Isolation of an 800 kb contiguous DNA fragment encompassing a 3.5-cM region of chromosome 1 in Arabidopsis using YAC clones

The apetalal mutation of Arabidopsis affects floral meristem identity and the development of sepal and petal primordia of the flower. We mapped the available RFLP markers on chromosome 1 that are in the general vicinity of apetalal on a fine structure map and then chose the closest RFLP as a starting point for contiguous DNA (contig) generation. We report here a contig of about 800 kilobases (kb) that spans a 3.5 cM region of chromosome 1. We used genomic libraries of Arabidopsis prepared in yeast artificial chromosome (YAC) vectors and the detailed characterization of 19 YACs is reported. RFLPs displayed by the end fragments from the walk were mapped to align and correlate the genetic and physical maps for this region of chromosome 1. In this segment of the genome, 1 cM corresponds to a little over 200 kb of physical distance.

The role of lysine-256 in the structure and function of sheep liver recombinant serine hydroxymethyltransferase

The active site lysine residue, K256, involved in Schiffs base linkage with pyridoxal-5'-phosphate (PEP) in sheep liver recombinant serine hydroxymethyltransferase (rSHMT) was changed to glutamine or arginine by site-directed mutagenesis. The purified K256Q and K256R SHMTs had less than 0.1% of catalytic activity with serine and H(4)folate as substrates compared to rSHMT. The mutant enzymes also failed to exhibit the characteristic visible absorbance spectrum (lambda(max) 425 nm) and did not produce the quinonoid intermediate (lambda(max) 495 nm) upon the addition of glycine and H(4)folate. The mutant enzymes were unable to catalyze aldol cleavage of beta-phenylserine and transamination of D-alanine. These results suggested that the mutation of the lysine had resulted in the inability of the enzyme to bind to the cofactor. Therefore, the K256Q SHMT was isolated as a dimer and the K256R SHMT as a mixture of dimers and tetramers which were converted to dimers slowly. On the other hand, rSHMT was stable as a tetramer for several months, further confirming the role of PLP in maintenance of oligomeric structure. The mutant enzymes also failed to exhibit the increased thermal stability upon the addition of serine, normally observed with rSHMT. The enhanced thermal stability has been attributed to a change in conformation of the enzyme from open to closed form leading to reaction specificity. The mutant enzymes were unable to undergo this conformational change probably because of the absence of bound cofactor.

Characterization of recombinant diaminopropionate ammonia-lyase from Escherichia coli and Salmonella typhimurium

Diaminopropionate ammonia-lyase gene from Escherichia coli and Salmonella typhimurium was cloned and the overexpressed enzymes were purified to homogeneity. The k(cat) Values, determined for the recombinant enzymes with DL-DAP, D-serine, and L-serine as substrates, showed that the enzyme from S. typhimurium was more active than that from E coli and the K-m values were found to be similar. The purified enzymes had an absorption maximum (lambda(max)) at 412 nm, typical of PLP dependent enzymes. A red shift in lambda(max) was observed immediately after the addition Of 10 MM DL-DAP, which returned to the original lambda(max) of 412 nm in about 4 min. This red shift might reflect the formation of an external aldimine and/or other transient intermediates of the reaction. The apoenzyme of E coli and S. typhimurium prepared by treatment With L-cysteine could be partially (60%) reconstituted by the addition of PLP. The holo, apo, and the reconstituted enzymes were shown to be present as homo dimers by size exclusion chromatography. (C) 2003 Elsevier Science (USA). All rights reserved.

Development of recombinant coat protein antibody based IC-RT-PCR for detection and discrimination of sugarcane streak mosaic virus isolates from Southern India

Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV), causes mosaic disease of sugarcane and is thought to belong to a new undescribed genus in the family Potyviridae. The coat protein (CP) gene from the Andhra Pradesh (AP) isolate of SCSMV (SCSMV AP) was cloned and expressed in Escherichia coli. The recombinant coat protein was used to raise high quality antiserum. The CP antiserum was used to develop an immunocapture reverse transcription-polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) based assay for the detection and discrimination of SCSMV isolates in South India. The sequence of the cloned PCR products encoding 3'untranslated region (UTR) and CP regions of the virus isolates from three different locations in South India viz. Tanuku (Coastal Andhra Pradesh), Coimbatore (Tamil Nadu) and Hospet (Karnataka) was compared with that of SCSMV AP The analysis showed that they share 89.4, 89.5 and 90% identity respectively at the nucleotide level. This suggests that the isolates causing mosaic disease of sugarcane in South India are indeed strains of SCSMV In addition, the sensitivity of the IC-RT-PCR was compared with direct antigen coating-enzyme linked immunosorbent assay (DAC-ELISA) and dot-blot immunobinding assays and was found to be more sensitive and hence could be used to detect the presence of virus in sugarcane breeding, germplasm centres and in quarantine programs.

