Contamination des solutions d’hyper-alimentation intraveineuses (HAIV) néonatales, effet de l’ascorbylperoxyde au foie

Introduction : Chez les nouveau-nés prématurés, l’hyper-alimentation intraveineuse (HAIV) contribue à leur survie, mais elle est aussi une source importante de molécules oxydantes. L’absence d’une protection adéquate contre la lumière ambiante génère in vitro, via la photo-excitation de la riboflavine, du H2O2, des peroxydes organiques et un dérivé peroxydé de la vitamine C, l’ascorbylperoxyde (AscOOH). Plusieurs données du laboratoire associent l’infusion d’HAIV à des désordres lipidiques dans notre modèle animal. L’hypothèse est donc que l’AscOOH a un pouvoir oxydant et est responsable de certains des effets biologiques observés. Mes objectifs sont les suivants : 1) développer une méthode de dosage de l’AscOOH; 2) démontrer, à l’aide du modèle animal bien établi au laboratoire, des relations entre la concentration tissulaire de cette molécule et des paramètres métaboliques et l’état redox au foie et dans la circulation; et 3) confirmer l’effet physiologique de l’AscOOH dans un modèle cellulaire. Méthode : Différents étalons internes potentiels ont été testés pour le dosage de l’AscOOH par spectrométrie de masse après séparation sur HPLC (LC-MS). Les phases mobiles et conditions chromatographiques ont été optimisées. Pour l’objectif 2, des cobayes de 3 jours de vie (n=11) ont reçu par voie intraveineuse une dose d’AscOOH (entre 0 et 3,3mM). Les animaux ont été sacrifiés au 4e jour de traitement pour le prélèvement de tissus. Les concentrations tissulaires d’AscOOH ont été déterminées au LC-MS. La triglycéridémie et la cholestérolémie ont été mesurées à l’aide d’un kit commercial par spectrophotométrie. Le glutathion oxydé et réduit ont été mesurés par électrophorèse capillaire. Les relations linéaires obtenues sont exprimées par le ratio des carrés (r2), et traitées par ANOVA. Résultats : La validation du dosage de l’AscOOH par LC-MS a été réalisée. Chez les animaux, la concentration urinaire d’AscOOH par créatinine corrèle positivement avec la dose reçue, négativement avec la lipidémie, et négativement avec le redox sanguin et érythrocytaire, indiquant un milieu moins oxydé. Conclusion : La concentration urinaire d’AscOOH peut donc être un reflet de l’oxydation de l’HAIV en clinique. Nos données chez l’animal suggèrent une interaction de l’AscOOH avec le métabolisme hépatique produisant une chute de la concentration plasmatique de cholestérol et de triglycérides. Le modèle cellulaire n’a pas permis d’élucider le mécanisme moléculaire de l’action de l’AscOOH sur le métabolisme.

Caractérisation du produit du gène sty4221, unique à Salmonella enterica sérovar Typhi

Salmonella enterica sérovar Typhi (Typhi) est une bactérie pathogène spécifique à l’homme. Typhi est l’agent étiologique de la fièvre typhoïde chez l’humain, causant plus de 16 millions de nouveaux cas par année et plus de 600 000 morts. Il a été démontré que pour causer une infection systémique, Salmonella doit nécessairement survivre dans les macrophages de l'hôte. Paradoxalement, S. enterica sérovar Typhimurium, très apparenté à Typhi (près de 90 % d’homologie), n’a pas la capacité de se disséminer dans l’organisme humain et peut infecter plusieurs espèces animales. Nous avons antérieurement identifié 36 gènes uniques à Typhi (absents chez Typhimurium) situés sur 15 régions différentes et exprimés sélectivement lors de l’infection de macrophages humains. Ainsi, l’une de ces régions a suscité notre attention, soit la région sty4217-4222 et plus particulièrement le produit du gène sty4221, une aminotransférase hypothétique. Ce dernier gène est d’intérêt dû à l’homologie qu’il détient avec une hémolysine connue (Hly) produite par Treponema denticola, possédant elle-même une activité d’aminotransférase. Chez T. denticola, Hly dégrade la cystéine et produit du H2S qui est toxique pour l’hôte. Notre hypothèse est que la spécificité d’hôte et la capacité de produire une infection systémique de Typhi sont dues à l’expression de gènes qui ne se retrouvent pas chez d’autres salmonelles. Le but de cette étude était donc de caractériser le gène sty4221 quant à son activité hémolytique, cytotoxique et tenter de déterminer son rôle dans la virulence de cette bactérie. Le gène sty4221 a été cloné sous le contrôle d’un promoteur inductible à l’arabinose et exprimé par E. coli. L’activité hémolytique du clone a été déterminée par simple observation sur gélose sang. Ce clone a également permis d’observer l’effet cytotoxique du surnageant de culture sur différentes lignées cellulaires, par quantification de la relâche de LDH. Le gène sty4221 a été muté chez la souche sauvage de Typhi, ISP1820, l’implication pathogénique du gène a ainsi pu être étudiée. Des tests de phagocytose, d’invasion et de survie dans des macrophages humains ont été effectués, ainsi que des tests d’adhésion et d’invasion sur des cellules HeLa. Par ailleurs, une première tentative de purification de la protéine a été entreprise. En somme, nous savons maintenant que STY4221 a des propriétés hémolytiques, augmentées par la présence de cystéine. De plus, STY4221 a un effet cytotoxique sur les macrophages THP-I, mais aucun effet sur les HeLa. Or, sty4221 ne semble pas impliqué dans les étapes d’adhésion, d’invasion, de phagocytose ou de survie. La caractérisation de sty4221 permettra sans doute d’approfondir nos connaissances sur les toxines trouvées uniquement chez Typhi.

