Emerging, non-PCV13 serotypes 11A and 35B of Streptococcus pneumoniae show high potential for biofilm formation in vitro

Background: Since the use of pneumococcal conjugate vaccines PCV7 and PCV13 in children became widespread, invasive pneumococcal disease (IPD) has dramatically decreased. Nevertheless, there has been a rise in incidence of Streptococcus pneumoniae non-vaccine serotypes (NVT) colonising the human nasopharynx. Nasopharyngeal colonisation, an essential step in the development of S. pneumoniae-induced IPD, is associated with biofilm formation. Although the capsule is the main pneumococcal virulence factor, the formation of pneumococcal biofilms might, in fact, be limited by the presence of capsular polysaccharide (CPS). Methodology/Principal Findings: We used clinical isolates of 16 emerging, non-PCV13 serotypes as well as isogenic transformants of the same serotypes. The biofilm formation capacity of isogenic transformants expressing CPSs from NVT was evaluated in vitro to ascertain whether this trait can be used to predict the emergence of NVT. Fourteen out of 16 NVT analysed were not good biofilm formers, presumably because of the presence of CPS. In contrast, serotypes 11A and 35B formed >45% of the biofilm produced by the non-encapsulated M11 strain. Conclusions/Significance This study suggest that emerging, NVT serotypes 11A and 35B deserve a close surveillance.

Streptococcus suis infection and malignancy in man, Spain

Streptococcus suis is an emerging zoonotic agent. Human infection is associated with occupational exposure to swine. Affected persons are usually, but not always, healthy (1,2). Immunosuppressive conditions can predispose persons to S. suis infection, and cancer has classically been associated as a risk factor for S. suis infection (1,2). Nevertheless, the actual number of reported cases is low (27). We describe a severe case of S. suis infection in a man who had not been exposed to swine but for whom disseminated cancer was diagnosed 5 months after the infection.

Streptococcus suis infection and malignancy in man, Spain

Streptococcus suis is an emerging zoonotic agent. Human infection is associated with occupational exposure to swine. Affected persons are usually, but not always, healthy (1,2). Immunosuppressive conditions can predispose persons to S. suis infection, and cancer has classically been associated as a risk factor for S. suis infection (1,2). Nevertheless, the actual number of reported cases is low (27). We describe a severe case of S. suis infection in a man who had not been exposed to swine but for whom disseminated cancer was diagnosed 5 months after the infection.

Identification and characterisation of a novel adhesin of Streptococcus suis and its use as a target of adhesion inhibition and bacterial detection

Streptococcus suis is an important pig pathogen but it is also zoonotic, i.e. capable of causing diseases in humans. Human S. suis infections are quite uncommon but potentially life-threatening and the pathogen is an emerging public health concern. This Gram-positive bacterium possesses a galabiose-specific (Galalpha1−4Gal) adhesion activity, which has been studied for over 20 years. P-fimbriated Escherichia coli−bacteria also possess a similar adhesin activity targeting the same disaccharide. The galabiose-specific adhesin of S. suis was identified by an affinity proteomics method. No function of the protein identified was formerly known and it was designated streptococcal adhesin P (SadP). The peptide sequence of SadP contains an LPXTG-motif and the protein was proven to be cell wall−anchored. SadP may be multimeric since in SDS-PAGE gel it formed a protein ladder starting from about 200 kDa. The identification was confirmed by producing knockout strains lacking functional adhesin, which had lost their ability to bind to galabiose. The adhesin gene was cloned in a bacterial expression host and properties of the recombinant adhesin were studied. The galabiose-binding properties of the recombinant protein were found to be consistent with previous results obtained studying whole bacterial cells. A live-bacteria application of surface plasmon resonance was set up, and various carbohydrate inhibitors of the galabiose-specific adhesins were studied with this assay. The potencies of the inhibitors were highly dependent on multivalency. Compared with P-fimbriated E. coli, lower concentrations of galabiose derivatives were needed to inhibit the adhesion of S. suis. Multivalent inhibitors of S. suis adhesion were found to be effective at low nanomolar concentrations. To specifically detect galabiose adhesin−expressing S. suis bacteria, a technique utilising magnetic glycoparticles and an ATP bioluminescence bacterial detection system was also developed. The identification and characterisation of the SadP adhesin give valuable information on the adhesion mechanisms of S. suis, and the results of this study may be helpful for the development of novel inhibitors and specific detection methods of this pathogen.