Docking and free energy simulations to predict conformational domains involved in hCG-LH receptor interactions using recombinant antibodies

Single chain fragment variables (ScFvs) have been extensively employed in studying the protein-protein interactions. ScFvs derived from phage display libraries have an additional advantage of being generated against a native antigen, circumventing loss of information on conformational epitopes. In the present study, an attempt has been made to elucidate human chorionic gonadotropin (hCG)-luteinizing hormone (LH) receptor interactions by using a neutral and two inhibitory ScFvs against hCG. The objective was to dock a computationally derived model of these ScFvs onto the crystal structure of hCG and understand the differential roles of the mapped epitopes in hCG-LH receptor interactions. An anti-hCG ScFv, whose epitope was mapped previously using biochemical tools, served as the positive control for assessing the quality of docking analysis. To evaluate the role of specific side chains at the hCG-ScFv interface, binding free energy as well as residue interaction energies of complexes in solution were calculated using molecular mechanics Poisson-Boltzmann/surface area method after performing the molecular dynamic simulations on the selected hCG-ScFv models and validated using biochemical and SPR analysis. The robustness of these calculations was demonstrated by comparing the theoretically determined binding energies with the experimentally obtained kinetic parameters for hCG-ScFv complexes. Superimposition of hCG-ScFv model onto a model of hCG complexed with the 51-266 residues of LH receptor revealed importance of the residues previously thought to be unimportant for hormone binding and response. This analysis provides an alternate tool for understanding the structure-function analysis of ligand-receptor interactions. Proteins 2011;79:3108-3122. (C) 2011 Wiley-Liss, Inc.

Biochemical characterization of a recombinant Swainsona canescens calcium-dependent protein kinase (ScCPK1)

Calcium-dependent protein kinases (CPKs) constitute a unique family of kinases involved in many physiological responses in plants. Biochemical and kinetic properties of a recombinant Swainsona canescens calcium-dependent protein kinase (ScCPK1) were examined in this study. The optimum pH and temperature for activity were pH 7.5 and 37 degrees C, respectively. Substrate phosphorylation activity of ScCPK1 was calmodulin (CaM) independent. Yet CaM antagonists, W7 N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalene sulphonamide] and calmidazolium inhibited the activity with IC50 values of 750 nM and 350 pM, respectively. Both serine and threonine residues were found to be phosphorylated in auto-phosphorylated ScCPK1 and in histone III-S phosphorylated by ScCPK1. The Ca2+] for half maximal activity (K-0.5) was found to be 0.4 mu M for ScCPK1 with histone III-S as substrate. Kinetic analysis showed that Km of ScCPK1 for histone III-S was 4.8 mu M. These data suggest that ScCPK1 is a functional Ser/Thr kinase, regulated by calcium, and may have a role in Ca2+-mediated signaling in S. canescens. (C) 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Simultaneous refolding and purification of recombinant proteins by macro-(affinity ligand) facilitated three-phase partitioning

A strategy called macro-(affinity ligand) facilitated three-phase partitioning (MLFTPP) is described for refolding of a diverse set of recombinant proteins starting from the solubilized inclusion bodies. It essentially consists of: (i) binding of the protein with a suitable smart polymer and (ii) precipitating the polymer-protein complex as an interfacial layer by mixing in a suitable amount of ammonium sulfate and t-butanol. Smart polymers are stimuli-responsive polymers that become insoluble on the application of a suitable stimulus (e.g., a change in the temperature, pH, or concentration of a chemical species such as Ca 2+ or K +). The MLFTPP process required approximately 10min, and the refolded proteins were found to be homogeneous on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The folded proteins were characterized by fluorescence emission spectroscopy, circular dichroism spectroscopy, biological activity, melting temperature, and surface hydrophobicity measurements by 8-anilino-1-naphthalenesulfonate fluorescence. Two refolded antibody fragments were also characterized by measuring K D by Biacore by using immobilized HIV-1 gp120. The data demonstrate that MLFTPP is a rapid and convenient procedure for refolding a variety of proteins from inclusion bodies at high concentration. Although establishing the generic nature of the approach would require wider trials by different groups, its success with the diverse kinds of proteins tried so far appears to be promising.