Caractérisation de la voie de signalisation AMPK/ACC dans le foie et l’intestin du Psammomys obesus, un modèle animal de résistance à l’insuline et de diabète de type 2

L’expansion des maladies métaboliques dans les sociétés modernes exige plus d’activités de recherche afin d’augmenter notre compréhension des mécanismes et l’identification de nouvelles cibles d’interventions cliniques. L’obésité, la résistance à l’insuline (RI) et la dyslipidémie, en particulier sont tous des facteurs de risque associés à la pathogenèse du diabète de type 2 (DT2) et des maladies cardiovasculaires. Ainsi, la dyslipidémie postprandiale, notamment la surproduction des lipoprotéines hépatiques et intestinales, contribue d’une façon significative à l’hypertriglycéridémie. Quoique plusieurs études cliniques et fondamentales chez l’homme et les modèles animaux aient mis en évidence les rôles importants joués par le foie et l’intestin dans la dyslipidémie, les mécanismes moléculaires en cause ne sont pas bien élucidés. L’une des voies principales régulant le métabolisme lipidique est la voie de la protéine kinase AMPK. L’épuisement de l’ATP intracellulaire entraîne une activation de l’AMPK qui va œuvrer pour rétablir l’équilibre énergétique en stimulant des voies génératrices d’ATP et en inhibant des voies anaboliques consommatrices d’ATP. Les effets positifs de l’activation de l’AMPK comprennent l’augmentation de la sensibilité à l’insuline dans les tissus périphériques, la réduction de l’hyperglycémie et la réduction de la lipogenèse, d’où son importance dans les interventions cliniques pour la correction des dérangements métaboliques. Il est à souligner que le rôle de l’AMPK dans le foie et l’intestin semble plus complexe et mal compris. Ainsi, la voie de signalisation de l’AMPK n’est pas bien élucidée dans les situations pathologiques telles que le DT2, la RI et l’obésité. Dans le présent projet, notre objectif consiste à caractériser le rôle de cette voie de signalisation dans la lipogenèse hépatique et dans le métabolisme des lipides dans l’intestin chez le Psammomys obesus, un modèle animal d’obésité, de RI et de DT2. À cette fin, 3 groupes d’animaux sont étudiés (i.e. contrôle, RI et DT2). En caractérisant la voie de signalisation de l’AMPK/ACC dans le foie, nous avons constaté une augmentation de l’expression génique des enzymes clés de la lipogenèse (ACC, FAS, SCD-1 et mGPAT) et des facteurs de transcription (ChREBP, SREBP-1) qui modulent leur niveau d’expression. Nos analyses détaillées ont révélé, par la suite, une nette augmentation de l’expression de l’isoforme cytosolique de l’ACC, ACC1 (impliqué dans la lipogenèse de novo) concomitante avec une invariabilité de l’expression de l’isoforme mitochondrial ACC2 (impliqué dans la régulation négative de la β-oxydation). En dépit d’un état adaptatif caractérisé par une expression protéique et une phosphorylation (activation) élevées de l’AMPKα, l’activité de la kinase qui phosphoryle et inhibe l’ACC reste très élevée chez les animaux RI et DT2. Au niveau de l’intestin grêle des animaux RI et DT2, nous avons démontré que l’augmentation de la lipogenèse intestinale est principalement associée avec une diminution de la voie de signalisation de l’AMPK (i.e. expression protéique et phosphorylation/activation réduites des deux isoformes AMPKα1 et AMPKα2). La principale conséquence de la diminution de l’activité AMPK est la réduction de la phosphorylation de l’ACC. Étant donné que le niveau d’expression totale d’ACC reste inchangé, nos résultats suggèrent donc une augmentation de l’activité des deux isoformes ACC1 et ACC2. En parallèle, nous avons observé une réduction de l’expression protéique et génique de la CPT1 [enzyme clé de la β-oxydation des acides gras (AG)]. L’ensemble de ces résultats suggère une inhibition de l’oxydation des AG concomitante avec une stimulation de la lipogenèse de novo. Enfin, nous avons démontré que l’intestin grêle est un organe sensible à l’action de l’insuline et que le développement de la résistance à l’insuline pourrait altérer les deux voies de signalisation (i.e. Akt/GSK3 et p38MAPK) essentielles dans plusieurs processus métaboliques. En conclusion, nos résultats indiquent que l’augmentation de la lipogenèse qui contribue pour une grande partie à la dyslipidémie dans la résistance à l’insuline et le diabète serait due, en partie, à des défauts de signalisation par l’AMPK. Nos observations illustrent donc le rôle crucial du système AMPK au niveau hépatique et intestinal, ce qui valide l’approche thérapeutique consistant à activer l’AMPK pour traiter les maladies métaboliques.

Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.

Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN.

Caractérisation de la SERPINA1, une antiprotéase différentiellement exprimée dans le cancer épithélial de l’ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire.

Caractérisation électro-clinique des convulsions fébriles et risque d’épilepsie

Environ 2-3% d’enfants avec convulsions fébriles (CF) développent une épilepsie, mais les outils cliniques existants ne permettent pas d’identifier les enfants susceptibles de développer une épilepsie post-convulsion fébrile. Des études ont mis en évidence des anomalies d’EEG quantifiée, et plus particulièrement en réponse à la stimulation lumineuse intermittente (SLI), chez des patients épileptiques. Aucune étude n’a analysé ces paramètres chez l’enfant avec CF et il importe de déterminer s’ils sont utiles pour évaluer le pronostic des CF. Les objectifs de ce programme de recherche étaient d’identifier, d’une part, des facteurs de risque cliniques qui déterminent le développement de l’épilepsie après des CF et, d’autre part, des marqueurs électrophysiologiques quantitatifs qui différencieraient les enfants avec CF des témoins et pourraient aider à évaluer leur pronostic. Afin de répondre à notre premier objectif, nous avons analysé les dossiers de 482 enfants avec CF, âgés de 3 mois à 6 ans. En utilisant des statistiques de survie, nous avons décrit les facteurs de risque pour développer une épilepsie partielle (antécédents prénataux, retard de développement, CF prolongées et focales) et généralisée (antécédents familiaux d’épilepsie, CF récurrentes et après l’âge de 4 ans). De plus, nous avons identifié trois phénotypes cliniques distincts ayant un pronostic différent : (i) CF simples avec des antécédents familiaux de CF et sans risque d’épilepsie ultérieure; (ii) CF récurrentes avec des antécédents familiaux d’épilepsie et un risque d’épilepsie généralisée; (iii) CF focales avec des antécédents familiaux d’épilepsie et un risque d’épilepsie partielle. Afin de répondre à notre deuxième objectif, nous avons d’abord analysé les potentiels visuels steady-state (PEVSS) évoqués par la SLI (5, 7,5, 10 et 12,5 Hz) en fonction de l’âge. Le tracé EEG de haute densité (128 canaux) a été enregistré chez 61 enfants âgés entre 6 mois et 16 ans et 8 adultes normaux. Nous rapportons un développement topographique différent de l’alignement de phase des composantes des PEVSS de basses (5-15 Hz) et de hautes (30-50 Hz) fréquences. Ainsi, l’alignement de phase des composantes de basses fréquences augmente en fonction de l’âge seulement au niveau des régions occipitale et frontale. Par contre, les composantes de hautes fréquences augmentent au niveau de toutes les régions cérébrales. Puis, en utilisant cette même méthodologie, nous avons investigué si les enfants avec CF présentent des anomalies des composantes gamma (50-100 Hz) des PEVSS auprès de 12 cas de CF, 5 frères et sœurs des enfants avec CF et 15 témoins entre 6 mois et 3 ans. Nous montrons une augmentation de la magnitude et de l’alignement de phase des composantes gamma des PEVSS chez les enfants avec CF comparés au groupe témoin et à la fratrie. Ces travaux ont permis d’identifier des phénotypes électro-cliniques d’intérêt qui différencient les enfants avec CF des enfants témoins et de leur fratrie. L’étape suivante sera de vérifier s’il y a une association entre les anomalies retrouvées, la présentation clinique et le pronostic des CF. Cela pourrait éventuellement aider à identifier les enfants à haut risque de développer une épilepsie et permettre l’institution d’un traitement neuroprotecteur précoce.

