Development of a new flexor tendon repair technique performed with bioabsorbable poly-L/D-lactide (PLDLA) suture

Sormen koukistajajännevamman korjauksen jälkeisen aktiivisen mobilisaation on todettu johtavan parempaan toiminnalliseen lopputulokseen kuin nykyisin yleisesti käytetyn dynaamisen mobilisaation. Aktiivisen mobilisaation ongelma on jännekorjauksen pettämisriskin lisääntyminen nykyisten ommeltekniikoiden riittämättömän vahvuuden vuoksi. Jännekorjauksen lujuutta on parannettu kehittämällä monisäieommeltekniikoita, joissa jänteeseen tehdään useita rinnakkaisia ydinompeleita. Niiden kliinistä käyttöä rajoittaa kuitenkin monimutkainen ja aikaa vievä tekninen suoritus. Käden koukistajajännekorjauksessa käytetään yleisesti sulamattomia ommelmateriaaleja. Nykyiset käytössä olevat biohajoavat langat heikkenevät liian nopeasti jänteen paranemiseen nähden. Biohajoavan laktidistereokopolymeeri (PLDLA) 96/4 – langan vetolujuuden puoliintumisajan sekä kudosominaisuuksien on aiemmin todettu soveltuvan koukistajajännekorjaukseen. Tutkimuksen tavoitteena oli kehittää välittömän aktiivisen mobilisaation kestävä ja toteutukseltaan yksinkertainen käden koukistajajännekorjausmenetelmä biohajoavaa PLDLA 96/4 –materiaalia käyttäen. Tutkimuksessa analysoitiin viiden eri yleisesti käytetyn koukistajajänneompeleen biomekaanisia ominaisuuksia staattisessa vetolujuustestauksessa ydinompeleen rakenteellisten ominaisuuksien – 1) säikeiden (lankojen) lukumäärän, 2) langan paksuuden ja 3) ompeleen konfiguraation – vaikutuksen selvittämiseksi jännekorjauksen pettämiseen ja vahvuuteen. Jännekorjausten näkyvän avautumisen todettiin alkavan perifeerisen ompeleen pettäessä voima-venymäkäyrän myötöpisteessä. Ydinompeleen lankojen lukumäärän lisääminen paransi ompeleen pitokykyä jänteessä ja suurensi korjauksen myötövoimaa. Sen sijaan paksumman (vahvemman) langan käyttäminen tai ompeleen konfiguraatio eivät vaikuttaneet myötövoimaan. Tulosten perusteella tutkittiin mahdollisuuksia lisätä ompeleen pitokykyä jänteestä yksinkertaisella monisäieompeleella, jossa ydinommel tehtiin kolmen säikeen polyesterilangalla tai nauhamaisen rakenteen omaavalla kolmen säikeen polyesterilangalla. Nauhamainen rakenne lisäsi merkitsevästi ompeleen pitokykyä jänteessä parantaen myötövoimaa sekä maksimivoimaa. Korjauksen vahvuus ylitti aktiivisen mobilisaation jännekorjaukseen kohdistaman kuormitustason. PLDLA 96/4 –langan soveltuvuutta koukistajajännekorjaukseen selvitettiin tutkimalla langan biomekaanisia ominaisuuksia ja solmujen pito-ominaisuuksia staattisessa vetolujuustestauksessa verrattuna yleisimmin jännekorjauksessa käytettävään punottuun polyesterilankaan (Ticron®). PLDLA –langan todettiin soveltuvan hyvin koukistajajännekorjaukseen, sillä se on polyesterilankaa venymättömämpi ja solmujen pitävyys on parempi. Viimeisessä vaiheessa tutkittiin PLDLA 96/4 –langasta valmistetulla kolmisäikeisellä, nauhamaisella jännekorjausvälineellä tehdyn jännekorjauksen kestävyyttä staattisessa vetolujuustestauksessa sekä syklisessä kuormituksessa, joka simuloi staattista testausta paremmin mobilisaation toistuvaa kuormitusta. PLDLA-korjauksen vahvuus ylitti sekä staattisessa että syklisessä kuormituksessa aktiivisen mobilisaation edellyttämän vahvuuden. Nauhamaista litteää ommelmateriaalia ei aiemmin ole tutkittu tai käytetty käden koukistajajännekorjauksessa. Tässä tutkimuksessa ommelmateriaalin nauhamainen rakenne paransi merkitsevästi jännekorjauksen vahvuutta, minkä arvioidaan johtuvan lisääntyneestä kontaktipinnasta jänteen ja ommelmateriaalin välillä estäen ompeleen läpileikkautumista jänteessä. Tutkimuksessa biohajoavasta PLDLA –materiaalista valmistetulla rakenteeltaan nauhamaisella kolmisäikeisellä langalla tehdyn jännekorjauksen vahvuus saavutti aktiivisen mobilisaation edellyttämän tason. Lisäksi uusi menetelmä on helppokäyttöinen ja sillä vältetään perinteisten monisäieompeleiden tekniseen suoritukseen liittyvät ongelmat.