Purification of a recombinant histidine-tagged lactate dehydrogenase from the malaria parasite, Plasmodium vivax, and characterization of its properties

Lactate dehydrogenase (LDH) of the malaria parasite, Plasmodium vivax (Pv), serves as a drug target and immunodiagnostic marker. The LDH cDNA generated from total RNA of a clinical isolate of the parasite was cloned into pRSETA plasmid. Recombinant his-tagged PvLDH was over-expressed in E. coli Rosetta2DE3pLysS and purified using Ni2+-NTA resin giving a yield of 25-30 mg/litre bacterial culture. The recombinant protein was enzymatically active and its catalytic efficiency for pyruvate was 5.4 x 10(8) min(-1) M-1, 14.5 fold higher than a low yield preparation reported earlier to obtain PvLDH crystal structure. The enzyme activity was inhibited by gossypol and sodium oxamate. The recombinant PvLDH was reactive in lateral flow immunochromatographic assays detecting pan- and vivax-specific LDH. The soluble recombinant PvLDH purified using heterologous expression system can facilitate the generation of vivax LDH-specific monoclonals and the screening of chemical compound libraries for PvLDH inhibitors.

Estudio de tres concentraciones de GA3, dos concentraciones de BAP y las consistencias líquida y semisólida del medio nutritivo en la micropropagación de clones de yuca (Manihot esculenta Crantz)

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Programa Recursos Genéticos Nicaragüenses (REGEN), ubicado en la Universidad Nacional Agraria (UNA). El experimento se evaluó en dos fases, en la primera fase se estudió el comportamiento in vitro de ápices de los clones de yuca (Manihot esculenta Crantz) MCol-22, Okra y Portland cultivados en un medio nutritivo MS (Murashige y Skoog, 1962) con concentraciones de 0.00 mg/1 y 0.040 mg/1 de BAP (6-bencil aminopurina) y concentraciones de 0.05 mg/1 0.10 mgfl y 0.20 mg/1 de GA3 (ácido giberélico). En la segunda fase se evaluó el comportamiento de cuatro clones (C6-1141, MCol-1505, MCol-2215 y MMex-59) en las consistencias de medio nutritivo semisólida y líquida. A través del estudio se determinó que el genotipo es un factor muy importante sobre la respuesta organogénica de los tejidos cultivados in vitro. Sin embargo, es posible definir medios nutritivos para grupos de clones, facilitando así el proceso de micropropagación de especies de importancia económica como la yuca. Los clones que sobresalieron en la primera fase fueron el Portland y MCol- 22. Con respecto al efecto del BAP la concentración 0.04 mg/1 predominó sobre la concentración 0.00 mg/1, para todas las variables evaluadas en el ensayo. Así mismo, la concentración 0.10 mg/1 de GA 3 resultó la más efectiva. Por otra parte, de las consistencias de medios nutritivos evaluados en la segunda fase, se determinó que la consistencia semisólida dió mejor resultado sobre el número de raíces y la consistencia líquida tuvo mayor influencia sobre la variable altura de planta.

Efecto del momento de fertilización, posición de la yema y sustratos en tres clones de quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L) Schott) propagados a través de la técnica de reproducción acelerada de semillas

