Dépistage prénatal de la trisomie 21 et autres aneuploïdies au premier trimestre

La présente thèse par articles aborde différentes facettes du dépistage prénatal de certaines aneuploïdies au premier trimestre de la grossesse. L’introduction retrace l’historique du dépistage prénatal et énonce les différents marqueurs biochimiques et échographiques associés aux aneuploïdies. La première publication démontre que le tabagisme maternel abaisse significativement les niveaux sanguins maternels de PAPP-A et de la fraction libre de la β-hCG et augmente significativement la clarté nucale, confirmant la nécessité de contrôler cette co-variable dans le calcul de risque final, du moins pour la trisomie 18. Le deuxième article identifie des seuils de clarté nucale au-delà desquels la biochimie génétique n’apporte aucune valeur additionnelle au dépistage prénatal de la trisomie 21 et de la trisomie 18. Pour les fœtus avec clarté nucale supérieure aux seuils établis, un diagnostic prénatal intrusif devrait être offert sans délai. Le troisième et dernier article porte sur la première détermination des niveaux plasmatiques maternels de la protéine FLRG (follistatin-related gene) au premier trimestre de grossesse et sur son rôle potentiel à titre de marqueur biochimique dans le dépistage prénatal de la trisomie 21. Bien que détectables, les niveaux plasmatiques maternels de FLRG ne sont pas significativement altérés en présence de fœtus avec syndrome de Down. Dans la discussion générale, les trois articles sont abordés sous un angle plus spécifique au Québec. Des données complémentaires et originales y sont présentées. Une discussion sur l’évolution future du dépistage prénatal est entamée et des axes de recherche sont proposés.

Expression of steroidogenic proteins and genes in bovine placenta from conventional and somatic cell nuclear transfer (SCNT) gestations

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus.

La dynamique chromatinienne induite par le pic de LH dans les cellules de granulosa chez la souris

La régulation transcriptionnelle des gènes est un processus indispensable sans lequel la diversité phénotypique des cellules ainsi que l’adaptation à leur environnement serait inexistant. L’identification des éléments de régulation dans le génome est d’une importance capitale afin de comprendre les mécanismes gouvernant l’expression des gènes spécifiques à un type cellulaire donné. Ainsi, suite au pic de LH, le follicule ovarien entre dans un programme intensif de différentiation cellulaire, orchestré par des modifications majeures du profile transcriptionnel des cellules de granulosa, déclenchant ultimement l’ovulation et la lutéinisation, processus indispensables à la fertilité femelle. L’hypothèse supportée par cette étude stipule qu’une réorganisation de la structure chromatinienne survient aux régions régulatrices d’une panoplie de gènes dans les heures suivant le pic de LH et qu’en isolant et identifiant ces régions, il serait possible de retrouver des éléments essentiels aux processus d’ovulation et de lutéinisation. Ainsi, en utilisant un protocole standard de superovulation chez la souris, les éléments de régulation se modifiant 4h suivant l’administration de hCG ont été isolés et identifiés dans les cellules de granulosa en utilisant la méthode FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combinée à un séquençage haut débit. Cette étude a démontré que suite au stimulus ovulatoire, les cellules de granulosa subissent une reprogrammation majeure des éléments de régulation, qui est corrélée avec une modification drastique de leurs fonctions biologiques. De plus, cette étude a mis en évidence une association majoritaire des éléments de régulation à des régions intergéniques distales et à des introns, indiquant que ces régions ont une importance capitale dans la régulation transcriptionnelle dans les cellules de granulosa. Cette étude a également permis d’identifier une panoplie de régulateurs transcriptionnels reconnus pour être essentiels à la fonction ovarienne, ainsi que leur sites de liaison dans le génome, démontrant que la méthode FAIRE est une méthode assez puissante pour permettre la prédiction d’événements moléculaires précis ayant un sens physiologique réel.

