Persistent luminescence of SrAl2O4:Ce(III), Dy, Eu nanotubes, nanowires and core-shells for people with disabilities: nano-emergency

Este estudo transversal está focado na propriedade de luminescência persistente do aluminato de estrôncio co-dopado com cério (III), disprósio (III) e európio (II), SrAl2O4:Ce3+, Dy3+, Eu2+, em sistemas de sinalização de áreas de risco e emergências para pessoas com deficiências. Na área da ciência e engenharia dos materiais, foram desenvolvidos novos materiais com características nanométricas, nanotubos, nanoarames e nanobastões luminescentes de SrAl2O4:Ce3+, Dy3+, Eu2+ para aplicações na área da reabilitação e acessibilidade de pessoas com deficiências. Os nanotubos foram obtidos a partir de micro- e nano-partículas precursoras sintetizadas por reacção do estado-sólido e tratamento térmico de recozedura (1273-1473 K). Os nanoarames e nanobastões foram preparados por moagem, sonificação e recozedura (373 K). Novas nanocápsulas de aluminatos luminescentes dopados com cério (III) e encapsulados com TiO2 foram criadas de modo a obter-se materiais multifuncionais, designadamente com acção fotocatalítica antimicrobiana, antibacteriana e resistência à água. Tais aluminatos podem ser amplamente aplicados como superfícies higiénicas, auto-limpantes, em biomateriais, no domínio de medicamentos antibióticos, na formulação de vacinas, e com ênfase à aplicação em cerâmicas fotoluminescentes. As metodologias de obtenção de tais nanoestruturas de aluminato de estrôncio dopado com cério (III) e do seu encapsulamento, desenvolvidas no âmbito desta tese, são aplicáveis a diversos aluminatos dopados com outros iões lantanídeos (Ln consiste em La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Yb, Tm ou Lu) com a fórmula M(1-x-y)N2O4:Cex, Lny, onde M é Be, Mg, Ca, Sr ou Ba. Na área da oftalmologia, foi desenvolvido um equipamento médico para o diagnóstico de biofuncionalidade das células retinais fotoreceptoras, e como suporte à telemedicina oftalmológica. Este equipamento foi utilizado para realizar testes de visão cromática FM100HUE em fundo branco/preto para a personalização de materiais luminescentes. Os resultados demonstraram uma biofuncionalidade celular à visibilidade fotópica das cores em fundo preto superior no grupo de tratamento, composto por pessoas com retinopatia diabética (n=38), em comparação ao grupo de referência (n=38). Estes resultados sugerem a recomendação de materiais com fotoluminescência persistente (λem=485-555 nm), incluindo SrAl2O4:Ce3+, Dy3+, Eu2+, para o referido grupo de tratamento, em sinalização de emergência e em ambientes de baixa iluminação. Na área da arquitectura, foi proposta uma nova aplicação dos referidos nanomateriais luminescentes à base de SrAl2O4:Ce3+, Dy3+, Eu2+ em cerâmica de revestimento, tendo em vista a sua boa visibilidade e uso por pessoas com deficiências. Novos pavimentos, cerâmicos, fotoluminescentes, foram desenhados com propriedades multisensoriais (contraste táctil, sonoro e visual) e antimicrobianas, para pessoas portadoras de deficiências utilizarem, no escuro, com a prioridade de salvar vidas em emergências. Tais pisos, com relevos, podem ser combinados de modo a compor um sistema exclusivo de sinalização fotoluminescente multisensorial que possibilita a rápida evacuação mediante o uso de auxílios de mobilidade (e.g. bengala, cadeira de rodas, andadores, muletas). A solução integrada de tais inovações que potencializa a propriedade de luminescência persistente de SrAl2O4:Ce3+, Dy3+, Eu2+ de modo acessível para as pessoas com deficiências, pode contribuir para salvar vidas, no escuro, em emergências.