Streptococcus agalactiae em gestantes: prevalência de colonização e avaliação da suscetibilidade aos antimicrobianos

OBJETIVOS: verificar a ocorrência de colonização por Streptococcus agalactiae em gestantes e avaliar a suscetibilidade das amostras isoladas aos antimicrobianos. MÉTODOS: foram avaliadas 167 grávidas entre a 32ª e a 41ª semana de gestação, independente da presença ou não de fatores de risco, atendidas no ambulatório de pré-natal entre fevereiro de 2003 e fevereiro de 2004. O material vaginal/anal, colhido com um único swab, foi inoculado em caldo Todd-Hewitt acrescido de ácido nalidíxico (15 µg/mL) e gentamicina (8 µg/mL), com posterior subcultura no meio de ágar sangue. A identificação foi feita por meio da avaliação da morfologia e tipo de hemólise das colônias no meio de ágar sangue, teste da catalase, teste de cAMP e testes sorológicos. A avaliação da suscetibilidade aos antimicrobianos foi realizada pelos testes de difusão e de diluição em ágar. A análise estatística foi realizada por meio do teste de chi2; valores de p<0,05 foram considerados significativos. RESULTADOS: a freqüência de colonização foi de 19,2%, sem diferenças significativas com relação à idade, número de gestações, ocorrência de abortos e presença ou ausência de diabete melito (p>0,05). Todas as 32 amostras isoladas foram sensíveis a penicilina, cefotaxima, ofloxacina, cloranfenicol, vancomicina e meropenem. A resistência a eritromicina e clindamicina foi detectada em 9,4 e 6,2% das amostras, respectivamente. CONCLUSÕES: a incidência relativamente elevada (19,2%) de colonização por S. agalactiae entre as gestantes avaliadas e o isolamento de amostras resistentes, especialmente aos antimicrobianos recomendados nos casos de alergia à penicilina, enfatizam a importância de detectar esta colonização no final da gravidez, associada à avaliação da suscetibilidade aos antimicrobianos, para uma prevenção eficaz da infecção neonatal.

Prevalência de colonização por Streptococcus agalactiae em gestantes atendidas em maternidade do Ceará, no Brasil, correlacionando com os resultados perinatais

OBJETIVO: Analisar a prevalência de Streptococcus agalactiae, um estreptococo do Grupo B, em gestantes e seus possíveis fatores de risco, bem como o impacto perinatal e a suscetibilidade antimicrobiana das colonizadas. MÉTODOS: Foram avaliadas 213 gestantes a partir de 20 semanas de gestação, independente dos fatores de risco, atendidas em um hospital-escola terciário da zona Norte do Estado de Ceará, no Brasil. O cálculo do tamanho amostral ocorreu por conveniência. Foi utilizada técnica do swab estéril único para coleta de secreção das regiões vaginal e perianal. As amostras recém-obtidas eram armazenadas em meio de transporte Stuart e, no laboratório, inoculadas em meio seletivo Todd-Hewitt adicionado de gentamicina (8 ug/mL) e ácido nalidíxico (15 ug/mL), com posterior subcultivo em placas em ágar-sangue. Nos materiais eram realizados teste de Gram, catalase com peróxido de oxigênio e CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen), sendo confirmados sorologicamente com Streptococcal Grouping Kit, Oxoid®. As positivas foram submetidas a testes de suscetibilidade antimicrobiana. Foram também avaliadas variáveis socioeconômicas, reprodutivas, clínico-obstétricas e neonatais. Os dados foram analisados utilizando o programa Epi-Info 6.04. RESULTADOS: A prevalência de colonização encontrada foi de 9,8% pelo teste de CAMP, embora apenas 4,2% pelo sorológico. O único fator de proteção observado foi cor da pele branca (p=0,01, 0.45>OR>0.94, IC95%). Não foi observada diferença de prevalência do estreptococo do Grupo B com outras variáveis reprodutivas ou obstétricas. Ocorreu infecção em apenas um dos recém-nascidos de mães colonizadas, entretanto revelou-se infecção por Pseudomonas spp. Foi encontrada resistência para ampicilina (4/9) e cefalotina (4/9), penicilina (4/9 casos), eritromicina (3/9), clindamicina (7/9) e cloranfenicol (1/9). CONCLUSÕES: A taxa de infecção foi inferior à encontrada em outros estudos, embora também notou-se grande taxa de resistência aos antibióticos mais utilizados no tratamento. São necessários novos estudos no Brasil, com grupos geograficamente semelhantes, para a validação desses resultados.