The orphan nuclear receptor NR5A2 regulates peri-ovulatory events and their consequent luteinization in mice

Le récepteur nucléaire Nr5a2, également connu sous le nom de liver receptor homolog-1 (Lrh-1), est exprimé au niveau de l’ovaire chez la souris, exclusivement dans les cellules lutéales et de la granulosa. La perturbation de Nr5a2, spécifique aux cellules de la granulosa chez la souris à partir des follicules primaires dans la trajectoire du développement folliculaire a démontré que Nr5a2 est un régulateur clé de l’ovulation et de la fertilité chez la femelle. Notre hypothèse veut que Nr5a2 régule les évènements péri- et post-ovulatoires dans une séquence temporelle lors de la folliculogénèse. Afin d'étudier l’implication de Nr5a2 lors de l’ovulation et de la lutéinisation à différents stades du développement folliculaire, nous avons généré deux modèles de souris knockout spécifiques aux cellules de la granulosa pour Nr5a2: 1) Nr5a2Amhr2-/-, avec une réduction de Nr5a2 à partir des follicules primaires et subséquents; 2) Nr5a2Cyp19-/-, avec une réduction de Nr5a2 débutant au stade antral de développement en progressant. L’absence de Nr5a2 à partir des follicules antraux a résulté en une infertilité chez les femelles Nr5a2Cyp19-/-, de même qu’en des structures non-fonctionnelles similaires aux structures lutéales au niveau des ovaires, en une réduction des niveaux de progestérone synthétisée ainsi qu’en un échec dans le support d’une pseudo-gestation. La synthèse de progestérone a été entravée suite à l’absence de Nr5a2 par l’entremise d’une régulation à la baisse des gènes reliés au transport du cholestérol, Scarb1, StAR et Ldlr, démontré par qPCR. Les complexes cumulus-oocytes des femelles Nr5a2Cyp19-/- immatures super-stimulées ont subi une expansion in vivo, mais l’ovulation a été perturbée, possiblement par une régulation à la baisse du gène du récepteur de la progestérone (Pgr). Un essai d’expansion du cumulus in vitro a démontré une expansion défectueuse du cumulus chez les Nr5a2Amhr2-/-, associée à un dérèglement de la protéine des jonctions communicantes (Gja1; Cx43). Cependant, l’expansion du cumulus chez les Nr5a2Cyp19-/- n’a pas été autant affectée. Des résultats obtenus par qPCR ont démontré une régulation à la baisse dans l’expression des gènes Areg, Ereg, Btc et Tnfaip6 chez les deux modèles de cellules ovariennes knockout à 2h et 4h post hCG. Nous avons observé que 85% des oocytes, chez les deux génotypes mutants, peuvent subir une rupture de la vésicule germinative, confirmant leur capacité de maturation in vivo. La technique d’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïdes a prouvé que les oocytes des deux génotypes mutants sont fertilisables et que 70% des embryons résultants ont poursuivi leur développement vers le stade de blastocyste, et ce, indépendamment du génotype. En conclusion, Nr5a2 régule la fertilité chez les femelles tout au long du processus du développement folliculaire. Il a été démontré que Nr5a2 est essentiel à la lutéinisation et que sa perturbation dans les cellules somatiques ovariennes ne compromet pas la capacité des oocytes à être fertilisés. En vue d’ensemble, nous avons fourni une investigation inédite et complète, utilisant de multiples modèles et techniques afin de déterminer les mécanismes par lesquels Nr5a2 régule les importants processus que sont l’expansion du cumulus, l’ovulation ainsi que la formation du corps jaune.

Fault Tolerant Error Coding and Detection using Reversible Gates

In recent years, reversible logic has emerged as one of the most important approaches for power optimization with its application in low power CMOS, quantum computing and nanotechnology. Low power circuits implemented using reversible logic that provides single error correction – double error detection (SEC-DED) is proposed in this paper. The design is done using a new 4 x 4 reversible gate called ‘HCG’ for implementing hamming error coding and detection circuits. A parity preserving HCG (PPHCG) that preserves the input parity at the output bits is used for achieving fault tolerance for the hamming error coding and detection circuits.