El presente estudio se realizó con el objetivo de determinar el efecto que ejercen la posición de la yema, el momento de fertilización y sustrato sobre la velocidad de brotación y el crecimiento de las plantas de los genotipos de quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott): Blanco (Bco), Masaya (My) y Nueva Guinea (NG) propagados a través de la técnica de reproducción acelerada de semillas - CRAS, además se pretendió contribuir en la definición de una metodología para la propagación rápida y masiva de plantas a través de esta técnica. Los estudios se llevaron a cabo en canteros con dimensiones de 4.75 m de largo por 1.3 m de ancho, con una capa de 5 cm de hormigón rojo y otra de 15 crn de arena y en bolsas de polietileno para vivero (0.91 kg). Se establecieron tres ensayos bifactoriales siguiendo el arreglo de diseños completos al azar (DCA): posición de la yema (hacia abajo y hacia arriba); momento de fertilización (sin fertilización -testigo-; con fertilizaciones a los 15 dds, 30 dds y 45 dds; a los 30 y 45 dds; y a los O, 15, 30 y 45 dds); y sustratos (arena, humus, suelo; 1:1 humus-suelo; 1:1:2 arena-humus-suelo). Se evaluaron las variables altura de planta (cm), grosor del pseudotallo (cm), número de hojas y área foliar (cm2 . A los datos numéricos de las variables se les realizó un análisis de varianza (ANDEVA). Las yemas colocadas hacia abajo registraron una velocidad de brotación estadísticamente superior (8.15 cm) a la registrada por las yemas colocadas hacia arriba (5.92 cm), independientemente del genotipo. El quequisque Bco, sin importar la posición de la yema, brotó más rápido (8.36 cm) que los otros genotipos; el genotipo My lo hizo más lentamente (5.16 cm). Los genotipos donde se fertilizó a los 30 y 45 dds obtuvieron resultados estadísticamente superiores en todas las variables (Bco 23.21, My 15.23 y NG 22.86 cm de altura). El testigo (sin fertilización) obtuvo los resultados más discretos (Bco 8.71, My 13.83 y NG 14.25 cm de altura). Ningún genotipo prevaleció en todas las variables evaluadas, sin embargo, el genotipo NG registró los resultados más sobresalientes. Las combinaciones más destacadas en las interacciones genotipo - fertilización fueron el clon Bco y NG fertilizadas a los 30 y 45 dds (23.21 y 22.86 cm de altura respectivamente); el testigo y la fertilización aplicada a los O, 15, 30 y 45 dds en combinación con los tres genotipos reportaron los resultados más bajos. Las plantas de los genotipos Bco (27.98 cm de altura) y My (25.65 cm de altura) desarrolladas en humus registraron valores estadísticamente superiores. En los sustratos arena (Bco 9.82 y My 11.59 cm de altura) y suelo (Bco 16.29 y My 3.20 cm de altura) se obtuvieron plantas con los valores más bajos en las variables evaluadas. En las interacciones, el genotipo Blanco reportó los mayores valores (altura 19.5 cm, grosor 1.13 cm y área foliar 122 cm 2 coincidiendo con los dos ensayos anteriores

Caracterización y evaluación de siete clones de pitahaya (Hylocereus spp.) en el Centro Experimental Campos Azules (CECA), Masatepe (Masaya)

La intensificación del cultivo de la Pitahaya (Hylocereus spp.) y la creciente demanda de frutos por el mercado nacional así como la exportación, ha requerido de la búsqueda de nuevas variedades que respondan adecuadamente a las exigencias de los mercados en sabor, color, dulzor, apariencia, y a las expectativas de los productores como la resistencia a plagas y enfermedades. La presente investigación se realizó entre los meses de Junio y Noviembre del año 2003 en el Centro Experimental Campos Azules (CECA); ubicado en el municipio de Masatepe, departamento de Masaya. El objetivo del trabajo es principalmente validar una Guía de Descriptores de Pitahaya. Además de caracterizar morfológicamente cada uno de los siete clones de Pitahaya (Amarilla, Cebra, Lisa, Orejona, Rosa, Sin Espina y San Ignacio) encontradas en el banco de germoplasma del CECA. Se tomaron las muestras bajo un Diseño Completo al Azar (D.C.A.) ya que la plantación estaba establecida y se realizó la caracterización de flores y frutos en el laboratorio del REGEN, exceptuando el levantamiento de datos vegetativos (cladodios) el que se realizó en el campo. Los datos se procesaron mediante análisis de varianzas y desviación estándar (entre y dentro de los clones con la tabla Tukey al 5%) en cuanto a clones, fechas de muestreo e interacción clon * fecha, Análisis de Agrupamiento (AA), Análisis de Componentes Principales (ACP), análisis de correlación y un análisis del empleo de la Guía de Descriptores. El clon Amarilla presentó los más altos valores en el ANDEVA respecto a los cladodios para las variables ancho de cladodio, longitud de espinas y número de espinas, respecto al resto de los clones (7.34 cm, 12.74cm y 6.75 espinas respectivamente), el clon Sin Espina obtuvo el más alto valor en la variable distancia de areola (3.71 cm). El Análisis de Varianza en cuanto a frutos mostró diferencias estadísticas en las variables tamaño de semilla y número de brácteas, correspondientes a los clones Sin Espina y Cebra (49.11s/g y 32.88 brácteas respectivamente); El ANDEVA en cuanto a fechas mostró que en la fecha 4 (Noviembre) se obtuvieron los mejores resultados; reflejando significancia estadística en todas las variables. El análisis de Componentes Principales determinó que el 40.17% de la variación total del germoplasma la aportan los dos primeros CP y las variables que la integran son volumen de fruto, peso de fruto, peso de pulpa, diámetro de fruto, volumen de pulpa, número de pétalos, número de brácteas, color de estigma, ancho y forma de pétalos. El Análisis de Agrupamiento mostró que existen cuatro (4) grupos formados por los clones Amarilla, I; Cebra, Sin Espina y San Ignacio, II; Lisa y Orejona, III y Rosa, IV. El análisis de correlación demuestra que las variables de fruto están íntimamente asociadas.