Taxa de infecção e sorotipos de Streptococcus agalactiae em amostras de recém-nascidos infectados na cidade de Campinas (SP), Brasil

OBJETIVO: Descrever os casos e o perfil microbiológico dos sorotipos de Streptococcus agalactiae provenientes de recém-nascidos em um Centro de Referência da Saúde da Mulher na cidade de Campinas, São Paulo, Brasil. MÉTODOS: Estudo transversal clínico-laboratorial realizado de janeiro de 2007 a dezembro de 2011. As cepas suspeitas, isoladas em amostras de sangue e líquor, foram identificadas a partir da hemólise em ágar sangue, coloração de Gram, provas de catalase, teste de CAMP, hidrólise do hipurato ou por automação microbiológica Vitek 2 BioMerieux®. A seguir, estas cepas foram tipadas por PCR utilizando sucessivamente primers específicos para espécie e para nove sorotipos de S. agalactiae. RESULTADOS: Foram isoladas sete amostras de sangue, uma de líquor e uma de secreção ocular provenientes de nove recém-nascidos com infecções causadas pelo S. agalactiae, sendo sete casos de infecção de início precoce e duas de início tardio. Apenas um destes casos foi positivo para amostras pareadas mãe-filho. Para um total de 13.749 partos no período, os 7 casos correspondem a 0,5 caso de infecção precoce por Streptococcus do Grupo B a cada 1 mil nascidos vivos (ou 0,6 casos por 1 mil, incluindo os 2 de infecção tardia), tendo ocorrido 1, 3, 2, nenhum e 3 casos (um precoce e dois tardios), respectivamente, nos anos de 2007 a 2011. Foi possível realizar o PCR para sete amostras, sendo duas de cada um dos sorotipos Ia e V e o sorotipo III em três amostras, uma delas em um recém-nascido e outras duas em amostra pareada mãe-filho. CONCLUSÕES: Embora com casuística limitada, os sorotipos encontrados coincidem com os mais prevalentes na literatura mundial, mas diferem dos estudos brasileiros, exceto para o sorotipo Ia.

Sorotipagem de amostras de Streptococcus suis isoladas de suínos em granjas dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Paraná

Infecções causadas por Streptococcus suis são muito comuns em países onde a indústria de carne suína é desenvolvida. Estas infecções estão relacionadas a casos clínicos de broncopneumonia, meningite, artrite, pericardite, miocardite, endocardite, poliserosite fibrinosa, septicemia, rinite e aborto. Esta bactéria também foi descrita como patógeno de ruminantes e humanos. No Brasil há evidências clínicas da existência de processos infecciosos causados por S. suis afetando mais de 50% das granjas em Estados como São Paulo, Minas Gerais e Paraná. No presente estudo foram isoladas 51 amostras de S. suis de granjas do Estados acima referidos, coletadas de diferentes casos clínicos como septicemia, meningite, artrite e pneumonia, tendo sido obtidas ou em cultura pura ou como patógeno de maior predominância nos tecidos de suínos. Este material foi semeado em Columbia ágar sangue adicionado de 5% de sangue bovino e incubado a 37°C por 24 horas. Para a identificação bioquímica as colônias que apresentavam a-hemólise, bem como as amostras padrão, foram submetidas a testes convencionais para a confirmação da espécie S. suis, tais como: hidrólise de arginina, teste de Voges-Proskauer, e produção de ácido a partir de vários carboidratos (inulina, salicina, trealose, lactose, sacarose, sorbitol, manitol e glicerol). As amostras também foram testadas para habilidade de crescimento em meio de TSA com 6,5% de NaCl e para a produção de amilase. Todas as amostras que fizeram parte desta pesquisa foram testadas pelo sistema Api 20 Strep para confirmação dos resultados obtidos nos testes convencionais. Para a sorotipagem foram produzidos antissoros de 1 a 8. Outras amostras não pertencentes a estes sorotipos também foram sorotipadas. O antissoro produzido em coelhos foi titulado pelo teste de aglutinação em tubo com 2-mercaptoetanol e pelo teste de reação capsular e, quando adequados, foram usados no teste de co-aglutinação, para a sorotipagem das amostras de S. suis. A sorotipagem das 51 amostras isoladas mostraram os seguintes resultados: 30 (58,8%) foram classificadas como sorotipo 2, 11 (21,6%) das amostras como sorotipo 3, sete (13,72%) como sorotipo 7, duas (3,92%) como sorotipo 1 e uma amostra como pertencente ao sorotipo14 (1,96%). Este é o primeiro relato do isolamento de um grande número de amostras de S. suis no Brasil, de casos típicos de processos infecciosos causados por esta bactéria. Também foi realizada a sorotipagem dos isolados, mostrando uma alta prevalência do sorotipo 2, quando comparada com a dos demais sorotipos encontrados.