Enhanced Efficacy of Pluronic Copolymer Micelle Encapsulated SCR7 against Cancer Cell Proliferation(a)

5,6-Bis(benzylideneamino)-2-mercaptopyrimidin-4-ol (SCR7) is a new anti cancer molecule having capability to selectively inhibit non-homologous end joining (NHEJ), one of the DNA double strand break (DSB) repair pathways inside the cells. In spite of the promising potential as an anticancer agent, hydrophobicity of SCR7 decreases its bioavailability. Herein the entrapment of SCR7 in Pluronic copolymer is reported. The size of the aggregates was determined by transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) which yields an average diameter of 23 nm. SCR7 encapsulated micelles (ES) were also characterized by small-angle neutron scattering (SANS). Evaluation of its biological properties by using a variety of techniques, including Trypan blue, MTT and Live-dead cell assays, reveal that encapsulated SCR7 can induce cytotoxicity in cancer cell lines, being more effective in breast cancer cell line. Encapsulated SCR7 treatment resulted in accumulation of DNA breaks within the cells, resulting in cell cycle arrest at G1 phase and activation of apoptosis. More importantly, we found approximate to 5 fold increase in cell death, when encapsulated SCR7 was used in comparison with SCR7 alone.

Homology and enzymatic requirements of microhomology-dependent alternative end joining

Nonhomologous DNA end joining (NHEJ) is one of the major double-strand break (DSB) repair pathways in higher eukaryotes. Recently, it has been shown that alternative NHEJ (A-NHEJ) occurs in the absence of classical NHEJ and is implicated in chromosomal translocations leading to cancer. In the present study, we have developed a novel biochemical assay system utilizing DSBs flanked by varying lengths of microhomology to study microhomology-mediated alternative end joining (MMEJ). We show that MMEJ can operate in normal cells, when microhomology is present, irrespective of occurrence of robust classical NHEJ. Length of the microhomology determines the efficiency of MMEJ, 5 nt being obligatory. Using this biochemical approach, we show that products obtained are due to MMEJ, which is dependent on MRE11, NBS1, LIGASE III, XRCC1, FEN1 and PARP1. Thus, we define the enzymatic machinery and microhomology requirements of alternative NHEJ using a well-defined biochemical system.