Structural analysis of glycans and development of microarrays from Helcobacter pylori cell surface glycome

Helicobacter pylori is a bacterial pathogen that affects more than half of the world’s population with gastro-intestinal diseases and is associated with gastric cancer. The cell surface of H. pylori is decorated with lipopolysaccharides (LPSs) composed of three distinct regions: a variable polysaccharide moiety (O-chain), a structurally conserved core oligosaccharide, and a lipid A region that anchors the LPS to the cell membrane. The O-chain of H. pylori LPS, exhibits unique oligosaccharide structures, such as Lewis (Le) antigens, similar to those present in the gastric mucosa and are involved in interactions with the host. Glucan, heptoglycan, and riban domains are present in the outer core region of some H. pylori LPSs. Amylose-like glycans and mannans are also constituents of some H. pylori strains, possibly co-expressed with LPSs. The complexity of H. pylori LPSs has hampered the establishment of accurate structure-function relationships in interactions with the host, and the design of carbohydrate-based therapeutics, such as vaccines. Carbohydrate microarrays are recent powerful and sensitive tools for studying carbohydrate antigens and, since their emergence, are providing insights into the function of carbohydrates and their involvement in pathogen-host interactions. The major goals of this thesis were the structural analysis of LPSs from H. pylori strains isolated from gastric biopsies of symptomatic Portuguese patients and the construction of a novel pathogen carbohydrate microarray of these LPSs (H. pylori LPS microarray) for interaction studies with proteins. LPSs were extracted from the cell surface of five H. pylori clinical isolates and one NCTC strain (26695) by phenol/water method, fractionated by size exclusion chromatography and analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry. The oligosaccharides released after mild acid treatment of the LPS were analysed by electrospray mass spectrometry. In addition to the conserved core oligosaccharide moieties, structural analyses revealed the presence of type-2 Lex and Ley antigens and N-acetyllactosamine (LacNAc) sequences, typically found in H. pylori strains. Also, the presence of O-6 linked glucose residues, particularly in LPSs from strains 2191 and NCTC 26695, pointed out to the expression of a 6-glucan. Other structural domains, namely ribans, composed of O-2 linked ribofuranose residues were observed in the LPS of most of H. pylori clinical isolates. For the LPS from strain 14382, large amounts of O-3 linked galactose units, pointing to the occurrence of a galactan, a domain recently identified in the LPS of another H. pylori strain. A particular feature to the LPSs from strains 2191 and CI-117 was the detection of large amounts of O-4 linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) residues, suggesting the presence of chitin-like glycans, which to our knowledge have not been described for H. pylori strains. For the construction of the H. pylori LPS microarray, the structurally analysed LPSs, as well as LPS-derived oligosaccharide fractions, prepared as neoglycolipid (NGL) probes were noncovalently immobilized onto nitrocellulosecoated glass slides. These were printed together with NGLs of selected sequence defined oligosaccharides, bacterial LPSs and polysaccharides. The H. pylori LPS microarray was probed for recognition with carbohydratebinding proteins (CBPs) of known specificity. These included Le and blood group-related monoclonal antibodies (mAbs), plant lectins, a carbohydratebinding module (CBM) and the mammalian immune receptors DC-SIGN and Dectin-1. The analysis of these CBPs provided new information that complemented the structural analyses and was valuable in the quality control of the constructed microarray. Microarray analysis revealed the occurrence of type-2 Lex and Ley, but not type-1 Lea or Leb antigens, supporting the results obtained in the structural analysis. Furthermore, the H. pylori LPSs were recognised by DC-SIGN, a mammalian lectin known to interact with this bacterium through fucosylated Le epitopes expressed in its LPSs. The -fucose-specific lectin UEA-I, showed restricted binding to probes containing type-2 blood group H sequence and to the LPSs from strains CI-117 and 14382. The presence of H-type-2, as well Htype- 1 in the LPSs from these strains, was confirmed using specific mAbs. Although H-type-1 determinant has been reported for H. pylori LPSs, this is the first report of the presence of H-type-2 determinant. Microarray analysis also revealed that plant lectins known to bind 4-linked GlcNAc chitin oligosaccharide sequences bound H. pylori LPSs. STL, which exhibited restricted and strong binding to 4GlcNAc tri- and pentasaccharides, differentially recognised the LPS from the strain CI-117. The chitin sequences recognised in the LPS could be internal, as no binding was detected to this LPS with WGA, known to be specific for nonreducing terminal of 4GlcNAc sequence. Analyses of the H. pylori LPSs by SDS-PAGE and Western blot with STL provided further evidence for the presence of these novel domains in the O-chain region of this LPS. H. pylori LPS microarray was also applied to analysis of two human sera. The first was from a case infected with H. pylori (H. pylori+ CI-5) and the second was from a non-infected control.The analysis revealed a higher IgG-reactivity towards H. pylori LPSs in the H. pylori+ serum, than the control serum. A specific IgG response was observed to the LPS isolated from the CI-5 strain, which caused the infection. The present thesis has contributed to extension of current knowledge on chemical structures of LPS from H. pylori clinical isolates. Furthermore, the H. pylori LPS microarray constructed enabled the study of interactions with host proteins and showed promise as a tool in serological studies of H. pyloriinfected individuals. Thus, it is anticipated that the use of these complementary approaches may contribute to a better understanding of the molecular complexity of the LPSs and their role in pathogenesis.