Cloning and Characterisation of the human gene gremlin promoter

L’ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire invalidante caractérisée par la perte de l’intégrité du cartilage articulaire. Les recherches tentent de comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie afin de trouver des inhibiteurs efficaces pouvant prévenir la dégradation du cartilage articulaire. Les BMPs (bone morphogenic proteins) jouent un rôle dans le processus pathophysiologique de cette maladie. Cette étude cible le rôle d’un antagoniste des BMPs, le gremlin. Nous avons étudié la régulation de l’expression de gremlin par le clonage et la caractérisation de son promoteur et en déterminant si gremlin pouvait jouer un rôle autre qu’antagoniste des BMP, en affectant l’expression d’autres gènes par l’activation d’une cascade de signalisation dans la cellule. Les résultats ont identifié une région importante dans le promoteur de gremlin qui affecte son activité basale et induite, et ont montré que le gremlin ne pouvait pas affecter l’expression génique et l’activation de signalisation intracellulaire indépendamment des BMPs. Cette étude démontre que le rôle de gremlin dans l’OA en est un essentiellement d’antagoniste des BMPs.

Les R-loops et leurs conséquences sur l'expression génique chez Escherichia coli.

Des variations importantes du surenroulement de l’ADN peuvent être générées durant la phase d’élongation de la transcription selon le modèle du « twin supercoiled domain ». Selon ce modèle, le déplacement du complexe de transcription génère du surenroulement positif à l’avant, et du surenroulement négatif à l’arrière de l’ARN polymérase. Le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli est de prévenir l’accumulation de ce surenroulement négatif générée durant la transcription. En absence de topoisomérase I, l’accumulation de ce surenroulement négatif favorise la formation de R-loops qui ont pour conséquence d’inhiber la croissance bactérienne. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui se forment entre l’ARN nouvellement synthétisé et le simple brin d’ADN complémentaire. Dans les cellules déficientes en topoisomérase I, des mutations compensatoires s’accumulent dans les gènes qui codent pour la gyrase, réduisant le niveau de surenroulement négatif du chromosome et favorisant la croissance. Une des ces mutations est une gyrase thermosensible qui s’exprime à 37 °C. La RNase HI, une enzyme qui dégrade la partie ARN d’un R-loop, peut aussi restaurer la croissance en absence de topoisomérase I lorsqu’elle est produite en très grande quantité par rapport à sa concentration physiologique. En présence de topoisomérase I, des R-loops peuvent aussi se former lorsque la RNase HI est inactive. Dans ces souches mutantes, les R-loops induisent la réponse SOS et la réplication constitutive de l’ADN (cSDR). Dans notre étude, nous montrons comment les R-loops formés en absence de topoisomérase I ou RNase HI peuvent affecter négativement la croissance des cellules. Lorsque la topoisomérase I est inactivée, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif conduit à la formation de nombreux R-loops, ce qui déclenche la dégradation de l’ARN synthétisé. Issus de la dégradation de l’ARNm de pleine longueur, des ARNm incomplets et traductibles s’accumulent et causent l’inhibition de la synthèse protéique et de la croissance. Le processus par lequel l’ARN est dégradé n’est pas encore complètement élucidé, mais nos résultats soutiennent fortement que la RNase HI présente en concentration physiologique est responsable de ce phénotype. Chose importante, la RNase E qui est l’endoribonuclease majeure de la cellule n’est pas impliquée dans ce processus, et la dégradation de l’ARN survient avant son action. Nous montrons aussi qu’une corrélation parfaite existe entre la concentration de RNase HI, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif et l’inhibition de la croissance bactérienne. Lorsque la RNase HI est en excès, l’accumulation de surenroulement négatif est inhibée et la croissance n’est pas affectée. L’inverse se produit Lorsque la RNase HI est en concentration physiologique. En limitant l’accumulation d’hypersurenroulement négatif, la surproduction de la RNase HI prévient alors la dégradation de l’ARN et permet la croissance. Quand la RNase HI est inactivée en présence de topoisomérase I, les R-loops réduisent le niveau d’expression de nombreux gènes, incluant des gènes de résistance aux stress comme rpoH et grpE. Cette inhibition de l’expression génique n’est pas accompagnée de la dégradation de l’ARN contrairement à ce qui se produit en absence de topoisomérase I. Dans le mutant déficient en RNase HI, la diminution de l’expression génique réduit la concentration cellulaire de différentes protéines, ce qui altère négativement le taux de croissance et affecte dramatiquement la survie des cellules exposées aux stress de hautes températures et oxydatifs. Une inactivation de RecA, le facteur essentiel qui déclenche la réponse SOS et le cSDR, ne restaure pas l’expression génique. Ceci démontre que la réponse SOS et le cSDR ne sont pas impliqués dans l’inhibition de l’expression génique en absence de RNase HI. La croissance bactérienne qui est inhibée en absence de topoisomérase I, reprend lorsque l’excès de surenroulement négatif est éliminé. En absence de RNase HI et de topoisomérase I, le surenroulement négatif est très relaxé. Il semble que la réponse cellulaire suite à la formation de R-loops, soit la relaxation du surenroulement négatif. Selon le même principe, des mutations compensatoires dans la gyrase apparaissent en absence de topoisomérase I et réduisent l’accumulation de surenroulement négatif. Ceci supporte fortement l’idée que le surenroulement négatif joue un rôle primordial dans la formation de R-loop. La régulation du surenroulement négatif de l’ADN est donc une tâche essentielle pour la cellule. Elle favorise notamment l’expression génique optimale durant la croissance et l’exposition aux stress, en limitant la formation de R-loops. La topoisomérase I et la RNase HI jouent un rôle important et complémentaire dans ce processus.