水稻花药绒毡层特异基因及减数分裂相关基因的分离与功能分析

　利用RNA减法杂交、差异筛选和5’-RACE等方法从水稻分离到了一花药绒毡层特异表达的基因RA39。Southern 杂交表明，RA39在水稻基因组中是以单拷贝的形式存在的。RT-PCR 结果初步表明，RA39是一水稻花药特异表达的基因。RNA原位杂交进一步表明，RA39主要在水稻花药的绒毡层中表达，而且在小孢子母细胞减数分裂期和四分体时期表达量最高。RA39 cDNA全长1013bp，编码298个氨基酸残基。 RA39 cDNA与数据库中的已知序列没有明显的相似性，由其推测的多肽与核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating protein, RIP）的序列相似在19-34%之间。多重序列排列分析结果表明构成RIPs活性位点的5个关键氨基酸残基在RA39中是保守的，在蓖麻毒蛋白中分别为Tyr80、 Tyr123、 Glu177、 Arg180 and Trp211 。利用原核表达系统，通过蛋白质分离和纯化获得了在SDS电泳图谱上为单一条带的纯的RA39蛋白，用兔rRNA作底物进行的酶活性分析证明该蛋白有N-糖基化作用，是一种类型I的核糖体失活蛋白。反义转基因植株的花粉用TTC进行活性染色结果显示其活性明显减弱，成熟的T0代反义转基因植株的结实率明显降低，只有对照的20-60%。这说明，RA39蛋白可能和小孢子母细胞的发育相关。 　　酵母DMC1是减数分裂过程中同源染色体配对和重组修复所必需的减数分裂特异基因。根据酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1的保守区设计简并性引物，通过RT-PCR和RACE等方法，从水稻中分离出了酵母DMC1的同源基因OsDMC1。RT-PCR分析表明，OsDMC1在花中表达量最高，在根中表达量较低，在叶片和幼芽几乎不表达。水稻基因组中有两个拷贝的OsDMC1。OsDmc1蛋白与酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1氨基酸一致性分别为53%和81%。 　　酵母Spo11在减数分裂过程中具有催化DNA双链断裂从而起始同源重组的功能。以酵母Spo11氨基酸序列为探针和现有的数据库通过数据分析，结合RACE技术，克隆了水稻SPO11同源基因OsSPO11-1， OsSPO11-1是一个单拷贝基因，有3个外显子和2个内含子，在转录过程中通过内含子的可变剪切产生4个不同的转录本（OsSPO11-1A、OsSPO11-1B、OsSPO11-1C和OsSPO11-1），其中，OsSPO11-1A是一个未剪切的转录本，OsSPO11-1B包含内含子2，OsSPO11-1C包含内含子1，OsSPO11-1D是一个完全剪切的转录本。这些转录本编码的蛋白有一致的246氨基酸残基的C-端，包含了Spo11/TopVIA家族蛋白共有的5个功能基元，是该家族的新成员。OsSPO11-1A和 OsSPO11-1C在花中优势积累，OsSPO11-1B是花特异的，而OsSPO11-1D在营养器官中优势积累。在花中该基因主要在减数分裂的花粉母细胞和胚曩中表达，在减数分裂期的绒毡层细胞和不同花器官的微管束细胞中也表达。这些结果说明内含子涉及到了OsSPO11-1表达的器官特异性调节，该基因除了参与减数分裂的调节外，在体细胞的发育中可能起重要作用。

Fragmentation and plasmid strand breaks in pure and gold-doped DNA irradiated by beams of fast hydrogen atoms

The results of an investigation into the damage caused to dry plasmid DNA after irradiation by fast (keV) hydrogen atoms are presented. Agarose gel electrophoresis was used to assess single and double strand break yields as a function of dose in dry DNA samples deposited on a mica substrate. Damage levels were observed to increase with beam energy. Strand break yields demonstrated a considerable dependence on sample structure and the method of sample preparation. Additionally, the effect of high-Z nanoparticles on damage levels was investigated by irradiating DNA samples containing controlled amounts of gold nanoparticles. In contrast to previous (photonic) studies, no enhancement of strand break yields was observed with the particles showing a slight radioprotective effect. A model of DNA damage as a function of dose has been constructed in terms of the probability for the creation of single and double strand breaks, per unit ion flux. This model provides quantitative conclusions about the effects of both gold nanoparticles and the different buffers used in performing the assays and, in addition, infers the proportion of multiply damaged fragments.