Synthesis and evaluation of polymer nanoparticles for delivery in RPE cells

Ocular pathologies are among the most debilitating medical conditions affecting all segments of the population. Traditional treatment options are often ineffective, and gene therapy has the potential to become an alternative approach for the treatment of several pathologies. Methacrylate polymers have been described as highly biocompatible and are successfully used in medical applications. Due to their cationic nature, these polymers can be used to form polyplexes with DNA for its delivery. This work aims to study the potential of PDMAEMA (poly(2-(N,N’-dimethylamino)ethyl methacrylate)) as a non viral gene delivery system to the retina. The first part of this work aimed to study the potential for gene delivery of a previously synthesized PDMAEMA polymer of high molecular weight (354kDa). In the second part, we synthesized by RAFT a PDMAEMA with a lower molecular weight (103.3kDa) and similarly, evaluated its ability to act as a gene delivery vehicle. PDMAEMA/DNA polyplexes were prepared at 5, 7.5, 10, 12.5 and 20 nitrogen/phosphorous (N/P) ratio for the 354kDa PDMAEMA and at 5 and 7.5 for the 103.3kDa PDMAEMA. Dynamic light scattering and zeta potential measurements confirmed the nanosize and positive charge of polyplexes for all ratios and for both polymers. Both high and low Mw PDMAEMA were able to efficiently complex and protect DNA from DNase I degradation. Their cytotoxicity was evaluated using a non-retinal cell line (HEK293) and a retinal pigment epithelium (RPE) cell line (D407). We have found that cytotoxicity of the free polymer is concentration and time dependent, as expected, and negligible for all the concentrations of the PDMAEMA-DNA polyplexes. Furthermore, for the concentrations to be used in vivo, the 354kDa PDMAEMA showed no signs of inflammation upon injection in the intravitreal space of C57BL/6 mice. The transfection efficiency, as evaluated by fluorescence microscopy and flow cytometry, showed that the D407 retinal cells were transfected by polyplexes of both high and low Mw PDMAEMA, but with varied efficiency, which was dependent on the N/P ratio. Althogether, these results suggest that PDMAEMA is a feasible candidate for non-viral gene delivery to the retina, and this work constitutes the basis of further studies to elucidate the bottleneck in transfection and further optimization of the material.

Quimioterapia da dengue: fármacos disponíveis e perspectivas de novas terapêuticas

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

New approaches for the diagnosis of human papillomavirus infection:relevance for clinical practice and cancer prevention

Tese de doutoramento, Biologia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em Áreas Endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Interacção Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

RESUMO As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periférico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Vigilância activa de eventos após vacinação