Perfil fenotípico e susceptibilidade antimicrobiana de Streptococcus equi isolados de equinos da região Sul do Brasil

As características fenotípicas [morfológicas, bioquímicas, susceptibilidade aos antimicrobianos, índice de resistência múltipla aos antimicrobianos (IRMA), concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) da benzilpenicilina] de 38 isolados de Streptococcus equi oriundos de amostras clínicas de animais com adenite equina foram alvo deste estudo. A fenotipia demonstrou três padrões de colônias, três biotipos de fermentação de carboidratos e variação de 0 a 0,4 no IRMA. Todos os isolados de S. equi demonstraram sensibilidade à penicilina, tanto pelo método de disco difusão quanto pelo método de microdiluição. A CIM e CBM média de benzilpenicilina foi de 0,0095μg/mL e 0,0267μg/mL para S. equi subesp. equi e de 0,0128μg/mL e 0,0380μg/mL para S. equi subesp. zooepidemicus. Os valores de CIM e CBM diferiram entre as subespécies (p<0,05). O diâmetro do halo de inibição de penicilina demonstrou relação com a CIM (ì=0,03638 - 0,00072x) para S. equi subesp. equi. Também foi demonstrada relação entre o diâmetro do halo de inibição de penicilina com a CBM para S. equi subesp. equi (ì=0,10931- 0,00223x). Entretanto para as amostras de S. equi subesp. zooepidemicus esta relação somente foi verificada para a CBM (ì=0,1322 - 0,00271x). A CIM de benzilpenicilina frente às amostras isoladas da região Central, Planalto e Sul do estado do Rio Grande do Sul foram estatisticamente semelhantes, mas diferiram do isolado do estado do Paraná, sugerindo o caráter atípico desta cepa. Todos os isolados de S. equi são sensíveis à penicilina e sulfazotrim, confirmando a eleição destes antimicrobianos para o tratamento das infecções por este agente na clínica veterinária. Os resultados obtidos não dispensam a utilização prudente dos antimicrobianos.

Improvement of the indirect hemagglutination test for the detection of antibodies to Streptococcus pyogenes

An indirect hemagglutination test for a seroepidemiological survey of Streptococcus pyogenes infection was standardized. This is an improved modification of the indirect hemagglutination test which utilizes an unstable reagent prepared with fresh blood cells. Two types of bacterial antigens represented by extracellular products and purified streptolysin O were assayed, but only the former antigen gave good results. Pretreatment of the bacterial antigen with 0.15 M NaOH and neutralization to pH 5.5, as well as postfixation of sensitized red cells with 0.1% glutaraldehyde at 56oC for 30 min were found to be essential to give long stability to the reagent in liquid suspension, at least 9 months at 4oC. A total of 564 serum samples with high, moderate and low anti-streptolysin O antibodies as determined by the neutralization assay were studied by the indirect hemagglutination test using the new reagent. The sensitivity, specificity, efficiency, positive predictive value and negative predictive value of the test in relation to the neutralization assay were 0.950, 0.975, 0.963, 0.973, and 0.955, respectively. The kappa agreement index between the two techniques was high (0.926) and ranked as "almost perfect". Antibody levels detected by both techniques also presented a high positive correlation (rs = 0.726). Five reagent batches successively produced proved to be reproducible. Thus, the improved indirect hemagglutination test seems to be useful for public health laboratories.