Tamizaje combinado de primer trimestre para aneuploidias en una población bogotana

El tamizaje combinado prenatal de primer trimestre para la detección de aneuploidías, ajusta la edad materna, la medida de sonolucencia nucal fetal y concentraciones séricas maternas de PAPP-A y B-hCG para calcular este riesgo. Se han observado variaciones en los MoM s de los analítos séricos maternos de acuerdo a variables como raza, peso, numero de fetos y técnicas de reproducción asistida. Objetivo: calcular los valores de PAPP-A y B-hCG y sus MoM s en la población estudiada comparándolos con población caucásica, evaluando el desempeño de la prueba. Metodología: este es un estudio retrospectivo realizado en 926 mujeres embarazadas con 10 a 13,6 semanas. Se calculan concentraciones séricas y MoM s corregidos para peso, raza y técnicas de reproducción asistida de la PAPP-A y B-hCG, el riesgo de presentar síndrome Down al nacimiento, sensibilidad y tasa de falsos positivos para la prueba. Resultados: la edad materna media fue de 33,6 años (rango entre 20 y 45 años). Los MoM s de PAPP-A fueron 11,8% inferiores respecto a la población caucásica. El 9.4% de las pacientes obtuvieron un riesgo positivo y el 3,3% presento alteraciones citogenéticas en el cariotipo fetal. La sensibilidad del tamizaje fue del 100% con una tasa de falsos positivos del 5,7% en un punto de corte de 1 en 250. Conclusión: el tamizaje combinado de primer trimestre es un método efectivo para la detección de aneuploidías. Los MoM s de la PAPP-A son un 11,8% inferiores en la población estudiada y esto debe ajustarse para disminuir la tasa de resultados falsos positivos.

Rendimiento operativo de la tamizacion doble ajustada por raza para la deteccion de aneuploidias en poblacion colombiana

Actualmente, los algoritmos utilizados para la detección de alteraciones cromosómicas se han basado en los resultados obtenidos de poblaciones caucásicas, afrocaribeñas y asiáticas, las cuales, no tienen las mismas características de la raza mestiza. De allí, surgió el interés de realizar un estudio que permitiera determinar los valores de los marcadores serológicos, empleados en la tamización de aneuploidías, en población latina, para establecer un punto de corte ajustado a la raza mestiza. Se encuentra en desarrollo un estudio de validación de prueba diagnóstica, cuyos avances se presentan a continuación. En esta investigación, hasta el momento, se han incluido 1418 pacientes entre 11-13.6 semanas, sometidas a tamización combinada para la detección de aneuploidías. Se realizó un ajuste por raza de valores de medianas y sus múltiplos para los marcadores y se determinó el rendimiento operativo de la prueba luego de dicho ajuste. Posteriormente, se realizó una comparación entre ambas pruebas. Los niveles de B-hCG son 17.1 % más bajos en población mestiza colombiana, comparado con población caucásica y los niveles de PAPP-A son 19% inferiores. Las tasas de detección de la prueba, utilizando los valores convencionales, son del 60 % y, luego del ajuste por raza, es del 53 %. Haciendo el cálculo de riesgo, utilizando los nuevos múltiplos de mediana, no existen diferencias en aplicar la tamización con los valores convencionales entre las semanas 11 y 12 pero, en semana 13, los valores aplicados a población caucásica presentan una mejor tasa de detección que utilizar la prueba ajustada.

Maturação e fecundação "in vitro" de ovócitos de caninos domésticos (Canis familiaris)

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Produção in vitro de embriões bovinos utilizando diferentes condições de maturação oocitária