Brain tumor and brain endothelial cells' response to ionizing radiation and phytochemical treatments

Le glioblastome multiforme (GBM) représente la tumeur cérébrale primaire la plus agressive et la plus vascularisée chez l’adulte. La survie médiane après le diagnostic est de moins d’un an en l’absence de traitement. Malheureusement, 90% des patients traités avec de la radiothérapie après la résection chirurgicale d’un GBM développent une récidive tumorale. Récemment, le traitement des GBM avec radiothérapie et témozolomide, un agent reconnu pour ses propriétés antiangiogéniques, a permis de prolonger la survie médiane à 14,6 mois. Des efforts sont déployés pour identifier des substances naturelles capables d’inhiber, de retarder ou de renverser le processus de carcinogenèse. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), un polyphénol retrouvé dans le thé vert, est reconnu pour ses propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques. L’EGCG pourrait sensibiliser les cellules tumorales cérébrales et les cellules endothéliales dérivées des tumeurs aux traitements conventionnels. Le chapitre II décrit la première partie de ce projet de doctorat. Nous avons tenté de déterminer si l’EGCG pourrait sensibiliser la réponse des GBM à l’irradiation (IR) et si des marqueurs moléculaires spécifiques sont impliqués. Nous avons documenté que les cellules U-87 étaient relativement radiorésistantes et que Survivin, une protéine inhibitrice de l’apoptose, pourrait être impliquée dans la radiorésistance des GBM. Aussi, nous avons démontré que le pré-traitement des cellules U-87 avec de l’EGCG pourrait annuler l’effet cytoprotecteur d’une surexpression de Survivin et potentialiser l’effet cytoréducteur de l’IR. Au chapitre III, nous avons caractérisé l’impact de l’IR sur la survie de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (HBMEC) et nous avons déterminé si l’EGCG pouvait optimiser cet effet. Bien que les traitements individuels avec l’EGCG et l’IR diminuaient la survie des HBMEC, le traitement combiné diminuait de façon synergique la survie cellulaire. Nous avons documenté que le traitement combiné augmentait la mort cellulaire, plus spécifiquement la nécrose. Au chapitre IV, nous avons investigué l’impact de l’IR sur les fonctions angiogéniques des HBMEC résistantes à l’IR, notamment la prolifération cellulaire, la migration cellulaire en présence de facteurs de croissance dérivés des tumeurs cérébrales, et la capacité de tubulogenèse. La voie de signalisation des Rho a aussi été étudiée en relation avec les propriétés angiogéniques des HBMEC radiorésistantes. Nos données suggèrent que l’IR altère significativement les propriétés angiogéniques des HBMEC. La réponse aux facteurs importants pour la croissance tumorale et l’angiogenèse ainsi que la tubulogenèse sont atténuées dans ces cellules. En conclusion, ce projet de doctorat confirme les propriétés cytoréductrices de l’IR sur les gliomes malins et propose un nouveau mécanisme pour expliquer la radiorésistance des GBM. Ce projet documente pour la première fois l’effet cytotoxique de l’IR sur les HBMEC. Aussi, ce projet reconnaît l’existence de HBMEC radiorésistantes et caractérise leurs fonctions angiogéniques altérées. La combinaison de molécules naturelles anticancéreuses et antiangiogéniques telles que l’EGCG avec de la radiothérapie pourrait améliorer l’effet de l’IR sur les cellules tumorales et sur les cellules endothéliales associées, possiblement en augmentant la mort cellulaire. Cette thèse supporte l’intégration de nutriments avec propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques dans le traitement des gliomes malins pour sensibiliser les cellules tumorales et endothéliales aux traitements conventionnels.