A vigilância de efeitos indesejáveis após a vacinação é complexa. Existem vários actores de confundimento que podem dar origem a associações espúrias, meramente temporais mas que podem provocar uma percepção do risco alterada e uma consequente desconfiança generalizada acerca do uso das vacinas. Com efeito as vacinas são medicamentos complexos com características únicas cuja vigilância necessita de abordagens metodológicas desenvolvidas para esse propósito. Do exposto se entende que, desde o desenvolvimento da farmacovigilância se tem procurado desenvolver novas metodologias que sejam concomitantes aos Sistemas de Notificação Espontânea que já existem. Neste trabalho propusemo-nos a desenvolver e testar um modelo de vigilância de reacções adversas a vacinas, baseado na auto-declaração pelo utente de eventos ocorridos após a vacinação e testar a capacidade de gerar sinais aplicando cálculos de desproporção a datamining. Para esse efeito foi constituída uma coorte não controlada de utentes vacinados em Centros de Saúde que foram seguidos durante quinze dias. A recolha de eventos adversos a vacinas foi efectuada pelos próprios utentes através de um diário de registo. Os dados recolhidos foram objecto de análise descritiva e análise de data-mining utilizando os cálculos Proportional Reporting Ratio e o Information Component. A metodologia utilizada permitiu gerar um corpo de evidência suficiente para a geração de sinais. Tendo sido gerados quatro sinais. No âmbito do data-mining a utilização do Information Component como método de geração de sinais parece aumentar a eficiência científica ao permitir reduzir o número de ocorrências até detecção de sinal. A informação reportada pelos utentes parece válida como indicador de sinais de reacções adversas não graves, o que permitiu o registo de eventos sem incluir o viés da avaliação da relação causal pelo notificador. Os principais eventos reportados foram eventos adversos locais (62,7%) e febre (31,4%).------------------------------------------ABSTRACT: The monitoring of undesirable effects following vaccination is complex. There are several confounding factors that can lead to merely temporal but spurious associations that can cause a change in the risk perception and a consequent generalized distrust about the safe use of vaccines. Indeed, vaccines are complex drugs with unique characteristics so that its monitoring requires specifically designed methodological approaches. From the above-cited it is understandable that since the development of Pharmacovigilance there has been a drive for the development of new methodologies that are concomitant with Spontaneous Reporting Systems already in place. We proposed to develop and test a new model for vaccine adverse reaction monitoring, based on self-report by users of events following vaccination and to test its capability to generate disproportionality signals applying quantitative methods of signal generation to data-mining. For that effect we set up an uncontrolled cohort of users vaccinated in Healthcare Centers,with a follow-up period of fifteen days. Adverse vaccine events we registered by the users themselves in a paper diary The data was analyzed using descriptive statistics and two quantitative methods of signal generation: Proportional Reporting Ratio and Information Component. themselves in a paper diary The data was analyzed using descriptive statistics and two quantitative methods of signal generation: Proportional Reporting Ratio and Information Component. The methodology we used allowed for the generation of a sufficient body of evidence for signal generation. Four signals were generated. Regarding the data-mining, the use of Information Component as a method for generating disproportionality signals seems to increase scientific efficiency by reducing the number of events needed to signal detection. The information reported by users seems valid as an indicator of non serious adverse vaccine reactions, allowing for the registry of events without the bias of the evaluation of the casual relation by the reporter. The main adverse events reported were injection site reactions (62,7%) and fever (31,4%).

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTIGÉNIOS DE Fasciola gigantica E SUA AVALIAÇÃO NO IMUNODIAGNÓSTICO DE FASCIOLOSE

O diagnóstico da fasciolose é feito principalmente por métodos serológicos, devido ao polimorfismo do quadro clínico e à baixa sensibilidade dos métodos parasitológicos. Contudo, estes métodos apresentam algumas limitações, pelo que a melhoria dos testes imunológicos, nomeadamente, a utilização de antigénio homólogo, pode ser um factor relevante para a especificidade do diagnóstico. Este estudo teve como objectivo a produção e avaliação de antigénios total e deslipidizado de F. gigantica no imunodiagnóstico da fasciolose pelos métodos de Micro-ELISA e Western-blot, em comparação com os de F. hepatica. Foram analisados 111 soros de indivíduos cabo-verdianos e 67 de indivíduos residentes em Portugal, de ambos os sexos, com suspeita clínica de fasciolose. Os antigénios, total e deslipidizado, foram produzidos a partir de vermes adultos de F. gigantica recolhidos de bovinos na ilha de Santiago (Cabo Verde). Os antigénios totais das duas espécies de Fasciola apresentaram a mesma sensibilidade (100%), mas a especificidade foi superior para o antigénio total de F. gigantica (95,2%), na detecção de IgG. À semelhança dos antigénios totais, os deslipidizados demonstraram uma sensibilidade de 100%. Contudo, a especificidade foi superior (95,2%) quando se utilizou o antigénio deslipidizado de F. hepatica em relação à obtida com F. gigantica, cujo valor foi de 90,5%. Quanto à detecção de IgM anti-Fasciola, os valores de sensibilidade e especificidade foram de 97% e 90,5%, respectivamente, para os antigénios totais dos dois parasitas. Na pesquisa de IgM anti-parasita, as sensibilidades foram 94% e 83% para os antigénios deslipidizados de F. gigantica e F. hepatica, respectivamente, com uma especificidade de 90,5% para ambos os antigénios deslipidizados. No Immunobloting, a fracção antigénica de 24 kDa foi comum nas quatro preparações antigénicas, quer para IgM quer para IgG anti-Fasciola, pelo que a sua caracterização poderá ser relevante para o desenvolvimento de métodos com maior especificidade e reprodutibilidade, melhorando significativamente o diagnóstico. A banda de 26 kDa, presente apenas no antigénio total de F. gigantica, parece ser específica deste parasita. Este facto leva-nos a concluir que esta banda poderá ser objecto de mais estudos, no sentido de vir a ter-se um diagnóstico diferencial entre as duas espécies de Fasciola.