O experimento avaliou o uso do meio TCM-199 suplementado com: SVE, SEE e SFB (meio indefinido); BSA (meio semi-definido) e PVA (meio definido); na presença ou ausência de hormônios (FSH e hCG) na maturação in vitro de oócitos bovinos nas condições do Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução da UFRGS. Complexos cumuli-oophorus (CCOs), em número total de 1458, foram aleatoriamente distribuídos em doze tratamentos, maturados por 24 h em atmosfera de 5% CO2, em ar e 100% umidade relativa em estufa a 39°C. A fecundação nos doze tratamentos foi realizada mediante exposição dos CCOs maturados aos espermatozóides (1x106/mL), previamente capacitados, durante 20 h. O cultivo foi realizado em fluído sintético de oviduto modificado (SOFaa) acrescido de 10% SVE a 39°C, 100% de umidade relativa do ar e 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Na presença de hormônios os meios indefinidos (SVE: 63,6%, 70/110; SEE: 53,4%, 70/131 e SFB: 56,0%, 75/134) apresentaram maior eficiência em proporcionar suporte à primeira divisão embrionária, em comparação ao meio definido (PVP: 50,6%, 45/89). Os CCOs maturados em meio indefinido suplementado com SVE e hormônios apresentaram maior competência em fecundar e suportar o desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto após sete dias de cultivo (27,3%, 30/110).

Aspiração folicular por via transvaginal guiada por ultrasom em eqüinos.

A técnica de aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-som (TUGA) foi utilizada pela primeira vez em reprodução assistida de eqüinos em 1992 e desde então vem sendo aperfeiçoada. Com o crescente interesse nos procedimentos de transferência de oócitos (TO), transferência de gametas intrafallopiana (GIFT) e mais recentemente na transferência nuclear (TN), a recuperação de oócitos de boa qualidade tornou-se um passo fundamental do processo. Diversas técnicas e equipamentos podem ser empregados com esta finalidade. Os experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar a taxa de recuperação de oócitos de folículos pré-ovulatórios de cinco protocolos de punções. Dois níveis de pressão negativa: Baixa (B) (150 – 200 mmHg) e Alta (A) (250 – 300 mmHg) e três modelos de agulha: curta 14 G (C14); curta 18 G (C18) e longa 18 G (L18) foram testados. Cinqüenta e quatro folículos de 48 éguas foram aspirados. Estes animais foram distribuídos completamente ao acaso em cinco grupos experimentais (G) GI: (B-C14) (n=22); GII: (B-L18) (n=3); GIII: (B-L18) (n=18); GIV: (A-C18) (n=5); GV: (A-L18) (n=6). Vinte e duas éguas receberam 2500 UI de hCG, 14 tiveram seus folículos aspirados e 2 oócitos foram recuperados (14,3%) Dos 54 folículos aspirados, 4 oócitos foram recuperados (7,41%): GI (n=1), GIII (n=1) e GIV (n=2). Três destes oócitos foram transferidos para o oviduto de éguas receptoras através das técnicas de GIFT (n=2) e TO (n=1). Não foi observado desenvolvimento embrionário nas receptoras nos 14, 15 e 16 dias pós-transferência.

Induced spawning of hatchery-raised Brazilian catfish, cachara Pseudoplatystoma fasciatum (Linnaeus, 1766)

In the months of January 2001 and 2002, female cachara Pseudoplatystoma fasciatum were selected during their first and second gonadal maturation (2 years and 7 months old and 3 years and 7 months old, respectively) with an of oocyte diameter of 937.5 mum (82.5% with central nuclei and 17.5% with peripheral nuclei). Nine females in first maturation received two doses of carp pituitary extract (CPE), 0.5 mg/kg and 5.0 mg/kg; seven received two doses of human chorionic gonadotropin (hCG), 5 and 10 IU/g; five received doses of 0.5 CPE mg/kg and 5 hCG IU/g (CPE+hCG); and four received 0.9% saline (saline). Nine females from CPE and seven from hCG presented oocytes with the same diameter at the moment of oocyte release (100% with germinal vesicle breakdown and fertilization rate of 53.44 +/- 18.3 and 54.81 +/- 11.8%; larvae number of 165,330 +/- 94.1 and 158,570 +/- 20.6, respectively). The five females from CPE+hCG did not respond to the hormonal treatment. The four females from the saline group did not ovulate. In January 2002, 6 of 15 selected females that were going through the second reproductive cycle received CPE (five received hCG and four received saline), showing oocyte diameters similar to the ones in the first maturation. At stripping, CPE females had an oocyte diameter of 1062.5 mum (the hCG females had oocyte diameters ranging from 937.5 to 1125.0 mum; fertilization rates of 56.08 +/- 30.9 and 81.90 +/- 17.3%; 364,547 +/- 244 and 633,129 +/- 190, larvae, respectively). The fertilization rates and larvae number were higher in the second gonad maturation, both for CPE and hCG. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

Testosterona e gonadotrofina coriônica humana estimulam a esteroidogênese em células da granulosa de folículo pré-ovulatório de égua?

