The isolation, characterization, and application of WRKY genes as useful molecular markers in tropical trees

The improvement of tropical tree crops using conventional breeding methods faces challenges due to the length of time involved. Thus, like most crops, there is an effort to utilize molecular genetic markers in breeding programs to select for desirable agronomic traits. Known as marker assisted breeding or marker assisted selection, genetic markers associated with a phenotype of interest are used to screen and select material reducing the time necessary to evaluate candidates. As the focus of this research was improving disease resistance in tropical trees, the usefulness of the WRKY gene superfamily was investigated as candidates for generating useful molecular genetic markers. WRKY genes encode plant-specific transcriptional factors associated with regulating plants' responses to both biotic and abiotic stress. ^ One pair of degenerate primers amplified 48 WRKY gene fragments from three taxonomically distinct, economically important, tropical tree crop species: 18 from Theobroma cacao L., 21 from Cocos nucifera L. and 9 from Persea americana Mill. Several loci from each species were polymorphic because of single nucleotide substitutions present within a putative non-coding region of the loci. Capillary array electrophoresis-single strand conformational polymorphism (CAE-SSCP) mapped four WRKY loci onto a genetic linkage map of a T. cacao F2 population segregating for resistance to witches' broom disease. Additionally, PCR primers specific for four T. cacao loci successfully amplified WRKY loci from 15 members of the Byttneriae tribe. A method was devised to allow the reliable discrimination of alleles by CAE-SSCP using only the mobility assigned to the sample peaks. Once this method was validated, the diversity of three WRKY loci was evaluated in a germplasm collection of T. cacao . One locus displayed high diversity in the collection, with at least 18 alleles detected from mobility differences of the product peaks. The number of WRKY loci available within the genome, ease of isolation by degenerate PCR, codominant segregation demonstrated in the F2 population, and usefulness for screening germplasm collections and closely related wild species demonstrates that the WRKY superfamily of genes are excellent candidates for developing a number of genetic molecular markers for breeding purposes in tropical trees. ^

Identification de caractéristiques agronomiques pour le diagnostic et la prise de décision de régénération des vergers de cacaoyers en Côte d’Ivoire

The rehabilitation of the old cocoa ( Theobroma cacao L. ) farms is one of the major challenges for a sustainable cocoa production. A study was carried out to set up a guide which could be used as a decision making tool for a quick and efficient diagnosis of the old cocoa orchards and to choose the appropriate regeneration option (rehabilitation or replanting). A sample of 90 rehabilitated cocoa farms and of 75 replanted cocoa farms was surveyed in 12 regions representing the three main cocoa producing sectors in the country. Data were collected on the key agronomic characteristics of these cacao farms. These were cocoa variety, farm size, age, yield, planting density, number of shade trees and the level of damages caused by insects and diseases. The results showed that age, planting density and yield were the discriminating criteria of these farms. The average values of these criteria were 25 to 30 years for the age, 800 to 1 000 trees ha-1 for the planting density and 250 to 400 kg ha-1 an-1 for the yield. Based on these criteria and their average values, a decision making guide was designed for the diagnosis of cocoa farms and the choice of regeneration option. According to this guide, old cocoa farms (more than 25 years), degraded and unproductive should be replanted. However, younger farms having planting density and yield higher than the average values above should be rehabilitated.

HETEROSIS AND HERITABILITY ESTIMATES OF PURINE ALKALOIDS AND POLYPHENOLS IN COCOA

Cocoa ( Theobroma cacao L. ) is an important allogamous tropical tree crop, whose centre of diversity is considered to be in Central America. Dry cocoa beans from five cocoa clones, and their intercrossed hybrids were analysed based on the variation of alkaloids and polyphenolic compounds contents, in order to gain insights on the heterosis and broad-sense heritability. Polyphenols and alkaloids were analysed at 280 nm by HPLC, using a Photodiode Array Detector (PDA); while anthocyanins were separated with the SEP-PAK Vac 6cc 1000 mg (waters) column and measured at 520 nm with a PDA. Dry cocoa beans displayed high content of purine alkaloids (2.1 and 8.8 mg g-1 for caffein and theobromine, respectively), and polyphenols (25 and 2978 µg g-1 for catechin and epicatechin, respectively). Among the five cocoa clones, SNK16 was the highest in purine alkaloid (caffein and theobromin) and flavanol (catechin and epicatechin); while T79/467 possessed the greatest quantity of cyanidin-3-galactoside and cyanidin-3-arabinoside. From all the parameters studied, anthocyanins (Cyanidin-3-galactoside and cyanidin-3-arabinoside) exhibited the highest level of heterosis. Parental genotypes SNK16 and T79/467 showed good aptitudes for the combination of characters because their reciprocal hybrids F5 and F9, distinguished themselves by better levels of mid-parent heterosis values. Besides, the heritability value in strict sense of this Cyanidin-3-galactoside was very high. Absence of significant difference between genotypes, coming from reciprocal crossbreeding for Cyanidin-3-galactoside, suggests that this character in cocoa would be nuclear contrary to purine alkaloids and flavan-3-ols, where their transmission to offsprings can be stated as cytoplasmic.