Leptospirose humana na Província da Huíla: rastreio serológico e molecular de doentes assistidos no Hospital Central Dr. António Agostinho Neto, Lubango (Angola)

A Leptospirose é uma doença infecciosa causada por bactérias patogénicas do género Leptospira. Ocorre sobretudo nos países em desenvolvimento, em regiões tropicais e subtropicais. Nos últimos anos tem-se tornado um problema emergente de Saúde Pública, afectando uma grande diversidade de mamíferos (hospedeiros), incluindo os humanos. Actualmente observa-se um aumento do número de casos com alterações do padrão epidemiológico, assim como o ressurgimento de surtos epidémicos devido a alterações climáticas. No entanto, devido aos sintomas inespecíficos, o diagnóstico clínico é confundível com outras doenças e o laboratorial é difícil e dispendioso, requerendo recursos e técnicos especializados. Em Angola (Lubango), o diagnóstico laboratorial não é praticado devido à indisponibilidade de testes específicos, resultando no desconhecimento da sua prevalência. Assim, de modo, a determinar a sero-ocorrência da Leptospirose humana em doentes febris assistidos no Hospital Central do Lubango, contribuindo para: i) a possível inclusão desta doença no diagnóstico diferencial de doentes com síndromes febris indeterminados; e ii) implementar medidas de prevenção e controlo. Foram analisadas 300 amostras séricas obtidas em igual número de doentes febris que recorreram ao referido hospital, no período de Setembro a Dezembro de 2012, aos quais também se aplicou um inquérito clínico-epidemiológico. Foi realizada uma avaliação serológica usando a técnica de rastreio (MACROLepto), e a técnica de referência (Técnica de Aglutinação Microscópica; TAM). Para a análise molecular usou-se a Reacção em Cadeia de Polimerase (PCR), em soro utilizando primers baseados no gene hap1 (para leptospiras patogénicas). Os produtos amplificados foram sequenciados para determinação de espécies genómicas de Leptospira. A amostra populacional foi constituída por indivíduos do género masculino (111; 37%) e (189; 63%) do género feminino. A suspeita clínica de Leptospirose foi confirmada serologicamente pela TAM em (120+/300; 40%) dos doentes, e a análise por PCR foi positiva em (30+/193; 16%) das amostras analisadas. A sequenciação do DNA obtido permitiu identificar três espécies genómicas: L. borgpetersenii, L. interrogans e L. kirschneri. Os participantes no estudo foram distribuídos por grupos etários, e a média de idade foi de 30 anos, sendo os grupos (11-20 e 21- 30 anos) os mais representados, e o género feminino o mais afectado (61%). As principais manifestações clínicas foram a febre (91%), cefaleias (84%) e mialgias (59%). Em relação as variáveis de risco de infecção por Leptospira spp., verificou-se que a ausência de saneamento básico, exposição aos lixos, presença de roedores próximos das populações e o consumo de água não tratada, foram as situações mais referidas. O contacto com os roedores, seguido dos canídeos, foi referido por 97% e 41% dos doentes com resultado positivo. Quanto à proveniência, a maioria dos doentes veio de áreas suburbanas. No que respeita à ocupação destacaram-se as mulheres camponesas, estudantes e domésticas. Os soros com resultado positivo mostraram reactividade específica para leptospiras de 19 serogrupos (serovares) com maior destaque, Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Hebdomadis, Javanica (Poi) Australis (Bratislava) e Sejroe (Hardjobovis). O título mais elevado foi de 1:800 observado para os serovares Copenhageni, Ballum (Arborea), Panama e Pyrogenes. Os resultados obtidos mostraram que a Leptospirose está presente entre os doentes febris na província da Huíla, sendo importante incluir esta zoonose no diagnóstico diferencial e promover medidas de prevenção e controlo, especialmente nos grupos de risco agora identificados.