Evidence for the direct binding of phosphorylated p53 to sites of DNA breaks in vivo

Despite a clear link between ataxia-telangiectasia mutated (ATM)-dependent phosphorylation of p53 and cell cycle checkpoint control, the intracellular biology and subcellular localization of p53 phosphoforms during the initial sensing of DNA damage is poorly understood. Using GO-G, confluent primary human diploid fibroblast cultures, we show that endogenous p53, phosphorylated at Ser(15) (p53(Ser15)), accumulates as discrete, dose-dependent and chromatin-bound foci within 30 minutes following induction of DNA breaks or DNA base damage. This biologicafly distinct subpool of p53(Ser15) is ATM dependent and resistant to 26S-proteasomal degradation. p53(Ser15) colocalizes and coimmunoprecipitates with gamma-H2AX with kinetics similar to that of biochemical DNA double-strand break (DNA-dsb) rejoining. Subnuclear micro-beam irradiation studies confirm p53 S,,15 is recruited to sites of DNA damage containing gamma-H2AX, ATM(Ser1981), and DNA-PKcs(Thr2609) in vivo. Furthermore, studies using isogenic human and murine cells, which express Ser(15) or Ser(18) phosphomutant proteins, respectively, show defective nuclear foci formation, decreased induction of p21(WAF) decreased gamma-H2AX association, and altered DNA-dsb kinetics following DNA damage. Our results suggest a unique biology for this p53 phosphoform in the initial steps of DNA damage signaling and implicates ATM-p53 chromatin-based interactions as mediators of cell cycle checkpoint control and DNA repair to prevent carcinogenesis. (Cancer Res 2005; 65(23): 10810-21).

Targeting EGFR Induced Oxidative Stress by PARP1 Inhibition in Glioblastoma Therapy

Despite the critical role of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) in glioblastoma pathogenesis [1,2], EGFR targeted therapies have achieved limited clinical efficacy [3]. Here we propose an alternate therapeutic strategy based on the conceptual framework of non-oncogene addiction [4,5]. A directed RNAi screen revealed that glioblastoma cells overexpressing EGFRvIII [6], an oncogenic variant of EGFR, become hyper-dependent on a variety of DNA repair genes. Among these, there was an enrichment of Base Excision Repair (BER) genes required for the repair of Reactive Oxygen Species (ROS)-induced DNA damage, including poly-ADP ribose polymerase 1 (PARP1). Subsequent studies revealed that EGFRvIII overexpression in glioblastoma cells caused increased levels of ROS, DNA strand break accumulation, and genome instability. In a panel of primary glioblastoma lines, sensitivity to PARP1 inhibition correlated with the levels of EGFR activation and oxidative stress. Gene expression analysis indicated that reduced expression of BER genes in glioblastomas with high EGFR expression correlated with improved patient survival. These observations suggest that oxidative stress secondary to EGFR hyperactivation necessitates increased cellular reliance on PARP1 mediated BER, and offer critical insights into clinical trial design.

Un rôle pour les protéines de la famille Whirly dans le maintien de la stabilité du génome des organelles chez Arabidopsis thaliana

