caracterização fenotípica e molecular de 31 genótipos de feijão do tipo carioca, quanto à resistência aos patógenos da antracnose, ferrugem e mancha-angular. Foram realizadas inoculações com 13 patótipos de Colletotrichum lindemuthianum, dois de Uromyces appendiculatus e sete de Pseudocercospora griseola. Na caracterização molecular, foram utilizados cinco marcadores moleculares previamente identificados, ligados a diferentes alelos de resistência aos patógenos. Sete genótipos apresentaram resistência a 12 patótipos de C. lindemuthianum. Nove genótipos apresentaram resistência a cinco patótipos de P. griseola. Dez genótipos foram resistentes aos patótipos de U. appendiculatus. As linhagens VC 2, VC 3 e VC 5, além da Rudá-R (linhagem piramidada com cinco genes que conferem resistência a alguns patótipos de antracnose, ferrugem e mancha-angular), foram as que se destacaram quanto à resistência múltipla aos patógenos acima citados. Foi detectado polimorfismo molecular entre a maioria dos genótipos com a Rudá-R, o que indica a possibilidade de uso dos marcadores moleculares SCARF10, SCARY20, SCARAZ20, SCARH13 e OPX11.

Caracterização biológica e molecular da interação de Drechslera avenae (Eidam) Sharif com cultivares e linhagens de aveia (Avena sativa L.)

A helmintosporiose, incitada por Drechslera avenae (teleomorfo, Pyrenophora avenae), constitui fator limitante à produção e à qualidade do grão de aveia (Avena sativa L). A caracterização biológica e molecular da interação aveia - D. avenae pode contribuir para o manejo e a determinação de estratégias de controle da doença. Para a caracterização biológica, foram avaliadas trinta cultivares de aveia quanto à percentagem de área foliar com sintomas da doença e o tipo de lesão, inicialmente sob condições de inoculação artificial com três isolados do fungo e, após, no campo, sob condições naturais de infecção. Os resultados demonstraram haver interações significativas entre os genótipos da planta e isolados do patógeno. Classificaram-se como mais resistentes ao fungo OR 4, UFRGS 7, UFRGS 14, UFRGS 18 e UPF 19. Para a caracterização molecular da interação, cinco genótipos (CTC 5, ORLA 975, preta-comum, UFRGS 18 e UPF 17), não inoculados e inoculados com dois isolados do fungo, foram investigados para a análise de expressão diferencial de genes após 12, 24 e 72 horas após a inoculação. A partir do RNA total extraído das plantas submetidas aos tratamentos, realizaram-se a síntese de cDNA (RT-PCR), o isolamento de cDNAs expressados diferencialmente e a produção de sondas para a verificação de mRNAs induzidos, os quais foram hibridizados por meio de “Southern blot” e “Reverse Northern”. Foram observadas diferenças na expressão de genes, em nível de mRNA, entre plantas sadias e infectadas, tendo-se obtido sete fragmentos de cDNAs relacionados à interação com D. avenae, os quais foram comparados quanto a sua similaridade com seqüências depositadas no banco de dados do Genbank. Pela análise de “Reverse Northern”, pôde-se identificar um cDNA denominado E3-IFCO, relacionado com a resposta de defesa da planta.

Caracterização morfológica, citogenética e molecular de uma população de tangerineiras híbridas de 'Clementina fina' (Citrus clementina Hort. ex Tan.) e 'Montenegrina' (Citrus deliciosa Ten.)

A produção citrícola se encontra dispersa por todos os continentes e no Brasil, os citros são a produção frutícola de maior volume de produção. A produção de citros de mesa, como as tangerinas, possibilita ao produtor obter maior valor pelo seu produto. O mercado consumidor é ávido por novas variedades e para tanto, um programa de melhoramento deve estar sempre em busca de genótipos que atendam ao mercado consumidor, bem como a cadeia produtiva. Na Estação Experimental Agronômica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, está localizada uma população de tangerineiras híbridas oriundas do cruzamento da tangerineira ‘Clementina Fina’ (Citrus clementina Hort. ex Tan.) e ‘Montenegrina’ (Citrus deliciosa Ten.) a qual foi caracterizada neste estudo, avaliando-se características morfológicas de acordo com os descritores propostos pelo International Board for Plant Genetic Resources, além da identificação da época de maturação, viabilidade de pólen, número cromossômico e caracterização molecular, utilizando marcadores do tipo microssatélites. Através da análise morfológica foi possível distinguir todas as 96 plantas avaliadas, porém não foi possível agrupar a F1 em grupos distintos de cada um dos genitores. A época de maturação de frutos das plantas se concentra entre a primeira quinzena de abril até a primeira quinzena de agosto. Todas as plantas analisadas apresentaram um alto grau de viabilidade de pólen, variando entre 79,04 e 98,08 %. Todas as plantas avaliadas são diplóides com um número cromossômico de 2n=18. Utilizando 12 pares de primers de microssatélites foi possível diferenciar 90 acessos do estudo, e agrupar a F1 em indivíduos mais próximos do genitor feminino e do genitor masculino. O PIC (Conteúdo de Informação de Polimorfismo) dos primers variou de 0,27 a 0,65. Não foi possível estabelecer uma relação entre a caracterização utilizando marcadores morfológicos e a caracterização utilizando marcadores moleculares.