Avaliação do óleo essencial de Piper marginatum sobre Moniliophthora perniciosa, causador da vassoura-de-bruxa no cupuaçuzeiro.

O cupuaçu (Theobroma grandiflorum) é um dos frutos com potencial econômico na região Amazônica, e um dos principais problemas que vêm diminuindo a produção no Amazonas é a vassoura-de-bruxa, causada por Moniliophythora perniciosa, reduzindo em até 60% a produção. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do óleo essencial de Piper marginatum na inibição do crescimento micelial e na germinação de esporos do fungo in vitro.

Caracterização genética da pimenta-do-reino e do cupuaçu através de isoenzimas.

O objetivo da pesquisa foi analisar a variação isoenzimática presente em híbridos e cultivares de pimenta-do-reino (Piper nigrum) e acessos de cupuaçu (Theobroma grandiflorum). O material utilizado foi proveniente dos bancos de germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental. As metodologias para a extração das enzimas, formulação de tampões do gel e da cuba e para os procedimentos de coloração foram os descritos por Tsumura, 1990, modificado. Foram testados dezoito sistemas enzimáticos: FUM, ACP; PGI; SKDH; ACO; GOT; G6PD ; 6PGD; DIA; MNR; ME; MDH; GDH; PGM; TZO; ADH; LAP e SoDH. As interpretações genéticas foram feitas de acordo com o método descrito por Alfenas et al., 1991. Concluiu-se, através dos padrões eletroforéticos encontrados, que seis sistemas empregados apresentaram polimorfismo enzimático para a pimenta-do-reino e quatro para o cupuaçu. A presença de heterozigosidade nos materiais estudados significa variabilidade a ser explorada no programa de melhoramento genetic° destas espécies. A resolução obtida nestes sistemas com bandas bem nítidas indica a presença de atividade enzimática em folhas jovens de pimenta-do-reino e cupuaçu.

Características agronômicas avaliadas em progênies de cupuaçuzeiro, oriundas do programa de melhoramento genético da Embrapa Amazônia Oriental.

O cupuaçuzeiro Theobroma grandiflorum (Willd. ex. Spreng.) Schum., pertencente à família Malvaceae, é uma fruteira nativa da floresta tropical úmida. Esta pesquisa teve objetivo de avaliar caracteres agronômicos em 25 progênies de cupuaçuzeiro, tolerantes à vassoura-de-bruxa, no período de 2009 a 2014. O plantio foi intalado em 2008 no município de São Francisco do Pará, PA. O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com 25 tratamentos, cinco repetições e três plantas por parcela, consorciados com bananeira. A progênie 209 destacou-se dentre as demais devido sua média, todavia não sendo única quanto ao teste estatístico aplicado. No geral, o ensaio obteve bom desempenho, não havendo significativa variação na amplitude dos resultados das variáveis empregadas.

Caracterização floral de acessos de cupuaçuzeiro procedentes de áreas de produtores de Tomé-Açu, PA.

O cupuaçuzeiro, dentre todas as espécies do seu gênero, é o que apresenta as maiores flores. Observando as flores de diferentes plantas têm sido possível notar variações para esse componente estrutural, o qual poderá ser utilizado futuramente na discriminação de genótipos. Este trabalho objetivou caracterizar morfologicamente os componentes florais de 16 acessos coletados no município de Tomé-Açu, PA. Tal experimento é encontrado na forma de teste clonal. O delineamento experimental foi de blocos inteiramente casualizados com 5 repetições e 3 plantas por parcela, totalizando 15 botões/flores por clone. Para transformar as informações quantitativas em qualitativas foi calculada a média e o desvio-padrão de cada uma das variáveis florais. A partir dessas informações foram estimados os limites superior e inferior de advertência, definindo-se as categorias de cada descritor. Após empregar as definições obtidas a cada acesso, formou-se o perfil destes com base nos descritores florais estudados. Tais resultados demonstraram variabilidade mediana dentro dessa coleção.

Caracterização morfológica de frutos de acessos de cupuaçuzeiro procedentes do banco ativo de germoplasma Belém.