Le maintien de la stabilité du génome est essentiel pour la propagation de l’information génétique et pour la croissance et la survie des cellules. Tous les organismes possèdent des systèmes de prévention des dommages et des réarrangements de l’ADN et nos connaissances sur ces processus découlent principalement de l’étude des génomes bactériens et nucléaires. Comparativement peu de choses sont connues sur les systèmes de protection des génomes d’organelles. Cette étude révèle l’importance des protéines liant l’ADN simple-brin de la famille Whirly dans le maintien de la stabilité du génome des organelles de plantes. Nous rapportons que les Whirlies sont requis pour la stabilité du génome plastidique chez Arabidopsis thaliana et Zea mays. L’absence des Whirlies plastidiques favorise une accumulation de molécules rearrangées produites par recombinaison non-homologue médiée par des régions de microhomologie. Ce mécanisme est similaire au “microhomology-mediated break-induced replication” (MMBIR) retrouvé chez les bactéries, la levure et l’humain. Nous montrons également que les organelles de plantes peuvent réparer les bris double-brin en utilisant une voie semblable au MMBIR. La délétion de différents membres de la famille Whirly entraîne une accumulation importante de réarrangements dans le génome des organelles suite à l’induction de bris double-brin. Ces résultats indiquent que les Whirlies sont aussi importants pour la réparation fidèle des génomes d’organelles. En se basant sur des données biologiques et structurales, nous proposons un modèle où les Whirlies modulent la disponibilité de l’ADN simple-brin, régulant ainsi le choix des voies de réparation et permettant le maintien de la stabilité du génome des organelles. Les divers aspects de ce modèle seront testés au cours d’expériences futures ce qui mènera à une meilleure compréhension du maintien de la stabilité du génome des organelles.

Rôle du gène Polycomb BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et létale chez l’adulte. Malgré les avancés fulgurantes dans la dernière décennie au niveau des thérapies contre le cancer, le pronostique reste inchangé. Le manque de spécificité des traitements est la cause première de la récurrence de cette tumeur. Une meilleure compréhension au niveau des mécanismes moléculaires et biologiques de cette tumeur est impérative. La découverte des cellules souches cancéreuses (CD133+) au niveau du GBM offre une nouvelle opportunité thérapeutique contre cette tumeur. Effectivement, les cellules CD133+ seraient responsables de l’établissement, le maintien et la progression du GBM. De plus, elles sont également la cause de la résistance du GBM faces aux traitements de radiothérapies. Ces cellules représentent une cible de choix dans le but d’éradiquer le GBM. L’oncogène BMI1 a été associé à plusieurs types de tumeurs et est également essentielle au maintien de différentes populations de cellules souches normales et cancéreuses. Une forte expression de BMI1 est observée au niveau du GBM et plus précisément, un enrichissement préférentiel de cette protéine est noté au niveau des cellules CD133+. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer le rôle potentiel de BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses (CSC), CD133+ du GBM. La fonction principale de BMI1 est la régulation négative du locus INK4A/ARF. Ce locus est impliqué dans l’activation de deux voies majeurs anti-tumorales : P53 et RB. Or, la perte de BMI1 induit in vitro une diminution des capacités prolifératives, une augmentation de la différentiation et de l’apoptose, ainsi qu’une augmentation de la radiosensibilité des CSC du GBM indépendamment de la présence du locus INK4A/ARF. Effectivement, deux tumeurs sur trois possèdent une délétion de ce locus, ce qui suggère que BMI1 possède d’autre(s) cible(s) transcriptionnelle(s). Parmi ces nouvelles cibles ont retrouve la protéine P21, un régulateur négatif du cycle cellulaire. De plus, la perte de BMI1 inhibe l’établissement d’une tumeur cérébrale lors d’études de xénogreffe chez la souris NOD/SCID. Également, une nouvelle fonction de BMI1 indépendante de son activité transcriptionnel a été démontrée. Effectivement, suite à l’induction d’un bris double brin (BDB) de l’ADN, BMI1 est rapidement recruté au niveau de la lésion et influence le recrutement des protéines de reconnaissance du dommage à l’ADN. La perte de BMI1 mène à un défaut au niveau de la reconnaissance et la réparation de l’ADN, alors que sa surexpression induit plutôt une augmentation de ces mécanismes et procure une radiorésistance. Ces résultats décrivent pour la première fois l’importance de BMI1 au niveau du maintien, de l’auto-renouvellement et la radiorésistance des CSC du GBM. Ainsi, ces travaux démontrent que la protéine BMI1 représente une cible thérapeutique de choix dans le but d’éradiquer le GBM, une tumeur cérébrale létale.