Caracterização morfológica, morfométrica e molecular de Hepatozoon spp. (Apicomplexa, Hepatozoidae) de serpentes brasileiras naturalmente infectadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Caracterização biológica e molecular de quatro cepas de Trypanosoma cruzi Chagas,1909 (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) isoladas de pacientes chagásicos crônicos

Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR

Occurrence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. isolated from domestic animals in a rural area surrounding Atlantic dry forest fragments in Teodoro Sampaio municipality, State of São Paulo, Brazil

The aim of this study was to assess the occurrence of Cryptosporidium in domestic animals in rural properties surrounding rain forest fragments within the municipality of Teodoro Sampaio, southeastern Brazil. Conventional sucrose flotation method followed by molecular characterization of the parasites by sequencing PCR products amplified from SSU rRNA gene were used. Stool samples were collected from domestic animals raised as pets and livestock in all rural properties surrounding three forest fragments. Samples from cattle (197), equine (63), pigs (25), sheep (11), and dogs (28) were collected from 98 rural properties. The frequency of occurrence of Cryptosporidium within each animal species was 3.0% (6/197) among cattle and 10.7% (3/28) among dogs. Cryptosporidium was not detected in stool samples from equine, sheep, and pigs. All sequences obtained from the six samples of calves showed molecular identity with Cryptosporidium andersoni while all sequences from dog samples were similar to C. canis. The frequency of occurrence of Cryptosporidium in these domestic animal species was low. The absence of C. parvum in the present study suggests that the zoonotic cycle of cryptosporidiosis may not be relevant in the region studied. The presence of Cryptosporidium species seldom described in humans may be, otherwise, important for the wild fauna as these animals are a source of infection and dissemination of this protozoan to other animal species. The impact and magnitude of infection by C. andersoni in wild ruminants and C. canis in wild canids have to be assessed in future studies to better understand the actual importance of these species in this region.

Molecular characterization of Cryptosporidium spp. from HIV infected patients from an urban area of Brazil

Cryptosporidium spp. are important cause of enteric disease in humans, but may also infect animals. This study describes the relative frequency of several Cryptosporidium species found in human specimens from HIV infected patients in the São Paulo municipality obtained from January to July 2007. Sequence analysis of the products of nested-PCR based on small subunit rRNA and Cryptosporidium oocyst wall protein coding genes revealed 17 (63.0%) isolates of C. hominis, four (14.8%) C. parvum, five (18.5%) C. felis and one (3.7%) C. canis. These findings suggest that, in urban environments of Brazil, the cat adapted C. felis may play a potential role in the zoonotic transmission of cryptosporidiosis whereas the anthroponotic transmission of cryptosporidiosis caused by C. hominis seems to predominate.

Caracterização de isolados de Corynespora cassiicola e avaliação da sensibilidade in vitro a fungicidas

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015.

Molecular epidemiology and evolution of HIV-1 in Portugal and portuguese speaking african countries

The aims of this thesis were to better characterize HIV-1 diversity in Portugal, Angola, Mozambique and Cape Verde and to investigate the origin and epidemiological history of HIV-1 in these countries. The impact of these issues in diagnosis, disease progression and susceptibility to ARV therapy was also investigated. Finally, the nature, dynamics and prevalence of transmitted drug resistance (TDR) was determined in untreated HIV-1 infected patients. In Angola, practically all HIV-1 genetic forms were found, including almost all subtypes, untypable (U) strains, CRFs and URFs. Recombinants (first and second generation) were present in 47.1% of the patients. HIV/AIDS epidemic in Angola probably started in 1961, the major cause being the independence war, subsequently spreading to Portugal. In Maputo, 81% of the patients were infected with subtype C viruses. Subtype G, U and recombinants such as CRF37_cpx, were also present. The results suggest that HIV-1 epidemic in Mozambique is evolving rapidly in genetic complexity. In Cape Verde, where HIV-1 and HIV-2 co-circulate, subtype G is the prevailed subtype. Subtypes B, C, F1, U, CRF02_AG and other recombinant strains were also found. HIV-2 isolates belonged to group A, some being closely related to the original ROD isolate. In all three countries numerous new polymorphisms were identified in the RT and PR of HIV-1 viruses. Mutations conferring resistance to the NRTIs or NNRTIs were found in isolates from 2 (2%) patients from Angola, 4 (6%) from Mozambique and 3 (12%) from Cape Verde. None of the isolates containing TDR mutations would be fully sensitive to the standard first-line therapeutic regimens used in these countries. Close surveillance in treated and untreated populations will be crucial to prevent further transmission of drug resistant strains and maximize the efficacy of ARV therapy. In Portugal, investigation of a seronegative case infection with rapid progression to AIDS and death revealed that the patient was infected with a CRF14_BG-like R5-tropic strain selectively transmitted by his seropositive sexual partner. The results suggest a massive infection with a highly aggressive CRF14_BG like strain and/or the presence of an unidentified immunological problem that prevented the formation of HIV-1-specific antibodies. Near full-length genomic sequences obtained from three unrelated patients enabled the first molecular and phylogenomic characterization of CRF14_BG from Portugal; all sequences were strongly related with CRF14_BG Spanish isolates. The mean date of origin of CRF14_BG was estimated to be 1992. We propose that CRF14_BG emerged in Portugal in the early 1990s, spread to Spain in late 1990s as a consequence of IDUs migration and then to the rest of Europe. Most CRF14_BG strains were predicted to use CXCR4 and were associated with rapid CD4 depletion and disease progression. Finally, we provide evidence suggesting that the X4 tropism of CRF14_BG may have resulted from convergent evolution of the V3 loop possibly driven by an effective escape from neutralizing antibody response.