Esta pesquisa teve por objetivo realizar a caracterização morfológica de frutos de acessos de cupuaçuzeiro procedentes da coleção Belém com vistas a conhecer sua variabilidade e identificar materiais para aproveitamento no programa de melhoramento genético do cupuaçuzeiro. O experimento da coleção Belém foi instalado na base física da Embrapa Amazônia Oriental. Os materiais são compostos de 31 clones, cujos acessos foram coletados no Amazonas, Pará e Amapá. Foi utilizado o delineamento experimental em blocos inteiramente casualizados, com 10 repetições e analisados cinco frutos por planta em cada safra utilizando os dados fenotípicos dos anos agrícolas de 1997 à 2015. O perfil dos acessos demonstrou baixa variabilidade dentro dessa população para grande parte dos descritores estudados quando classificados nas categorias propostas para cada descritor analisado. Foi possível obter o perfil de cada clone para os descritores empregados. Os componentes centesimais quando associados à produção de frutos permitirão identificar clones promissores para o programa de melhoramento e recursos genéticos do cupuaçuzeiro.

Composição isotópica do carbono do solo em sistemas agroflorestais com base na palma de óleo no nordeste da Amazônia.

Plantas de ciclo C3 apresentam variações na abundância isotópica de 13C na faixa de -20 a -34 deltas e plantas de ciclo C4, de -9 a -17 deltas. O estudo foi realizado em dois sistemas agroflorestais (SAFs), um com base na palma de óleo e outro com base em palma de óleo e cacau, em Tomé-Açu, nordeste do Pará. A determinação foi nas profundidades: 0-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-70 e 70-100 cm. De modo geral até 10 cm, os sistemas apresentaram uma média de -20,5% no segundo ano de cultivo; aos cinco anos de abundânciaa ?13C diminuiu ?4%, sendo que no SAF Palma, a abundância ?13C diminuiu mais evidentemente que no sistema SAF Palma+cacau. O carbono proveniente do uso anterior da área (pastagem) está sendo substituído pelo C adicionado pelos SAFs com palma.

Influência da vassoura de bruxa na fenologia do cupuacuzeiro.

O cultivo do cupuaçuzeiro [Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) Schum.] está em franca expansão na Amazônia brasileira. O principal fator limitante é a vassoura de bruxa, doença causada pela Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, cujo único controle econômico conhecido é a poda fitossanitária. A fenologia de dez cupuaçuzeiros em monocultivo, em solo Latossolo Amarelo distrófico adubado na região de Manaus, AM, foi avaliada de maio 1987 a dezembro 1990. O número de flores foi reduzido pela vassoura e pela poda, mas a duração e periodicidade da floração não foram muito afetadas. O número médio de frutos por planta caiu de 36 em 1987 para 6 em 1989, afetado pela vassoura e pela poda, tendo recuperado para 15 em 1990. A frutificação foi antecipada e sua duração reduzida em comparação ao estudo anterior, possivelmente devido à adubação e/ou ao genótipo estudado. O vingamento caiu de 1,4% em 1987 para 0,5% em 1989 e aumentou para 1,8% em 1990, sugerindo a recuperação das plantas. A brotação foliar e queda das folhas aumentaram marcadamente como resultado da influência da vassoura de bruxa em 1988 e foram reduzidas pela poda no período de 1989-90. Os fenofases não foram muito afetados pela vassoura de bruxa embora o número de flores e frutos tenham sido.

Nematoides associados a cinco fruteiras no estado do Amapá, Brasil.

The aim of this study was to conduct a survey on nematodes associated with five cultivated fruit trees growing in the Agroforestry System (AFS) of the municipality of Oiapoque, Amapá, Brazil. Rhizosphere samples were collected from three points at the base of murici (Byrsonima sp.), soursop (Annona muricata), cupuaçu (Theobroma grandiflorum), passion fruit (Passiflora sp.) and peach palm (Bactris gasipaes) trees. Four species of phytonematodes were identified, namely Pratylenchus brachyurus, Helicotylenchus dihystera, Mesocriconema xenoplax and Rotylenchulus reniformis. The most prevalent and abundant species was R. reniformis, which was found in the rhizospheres of passion fruit, cupuaçu, soursop, and peach palm. The first record in Brazil of the nematode P. brachyurus, found in the roots of murici is reported here, and all of the nematode species identified here are the first records for fruit trees in the state of Amapá.

Avaliação de caracteres agronômicos em progênies de cupuaçuzeiro, resistentes à vassoura-de-bruxa, no município de Tomé-Açu.