New statistical methods to assess the effect of time-dependent exposures in case-control studies

Contexte. Les études cas-témoins sont très fréquemment utilisées par les épidémiologistes pour évaluer l’impact de certaines expositions sur une maladie particulière. Ces expositions peuvent être représentées par plusieurs variables dépendant du temps, et de nouvelles méthodes sont nécessaires pour estimer de manière précise leurs effets. En effet, la régression logistique qui est la méthode conventionnelle pour analyser les données cas-témoins ne tient pas directement compte des changements de valeurs des covariables au cours du temps. Par opposition, les méthodes d’analyse des données de survie telles que le modèle de Cox à risques instantanés proportionnels peuvent directement incorporer des covariables dépendant du temps représentant les histoires individuelles d’exposition. Cependant, cela nécessite de manipuler les ensembles de sujets à risque avec précaution à cause du sur-échantillonnage des cas, en comparaison avec les témoins, dans les études cas-témoins. Comme montré dans une étude de simulation précédente, la définition optimale des ensembles de sujets à risque pour l’analyse des données cas-témoins reste encore à être élucidée, et à être étudiée dans le cas des variables dépendant du temps. Objectif: L’objectif général est de proposer et d’étudier de nouvelles versions du modèle de Cox pour estimer l’impact d’expositions variant dans le temps dans les études cas-témoins, et de les appliquer à des données réelles cas-témoins sur le cancer du poumon et le tabac. Méthodes. J’ai identifié de nouvelles définitions d’ensemble de sujets à risque, potentiellement optimales (le Weighted Cox model and le Simple weighted Cox model), dans lesquelles différentes pondérations ont été affectées aux cas et aux témoins, afin de refléter les proportions de cas et de non cas dans la population source. Les propriétés des estimateurs des effets d’exposition ont été étudiées par simulation. Différents aspects d’exposition ont été générés (intensité, durée, valeur cumulée d’exposition). Les données cas-témoins générées ont été ensuite analysées avec différentes versions du modèle de Cox, incluant les définitions anciennes et nouvelles des ensembles de sujets à risque, ainsi qu’avec la régression logistique conventionnelle, à des fins de comparaison. Les différents modèles de régression ont ensuite été appliqués sur des données réelles cas-témoins sur le cancer du poumon. Les estimations des effets de différentes variables de tabac, obtenues avec les différentes méthodes, ont été comparées entre elles, et comparées aux résultats des simulations. Résultats. Les résultats des simulations montrent que les estimations des nouveaux modèles de Cox pondérés proposés, surtout celles du Weighted Cox model, sont bien moins biaisées que les estimations des modèles de Cox existants qui incluent ou excluent simplement les futurs cas de chaque ensemble de sujets à risque. De plus, les estimations du Weighted Cox model étaient légèrement, mais systématiquement, moins biaisées que celles de la régression logistique. L’application aux données réelles montre de plus grandes différences entre les estimations de la régression logistique et des modèles de Cox pondérés, pour quelques variables de tabac dépendant du temps. Conclusions. Les résultats suggèrent que le nouveau modèle de Cox pondéré propose pourrait être une alternative intéressante au modèle de régression logistique, pour estimer les effets d’expositions dépendant du temps dans les études cas-témoins

Plasticité intermodale chez le hamster énucléé à la naissance : Études de la distribution des interneurones CaBPir dans les cortex visuel et auditif primaires.