The role of ubiquitination and deubiquitination in the regulation of BRCA1 function during genotoxic stress

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36.

Étude du rôle de la phosphorylation du complexe Mre11-Rad50-Xrs2 dans le maintien de l'intégrité génomique

L'ADN de chaque cellule est constamment soumis à des stress pouvant compromettre son intégrité. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent être des sources de réarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer s’ils sont mal réparés. La recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement différentes utilisées pour réparer ce type de dommage. Or, les mécanismes régulant le choix entre ces deux voies pour la réparation des bris double-brins demeurent nébuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur à être recruté à ce type de bris où il contribue à la réparation par recombinaison homologue ou JENH. À l’intersection de ces deux voies, il est donc idéalement placé pour orienter le choix de réparation. Ce mémoire met en lumière deux systèmes distincts de phosphorylation du complexe MRX régulant spécifiquement le JENH. L’un dépend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que l’autre requiert la présence de dommages à l’ADN et est nécessaire au JENH. Ensembles, nos résultats suggèrent que le complexe MRX intègre différents phospho-stimuli pour réguler le choix de la voie de réparation.

Caractérisation biochimique du complexe Smc5-6

Les membres de la famille SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), présents dans tous les domaines de la vie, sont impliqués dans des processus allant de la cohésion des chromatides-sœurs jusqu’à la réparation de l’ADN. Chacun des membres de cette famille, composée de 6 membres (Smc1 à Smc6), s’associe avec un autre membre ainsi qu’à des sous-unités non-SMC pour former 3 complexes : cohésine, condensine et Smc5-6. L’implication du complexe Smc5-6 dans plusieurs aspects du maintien de l’intégrité génomique est bien démontrée. Néanmoins, une question fondamentale concernant ce complexe demeure encore sans réponse: comment peut-il être impliqué dans autant d’aspects de la vie d’une cellule? Encore à ce jour, il est difficile de répondre à cette question en raison du manque d’information disponible au sujet des activités biochimiques de ce complexe. C’est pourquoi l’objectif de ce travail consiste en la caractérisation biochimique du complexe Smc5-6. La biochimie de cohésine et condensine suggère diverses possibilités en ce qui a trait aux activités biochimiques du complexe Smc5-6. La première étape de mon projet fut donc d’élaborer une procédure pour la purification de Smc5 et Smc6 après surexpression en levure. Après plusieurs expériences, il apparut clair que les deux protéines possèdent une activité de liaison à l’ADN simple brin (ADNsb) ainsi qu’à l’ADN double brins (ADNdb) et que, même si les protéines peuvent se lier aux deux types d’ADN, elles possèdent une plus grande affinité pour l’ADNsb. De plus, ces expériences permirent de démontrer que l’interaction entre Smc5 ou Smc6 et l’ADNsb est très stable, alors que l’interaction avec l’ADNdb ne l’est pas. Suite à l’obtention de ces résultats, la seconde étape fut la détermination de la ou des partie(s) de Smc5 et Smc6 permettant la liaison à l’ADN. Pour répondre à cette question, une dissection moléculaire fut réalisée, suivi d’une caractérisation des différents domaines constituants Smc5 et Smc6. De cette façon, il fut possible de démontrer qu’il existe deux sites de liaison à l’ADN sur Smc5 et Smc6 ; le premier site se trouvant dans le domaine «hinge» ainsi que dans la région adjacente du domaine «coiled-coil» et le second au niveau de la tête ATPase des deux protéines. Bien que les deux domaines puissent lier l’ADNsb, il fut démontré qu’une différence majeure existe au niveau de leur affinité pour ce type d’ADN. En effet, le domaine «hinge» possède une affinité plus forte pour l’ADNsb que la tête ATPase. De plus, cette dernière est incapable de lier l’ADNdb alors que le domaine «hinge» le peut. L’identification des sites de liaison à l’ADN sur Smc5 et Smc6 permettra de créer de nouveaux mutants possédant un défaut dans la liaison à l’ADN. Ainsi, l’étude du complexe Smc5-6 durant la réparation de l’ADN in vivo sera facilité.