O objetivo do trabalho foi analisar o desempenho de 25 progênies de cupuaçuzeiro quanto ao desenvolvimento vegetativo, nos três primeiros anos, produção de frutos e incidência de vassoura-de-bruxa durante cinco safras. O experimento foi implantado em Sistema Agroflorestal (SAF), juntamente com pimenta-do-reino (2,5 x 2,5 m) e taperebá, (30 x 20 m). O cupuaçuzeiro teve delineamento experimental de blocos casualizados, com 25 tratamentos, 5 repetições e 3 plantas por parcela. Os resultados da análise estatística revelaram que, quanto à variável altura, a progênie 140 teve maior destaque, com média de 2,56 m, não diferindo, entretanto, de outras 15 progênies. Não houve diferença estatística entre as progênies quanto ao diâmetro do caule. Quanto à produção de frutos, as progênies 139, 140 160 e 167 foram as mais produtivas, com destaque para a 167, com média de 15,37 frutos/planta/safra. Em contrapartida, as progênies 122, 128, 133, 147, 149 e 165 não tiveram boa performance produtiva nas cinco safras iniciais. Há nessa população, portanto, variabilidade suficiente para permitir a seleção de materiais promissores para o programa de melhoramento genético. Apesar de não ter havido tempo hábil para a seleção das progênies mais resistentes, foi possível identificar aquelas mais sensíveis à Moniliophthora perniciosa

Avaliação do desenvolvimento vegetativo e produção de frutos de híbridos de cupuaçuzeiro em dois ambientes.

Objetivou-se neste trabalho avaliar o desenvolvimento vegetativo, produção de frutos e ocorrência de Moniliophthora perniciosa em 18 progênies de cupuaçuzeiro instaladas em experimentos de campo situados em duas propriedades de pequenos produtores rurais do município de Tomé Açu ? PA. Foi avaliado o desenvolvimento vegetativo (altura e diâmetro) nos três primeiros anos de campo, a produção de frutos/planta em cinco safras e o grau de infestação por vassoura de bruxa. Foi possível notar que o ambiente 1 foi mais favorável para a produção de frutos, bem como, para o desenvolvimento vegetativo das progênies. Também se observou a influência dos efeitos de interação genótipo x ambiente dentro de um mesmo material, quando comparado em ambientes distintos. Os resultados permitiram identificar a progênie 131 como a de melhor desenvolvimento vegetativo. Para a produção de frutos houve maior variabilidade entre os materiais, sendo destaques as progênies 165 e 167, nos ambientes 1 e 2, respectivamente, que apresentaram produções duas vezes maiores que as progênies menos produtivas nos seus respectivos ambientes. Apesar de não ter havido tempo hábil para a seleção das progênies mais resistentes, ainda sim foi possível identificar aquelas mais sensíveis à M. perniciosa.

Produção de biomassa seca de progênies de cupuaçuzeiro submetidas à inundação.

Objetivou-se determinar o efeito do alagamento do solo na produção de massa seca de 16 progênies de cupuaçuzeiro visando, posteriormente, incorporá-las no programa de melhoramento genético da espécie. O experimento foi instalado em casa de vegetação da Embrapa Amazônia Oriental, Belém-PA, no período de março a setembro de 2015. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, arranjados em esquema fatorial 16x2 com quatro repetições e uma planta por unidade amostral. Os tratamentos foram 16 progênies de cupuaçuzeiro e dois regimes hídricos (alagado e controle). Após 45 dias de aplicação do alagamento foi avaliada a produção de biomassa seca das plantas. No geral, o tratamento alagado proporcionou as maiores médias para todas as variáveis analisadas. Para as variáveis biomassa seca foliar (BF) e biomassa seca radicular (BR) as progênies que mais se destacaram foram a 46 e 57, já para a biomassa seca caulinar (BC), biomassa seca parte aérea (BPA) e biomassa seca total (BT) os materiais mais promissores foram 32, 46, 57 e 215. Por outro lado, a progênie 48 não obteve bom comportamento. Diferença significativa na razão biomassa seca radicular por biomassa seca da parte aérea (BR/BPA) foi observada para as progênies 47, 56 e 64. Pela avaliação global, as progênies 46 e 57 foram as mais tolerantes ao alagamento. Os materiais 47, 48 e 56 mostram ser menos favoráveis a esse estresse. O padrão de crescimento das progênies 46 e 57 sugere boa plasticidade fenotípica, o que indica boa potencialidade para seleção.

Avaliação inicial de genótipos de cupuaçuzeiro para porta-enxertos.

Objetivou-se neste trabalho avaliar o desenvolvimento inicial de cinco genótipos, oriundos de sementes de clones do Banco de Germoplasma de Cupuaçuzeiro da Embrapa Amazônia Ocidental, semeados em dois tipos de substratos.