Toluene permeabilization differentially affects F- and P-type ATPase activities present in the plasma membrane of Streptococcus mutans

Streptococcus mutans membrane-bound P- and F-type ATPases are responsible for H+ extrusion from the cytoplasm thus keeping intracellular pH appropriate for cell metabolism. Toluene-permeabilized bacterial cells have long been used to study total membrane-bound ATPase activity, and to compare the properties of ATPase in situ with those in membrane-rich fractions. The aim of the present research was to determine if toluene permeabilization can significantly modify the activity of membrane-bound ATPase of both F-type and P-type. ATPase activity was assayed discontinuously by measuring phosphate release from ATP as substrate. Treatment of S. mutans membrane fractions with toluene reduced total ATPase activity by approximately 80% and did not allow differentiation between F- and P-type ATPase activities by use of the standard inhibitors vanadate (3 µM) and oligomycin (4 µg/mL). Transmission electron microscopy shows that, after S. mutans cells permeabilization with toluene, bacterial cell wall and plasma membrane are severely injured, causing cytoplasmic leakage. As a consequence, loss of cell viability and disruption of H+ extrusion were observed. These data suggest that treatment of S. mutans with toluene is an efficient method for cell disruption, but care should be taken in the interpretation of ATPase activity when toluene-permeabilized cells are used, because results may not reflect the real P- and F-type ATPase activities present in intact cell membranes. The mild conditions used for the preparation of membrane fractions may be more suitable to study specific ATPase activity in the presence of biological agents, since this method preserves ATPase selectivity for standard inhibitors.

Streptococcus mutans GlnK protein: an unusual PII family member

Streptococcus mutans is a Gram-positive bacterium present in the oral cavity, and is considered to be one of the leading causes of dental caries. S. mutans has a glnK gene, which codes for a PII-like protein that is possibly involved in the integration of carbon, nitrogen and energy metabolism in several organisms. To characterize the GlnK protein of S. mutans, the glnK gene was amplified by PCR, and cloned into the expression vectors pET29a(+) and pET28b(+). The native GlnK-Sm was purified by anion exchange (Q-Sepharose) and affinity (Hi-Trap Heparin) chromatography. The GlnK-His-Sm protein was purified using a Hi-Trap Chelating-Ni2+ column. The molecular mass of the GlnK-His-Sm proteins was 85 kDa as determined by gel filtration, indicating that this protein is a hexamer in solution. The GlnK-His-Sm protein is not uridylylated by the Escherichia coli GlnD protein. The activities of the GlnK-Sm and GlnK-His-Sm proteins were assayed in E. coli constitutively expressing the Klebsiella pneumoniae nifLA operon. In K. pneumoniae, NifL inhibits NifA activity in the presence of high ammonium levels and the GlnK protein is required to reduce the inhibition of NifL in the presence of low ammonium levels. The GlnK-Sm protein was unable to reduce NifL inhibition of NifA protein. Surprisingly, the GlnK-His-Sm protein was able to partially reduce NifL inhibition of the NifA protein under nitrogen-limiting conditions, in a manner similar to the GlnK protein of E. coli. These results suggested that S. mutans GlnK is functionally different from E. coli PII proteins.

The Streptococcus mutans GlnR protein exhibits an increased affinity for the glnRA operon promoter when bound to GlnK

The control of nitrogen metabolism in pathogenic Gram-positive bacteria has been studied in a variety of species and is involved with the expression of virulence factors. To date, no data have been reported regarding nitrogen metabolism in the odontopathogenic species Streptococcus mutans. GlnR, which controls nitrogen assimilation in the related bacterial species, Bacillus subtilis, was assessed in S. mutans for its DNA and protein binding activity. Electrophoretic mobility shift assay of the S. mutans GlnR protein indicated that GlnR binds to promoter regions of the glnRA and amtB-glnK operons. Cross-linking and pull-down assays demonstrated that GlnR interacts with GlnK, a signal transduction protein that coordinates the regulation of nitrogen metabolism. Upon formation of this stable complex, GlnK enhances the affinity of GlnR for the glnRA operon promoter. These results support an involvement of GlnR in transcriptional regulation of nitrogen metabolism-related genes and indicate that GlnK relays information regarding ammonium availability to GlnR.