La période postnatale et l’expérience sensorielle sont critiques pour le développement du système visuel. Les interneurones inhibiteurs exprimant l’acide γ-aminobutyrique (GABA) jouent un rôle important dans le contrôle de l’activité neuronale, le raffinement et le traitement de l’information sensorielle qui parvient au cortex cérébral. Durant le développement, lorsque le cortex cérébral est très susceptible aux influences extrinsèques, le GABA agit dans la formation des périodes critiques de sensibilité ainsi que dans la plasticité dépendante de l’expérience. Ainsi, ce système inhibiteur servirait à ajuster le fonctionnement des aires sensorielles primaires selon les conditions spécifiques d’activité en provenance du milieu, des afférences corticales (thalamiques et autres) et de l’expérience sensorielle. Certaines études montrent que des différences dans la densité et la distribution de ces neurones inhibiteurs corticaux reflètent les caractéristiques fonctionnelles distinctes entre les différentes aires corticales. La Parvalbumine (PV), la Calretinine (CR) et la Calbindine (CB) sont des protéines chélatrices du calcium (calcium binding proteins ou CaBPs) localisées dans différentes sous-populations d’interneurones GABAergiques corticaux. Ces protéines tamponnent le calcium intracellulaire de sorte qu’elles peuvent moduler différemment plusieurs fonctions neuronales, notamment l’aspect temporel des potentiels d’action, la transmission synaptique et la potentialisation à long terme. Plusieurs études récentes montrent que les interneurones immunoréactifs (ir) aux CaBPs sont également très sensibles à l’expérience et à l’activité sensorielle durant le développement et chez l’adulte. Ainsi, ces neurones pourraient avoir un rôle crucial à jouer dans le phénomène de compensation ou de plasticité intermodale entre les cortex sensoriels primaires. Chez le hamster (Mesocricetus auratus), l’énucléation à la naissance fait en sorte que le cortex visuel primaire peut être recruté par les autres modalités sensorielles, telles que le toucher et l’audition. Suite à cette privation oculaire, il y a établissement de projections ectopiques permanentes entre les collicules inférieurs (CI) et le corps genouillé latéral (CGL). Ceci a pour effet d’acheminer l’information auditive vers le cortex visuel primaire (V1) durant le développement postnatal. À l’aide de ce modèle, l’objectif général de ce projet de thèse est d’étudier l’influence et le rôle de l’activité sensorielle sur la distribution et l’organisation des interneurones corticaux immunoréactifs aux CaBPs dans les aires sensorielles visuelle et auditive primaires du hamster adulte. Les changements dans l’expression des CaBPs ont été déterminés d’une manière quantitative en évaluant les profils de distribution laminaire de ces neurones révélés par immunohistochimie. Dans une première expérience, nous avons étudié la distribution laminaire des CaBPs dans les aires visuelle (V1) et auditive (A1) primaires chez le hamster normal adulte. Les neurones immunoréactifs à la PV et la CB, mais non à la CR, sont distribués différemment dans ces deux cortex primaires dédiés à une modalité sensorielle différente. Dans une deuxième étude, une comparaison a été effectuée entre des animaux contrôles et des hamsters énucléés à la naissance. Cette étude montre que le cortex visuel primaire de ces animaux adopte une chimioarchitecture en PV similaire à celle du cortex auditif. Nos recherches montrent donc qu’une suppression de l’activité visuelle à la naissance peut influencer l’expression des CaBPs dans l’aire V1 du hamster adulte. Ceci suggère également que le type d’activité des afférences en provenance d’autres modalités sensorielles peut moduler, en partie, une circuiterie corticale en CaBPs qui lui est propre dans le cortex hôte ou recruté. Ainsi, nos travaux appuient l’hypothèse selon laquelle il serait possible que certaines de ces sous-populations d’interneurones GABAergiques jouent un rôle crucial dans le phénomène de la plasticité intermodale.