Leptospirose e Fasciolose: Interacções imunológicas no polimorfismo do quadro clínico dos doentes de São Miguel (Açores)

O arquipélago dos Açores apresenta nove ilhas vulcânicas, sendo São Miguel a maior e mais populosa. Nesta região insular portuguesa, a Leptospirose é uma zoonose endémica, que afeta acidentalmente o Homem por contacto direto ou indireto com leptospiras patogénicas. Clinicamente, esta patologia apresenta diversos sintomas que podem ser semelhantes a uma gripe ou evoluir até um quadro fulminante, daí a necessidade de um diagnóstico preciso com confirmação laboratorial. A Fasciolose é outra importante doença zoonótica nos Açores que tem sido descrita como endémica neste arquipélago, causada pelo parasita Fasciola hepatica. A infeção humana pode ocorrer devido ao consumo de vegetais e/ou águas contaminados. O diagnóstico não é fácil, pois a infeção pelo parasita pode apresentar uma larga variedade de quadros clínicos. O objetivo deste estudo é contribuir para a clarificação de uma possível interação imunológica, ao nível da resposta humoral observada em indivíduos com diagnóstico clínico de Leptospirose e/ou Fasciolose, em pacientes da ilha de São Miguel que apresentam um quadro clínico e epidemiológico comum a ambas as patologias, contribuindo para um melhor diagnóstico diferencial. A amostra utilizada no estudo é composta por 280 soros de indivíduos residentes na ilha de São Miguel, que foram analisados entre 2005 e 2010 pela TAM (Técnica de Aglutinação Microscópica), para deteção de aglutininas anti-Leptospira interrogans s.l.. Nas amostras de soro com resultado positivo e inconclusivo pela TAM foi aplicada a técnica de rastreio micro-ELISA para o estudo da Fasciolose. Aplicou-se ainda a técnica de Imunoeletrodifusão (IED), como técnica confirmatória, nos soros com resultado positivo e em alguns inconclusivos (n=118) para a técnica micro-ELISA. Os resultados da TAM, previamente conhecidos, para o total de indivíduos estudados foram os seguintes: 124 (44,3%) negativos, 73 (26,1%) inconclusivos e 83 (29,6%) positivos. Estes soros foram submetidos ao teste micro-ELISA, tendo-se obtido 31,1% (n=87) resultados positivos, 31,4% (n=88) resultados inconclusivos e 37,5% (n=105) com resultado negativo para Fasciolose. Foram analisados os inquéritos clínico-epidemiológicos estabelecido para o estudo da Leptospirose humana em São Miguel para as amostras anteriormente referidas, verificando-se que os homens lavradores em idade ativa são o grupo com mais casos positivos para ambas as patologias. Além disso, os sinais e sintomas mais comuns nos doentes com resultado positivo para as duas doenças são semelhantes aos de uma gripe, e analiticamente foi notório que as transaminases, a FA/γGT (apenas nos doentes com Leptospirose) e a leucocitose tinham níveis elevados. Os resultados revelaram uma provável coinfeção em 36 doentes. A técnica de IED foi positiva em 28 amostras de soro, sendo que cinco tiveram resultado positivo para as três técnicas utilizadas. Estes resultados são promissores, demonstrando uma possível relação entre Leptospirose e Fasciolose, sendo que os respetivos agentes etiológicos partilham nichos ecológicos, o que justifica igualmente algumas semelhanças nos aspetos sociodemográficos e clínico-epidemiológicos na população afetada.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Incidencia de la explotación minera en la disputa territorial en el municipio de Segovia. 2002-2010

El interés de la presente investigación está sostenido en analizar la estructuración de la política pública minero-energética, los instrumentos utilizados para su posterior implementación en el municipio de Segovia, Antioquia, y la incidencia que tiene en las tensiones de los actores que tienen presencia en este lugar. Se utiliza la Acumulación por Desposesión para la interpretación de los hechos ocurridos en Segovia, donde se procede a evidenciar que la imposición o inclusión de nuevos modos de producción, genera resistencias que entran en disputa entre sí y que producen la reconfiguración espacial del municipio.