Análise da Expressão de APE1 após Estresse Oxidativo Induzido em Células Proficientes e Deficientes na Via de Reparo por Excisão de Nucleotídeos

Riboflavin is a vitamin very important in aerobic organisms, as a precursor of many coenzymes involved in the electron transporter chain. However, after photosensitization of riboflavin with UV or visible light, it generates reactive oxygen species (ROS), which can oxidize the DNA. The repair of oxidative lesions on DNA occurs through the base excision repair pathway (BER), where APE1 endonuclease plays a central role. On the other hand, the nucleotide excision repair pathway (NER) repairs helix-distorting lesions. Recently, it was described the participation of NERproteins in the repair of oxidative damage and in stimulation of repair function fromAPE1. The aim of this research was to evaluate the cytotoxic effects of photosensitized riboflavin (RF*) in cells proficient and deficient in NER, correlating with APE1 expression. For this propose, the cells were treated with RF* and it was performed the cell viability assay, extraction of whole proteins, cells fractionation, immunoblotting, indirect immunofluorescence and analysis of polymorphisms of BER gens. The results evidenced that cells deficient in XPA and CSB proteins were more sensitive to RF*. However, XPC-deficient cells presented similar resistance to MRC5- SV cells, which is proficient in NER. These results indicate that XPA and CSB proteins have an important role on repair of oxidative lesions induced by RF*. Additionally, it was evidenced that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in BER enzymes may influence in sensitivity of NER-deficient cell lines. Concerning the APE1 expression, the results showed that expression of this protein after treatment with RF* only changed in XPC-deficient cells. Though, it was observed that APE1 is recruited and is bound to chromatin in MRC5-SV and XPA cells after treatment with RF*. The results also showed the induction of DNA damage after treatment with RF*, through the analysis of-H2AX, since the treatment promoted an increase of endogenous levels of this phosphorylated protein, which acts signaling double strand-break on DNA. On the other hand, in XPC-deficient cells, regardless of resistance of RF*, the endogenous levels of APE1 are extremely reduced when compared with other cell lines and APE1 is not bound to chromatin after treatment with RF*. These results conclude that RF* was able to induce cell death in NERdeficient cells, where XPA and CSB cells were more sensitive when compared with MRC5-SV and XPC-deficient cells. This last result is potentially very interesting, since XPC-deficient cell line presents low levels of APE1. Additionally, the results evidenced that APE1 protein can be involved in the repair of oxidative damage induced by RF*, because APE1 is recruited and bound strongly to chromatin after treatment.

Chromosomal aberrations induced by 5-azacytidine combined with VP-16 (etoposide) in CHO-K1 and XRS-5 cell lines

A cytogenetic study was carried out with 5-azacytidine (5-azaC) and etoposide (VP-16) in CHO-K1 and XRS-5 (mutant cells deficient for double-strand break rejoining) cell lines to verify the interaction effects of the drugs in terms of induction of chromosomal aberrations. 5-azaC is incorporated into DNA causing DNA hypomethylation, and VP-16 (inhibitor of topoisomerase 11 enzyme) is a potent clastogenic agent. Cells in exponential growth were treated with 5-azaC for I h, following incubation for 7 h, and posttreatment with VP16 for the last 3 h. In K1 cells, the combined treatments induced a significant reduction in the aberrations induced in the X and A (autosome) chromosomes, which are the main target for 5-azaC. However, in XRS-5 cells, the drug combination caused a significant increase in the aberrations induced in those chromosomes, but with a concomitant reduction in the randomly induced-aberrations. In addition, each cell line presented characteristic cell cycle kinetics; while the combined treatment induced an S-arrest in K1 cells, alterations in cell cycle progression were not found for XRS-5, although each drug alone caused a G2-arrest. The different cell responses presented by the cell lines may be explained on the basis of the evidence that alterations in chromatin structure caused by 5-aza-C probably occur to a different extent in K1 and XRS-5 cells, since the mutant cells present a typical hyper-condensed chromosome structure (especially the X- and A chromosomes), but, alternatively, 5-aza-C could induce reactivation of DNA repair genes in XRS-5 cells. Teratogenesis Carcinog. Mutagen. Suppl. 1:171-186, 2003. (C) 2003 Wiley-Liss, Inc.