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Effect of insulin-like growth factor-1 during in vitro oocyte maturation and in vitro culture of bovine embryos

Avaliaram-se o efeito do IGF-I na maturação in vitro (MIV) (experimento I) e no desenvolvimento embrionário (DE) (experimento II) de oócitos bovinos fecundados in vitro, quanto às taxas de clivagem (TC), de blastocistos (TB) e de eclosão (TE). Para MIV, complexos cumulus-oócitos imaturos foram cultivados em meio TCM-199 suplementado com HEPES, bicarbonato e piruvato de sódio, aditivos, soro fetal bovino (meio B-199) e gonadotrofinas 14U/ml de PMSG e 7U/ml de hCG). Para o desenvolvimento embrionário, os oócitos/zigotos foram cultivados em meio B-199 com células epiteliais do oviduto bovino em suspensão sob óleo de silicone. As condições de cultivo in vitro para ambos os experimentos seguiram os tratamentos: 1- meio B-199 + 200 ng/ml IGF-I; 2- B-199 + 100 ng/ml IGF-I; 3- B-199 + 50 ng/ml IGF-I; 4- B-199 + 10 ng/ml IGF-I; 5- B-199 + 0 ng/ml IGF-I. Todas as culturas foram realizadas a 38,5° C em atmosfera com 5% de CO2 e os dados foram analisados pelo teste do qui-quadrado. No experimento I, não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto às TC, TB e TE, quando o meio de MIV foi suplementado com IGF-I. No experimento II, a adição de IGF-I ao meio de DE resultou em aumento na TC (P<0,05) mas não influenciou a TB e a TE. A adição de 200 ng/ml de IGF-I ao meio DE melhorou a TC (71,1%) quando comparada com a TC dos grupos de 100 ng/ml de IGF-I (57,6%) ou controle (56,7%), entretanto não houve diferença quando comparada com a dos grupos de 50 ng/ml (69,4%) ou 10 ng/ml (73,1%) de IGF-I. Não houve efeito benéfico na adição de 10 a 200 ng/ml de IGF-I nos meios de MIV e de DE com relação ao desenvolvimento de embriões produzidos a partir de oócitos maturados e fecundados in vitro.

Effects of Hormonal Supplementation on Nuclear Maturation and Cortical Granules Distribution of Canine Oocytes During Various Reproductive Stages

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Ovarian remnant syndrome in small animals

The ovarian remnant syndrome (ORS) is an iatrogenic disorder in bitches and queens, which is characterized by recurrence of estrus following surgical spay, due to the presence of a piece of ovarian tissue within the abdominal cavity. In most cases, the remnant ovary is found in the right ovarian pedicle, due to its topographic position, deeper and more cranial than the left ovary. The main clinical signs of ORS in small animals are the heat behavior and the presence of vaginal swelling/secretion, especially in canines. The diagnosis should be performed by means of vaginal cytology when attraction of males is detected, serum estrogen and progesterone levels and/or by challenging test with GnRH or hCG administration. However, vaginal citology is the most suitable and less expensive diagnostic tool. Nowadays the treatment of choice is a new laparotomy or laparoscopy, followed by removal of the remnant ovarian tissue. The surgical treatment has more chances of success if it is performed in the diestrus (i.e., between 15 and 60 days after the detection of attraction of males). Furthermore, a careful and accurate surgical procedure aided by advanced visualization techniques during ovariohysterectomy or ovariectomy is the best way to prevent ORS in companion animals.