Impact d’une mutation ponctuelle stratégique de la protéine HOXB4 sur son pouvoir de régulation, de prolifération et de différenciation des CSH et des progéniteurs murins

L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique.

Lien entre l'hémostase et le développement néoplasique : rôle spécifique du facteur tissulaire et de l'inhibiteur du facteur tissulaire

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.

Étude du rôle de l’auto-antigène nucléaire centromérique B (CENP-B) et des auto-anticorps anti-CENP-B dans l’activation des cellules musculaires lisses vasculaires : implication potentielle dans la pathophysiologie de la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.

Dissection du programme développemental du noyau paraventriculaire de l'hypothalamus.

Une cascade de facteurs de transcription composée de SIM1, ARNT2, OTP, BRN2 et SIM2 est requise pour la différenciation des cinq types cellulaires qui peuplent le noyau paraventriculaire (PVN) de l’hypothalamus, un régulateur critique de plusieurs processus physiologiques essentiels à la survie. De plus, l’haploinsuffisance de Sim1 est aussi une cause d’hyperphagie isolée chez la souris et chez l’homme. Nous désirons disséquer le programme développemental du PVN, via une approche intégrative, afin d’identifier de nouveaux gènes qui ont le potentiel de réguler l’homéostasie chez l’individu adulte. Premièrement, nous avons utilisé une approche incluant l’analyse du transcriptome du PVN à différents stades du développement de la souris pour identifier de tels gènes. Nous avons comparé les transcriptomes de l’hypothalamus antérieur chez des embryons de souris Sim1+/+ et Sim1-/- à E12.5 issus de la même portée. De cette manière, nous avons identifié 56 gènes agissant en aval de Sim1 dont 5 facteurs de transcription - Irx3, Sax1, Rxrg, Ror et Neurod6. Nous avons également proposé un modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur. Selon ce modèle, les gènes qui occupent un domaine médial dans la zone du manteau caractérisent des cellules qui peupleront le PVN alors que les gènes qui ont une expression latérale identifient des cellules qui donneront plus tard naissance aux structures ventrolatérales de l’hypothalamus. Nous avons aussi démontré que Sim1 est impliqué à la fois dans la différenciation, la migration et la prolifération des neurones qui peuplent le PVN tout comme Otp. Nous avons également isolé par microdissection au laser le PVN et l’hypothalamus médiobasal chez des souris de type sauvage à E14.5 pour en comparer les transcriptomes. Ceci nous a permis d’identifier 34 facteurs de transcription spécifiques au PVN et 76 facteurs spécifiques à l’hypothalamus médiobasal. Ces gènes représentent des régulateurs potentiels du développement hypothalamique. Deuxièmement, nous avons identifié 3 blocs de séquences au sein de la région 5’ d’Otp qui sont conservés chez l’homme, la souris et le poisson. Nous avons construit un transgène qui est composé d’un fragment de 7 kb contenant ces blocs de séquences et d’un gène rapporteur. L’analyse de 4 lignées de souris a montré que ce transgène est uniquement exprimé dans le PVN en développement. Nous avons généré un deuxième transgène dans lequel le fragment de 7 kb est inséré en amont de l’ADNc de Brn2 ou Sim1 et de Gfp. Nous avons obtenu quatre lignées de souris dans lesquels le profil d’expression de Brn2 et de Gfp reproduit celui d’Otp. Nous étudierons le développement du PVN et la prise alimentaire chez ces souris. En parallèle, nous croisons ces lignées avec les souris déficientes en Sim1 pour déterminer si l’expression de Brn2 permet le développement des cellules du PVN en absence de Sim1. En résumé, nous avons généré le premier transgène qui est exprimé spécifiquement dans le PVN. Ce transgène constitue un outil critique pour la dissection du programme développemental de l’hypothalamus. Troisièmement, nous avons caractérisé le développement de l’hypothalamus antérieur chez l’embryon de poulet qui représente un modèle intéressant pour réaliser des études de perte et de gain de fonction au cours du développement de cette structure. Il faut souligner que le modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur semble être conservé chez l’embryon de poulet où il est aussi possible de classer les gènes selon leur profil d’expression médio-latéral et le devenir des régions qu’ils définissent. Finalement, nous croyons que cette approche intégrative nous permettra d’identifier et de caractériser des régulateurs du développement du PVN qui pourront potentiellement être associés à des pathologies chez l’adulte telles que l’obésité ou l’hypertension.