Mechanistic study of cell death induction by O 6-methylating agents, focusing on the role of homologous recombination as a molecular target for sensitization of tumor cells to chemotherapeutic alkylating agents

Chemotherapeutic SN1‑methylating agents are important anticancer drugs. They induce several covalent modifications in the DNA, from which O6‑methylguanine (O6MeG) is the main toxic lesion. In this work, different hypotheses that have been proposed to explain the mechanism of O6MeG‑triggered cell death were tested. The results of this work support the abortive processing model, which states that abortive post‑replicative processing of O6MeG‑driven mispairs by the DNA mismatch repair (MMR) machinery results in single‑strand gaps in the DNA that, upon a 2nd round of DNA replication, leads to DNA double‑strand break (DSB) formation, checkpoint activation and cell death. In this work, it was shown that O6MeG induces an accumulation of cells in the 2nd G2/M‑phase after treatment. This was accompanied by an increase in DSB formation in the 2nd S/G2/M‑phase, and paralleled by activation of the checkpoint kinases ATR and CHK1. Apoptosis was activated in the 2nd cell cycle. A portion of cells continue proliferating past the 2nd cell cycle, and triggers apoptosis in the subsequent generations. An extension to the original model is proposed, where the persistence of O6MeG in the DNA causes new abortive MMR processing in the 2nd and subsequent generations, where new DSB are produced triggering cell death. Interestingly, removal of O6MeG beyond the 2nd generation lead to a significant, but not complete, reduction in apoptosis, pointing to the involvement of additional mechanisms as a cause of apoptosis. We therefore propose that an increase in genomic instability resulting from accumulation of mis‑repaired DNA damage plays a role in cell death induction. Given the central role of DSB formation in toxicity triggered by chemotherapeutic SN1‑alkylating agents, it was aimed in the second part of this thesis to determine whether inhibition of DSB repair by homologous recombination (HR) or non‑homologous end joining (NHEJ) is a reasonable strategy for sensitizing glioblastoma cells to these agents. The results of this work show that HR down‑regulation in glioblastoma cells impairs the repair of temozolomide (TMZ)‑induced DSB. HR down‑regulation greatly sensitizes cells to cell death following O6‑methylating (TMZ) or O6‑chlorethylating (nimustine) treatment, but not following ionizing radiation. The RNAi mediated inhibition in DSB repair and chemo‑sensitization was proportional to the knockdown of the HR protein RAD51. Chemo‑sensitization was demonstrated for several HR proteins, in glioma cell lines proficient and mutated in p53. Evidence is provided showing that O6MeG is the primary lesion responsible for the increased sensitivity of glioblastoma cells following TMZ treatment, and that inhibition of the resistance marker MGMT restores the chemo‑sensitization achieved by HR down‑regulation. Data are also provided to show that inhibition of DNA‑PK dependent NHEJ does not significantly sensitized glioblastoma cells to TMZ treatment. Finally, the data also show that PARP inhibition with olaparib additionally sensitized HR down‑regulated glioma cells to TMZ. Collectively, the data show that processing of O6MeG through two rounds of DNA replication is required for DSB formation, checkpoint activation and apoptosis induction, and that O6MeG‑triggered apoptosis is also executed in subsequent generations. Furthermore, the data provide proof of principle evidence that down‑regulation of HR is a reasonable strategy for sensitizing glioma cells to killing by O6‑alkylating chemotherapeutics.