Micropropagacion de dos clones de caña de azucar (Saccharum sp.) ISA 96-110 e ISA 96-111

El presente estudio se realizó con el objetivo de desarrollar metodología para la micropropagación a partir de ápices caulinares, utilizando la técnica Spinder, y posteriormente aclimatación de las vitroplantas de dos clones de caña de azúcar (Saccharum sp.) (ISA 96-110 e ISA 96- 111). Se estudió el efecto que sobre el establecimiento tendrian 4 variantes del medio de cultivo MS (1962), suplidas con 0.0, 0.2 y 0.6 mg/1 de 6-BAP. Se utilizaron 15 réplicas por tratamiento. Se evaluó el efecto que sobre la brotación tuvieron 4 variantes del medio MS (1962), a las que se les adicionó 0.0, 0.1 y 0.5 mg/1 de 6 BAP durante tres subcultivos sucesivos. Se utilizaron 5 réplicas por variante en estudio. Para inducir el mayor enraizamiento se probaron 4 variantes líquidas del medio MS ( 1962), suplidas con 0.0, 1.0 y 1.6 mg/1 de AlA. Para el estudio de aclimatación se emplearon 30 plantas por cultivar y se establecieron en un sustrato de lombrices Californiana (Eisenia foetida). El clon ISA 96-110 presentó mayor porcentaje de fenolización y menor curvatura que el clon ISA 96-111. El medio de cultivo MS + 0.60 m g/1 de 6-BAP indujo al menor porcentaje de fenolización (33.0) y mayor de curvatura (60.0) en el clon ISA 96-110, el medio MS + 0.20 mg/1 de 6- BAP en el clon ISA 96-111. La sobrevivencia de las plantas del clon ISA- 111 fue de 100 % en todos los medios de cultivo, para el ISA 96-11O sólo los medios MS + 0.20 y MS + 0.00 mg/1 de 6-BAP. No hubo aumento de los valores de las variables altura de la planta, número de brotes y de hojas con el aumento del número de subcultivos. El medio de cultivo que indujo mayor brotación para el clon ISA 96-11 O fue el MS + 0.30 mg/1, mientras que para el clon ISA 96-111 fue el MS + 0.1 mg/1 de 6- BAP. El clon ISA 96-111 reportó resultados superiores en longitud (5.75 cm) y número de raices (7.4) por planta. El medio de cultivo MS + 1.3 mg/1 de AlA indujo los mejores resultados en ambos clones. El comportamiento de las plantas del clon ISA 96-1 11 fueron superiores a las del clon ISA 96-11O al momento de la aclimatación

Caracterización y evaluación preliminar de diez clones de camote (Ipomoea batata L.)

El presente trabajo se refiere a la caracterización y evaluación preliminar de diez clones de camote Ipomea batatas L. para su realización de inicio con la colecta del germoplasma criollo y/o introducción de diferentes regiones del país. Se elaboró una guía preliminar de 46 descriptores para la caracterización de este material. Para su validación se realizaron dos ciclos de siembra, una en la finca Las Mercedes y la otra en las áreas experimentales del programa de Recursos Genéticos Nicaragüense (REGEN), localizadas en EL rodeo km 12 ½ carretera Norte , Managua. Mediante la investigación se eléboro una guía define de 36 descriptores, donde se eliminaron los que no definieron clones de la población estudiada. Se proponen además descriptores que deben tomarse en otros trabajos. Los descriptores se definieron en principales, secundarios e inútiles, de acuerdo a su variación presentada dentro de la población, así como su importancia para la diferenciación de los clones: los descriptores principales se consideran suficientes para realizar un buen trabajo de caracterización. Se presenta un catálogo de los 10 clones estudiados en que se anotan para valores mínimos, máximos, desviación estándar y la media para los descriptores cuantitativos, y la moda para los cualitativos. Para estos últimos se dan los códigos, pudiéndose observar sus estados en la guía de descriptores. Los clones sobresalientes por su rendimiento fueron N-77, N-1383, N1433 y N-178. Se recomienda a los clones N-179, N177 y N1437 para trabajos de investigación con fines forrajeros. Por último se recomienda a los clones de mayor contenido de materia seca para buscar materiales con porcentajes altos de almidón, sobresaliendo en este caso N-1301, N179, N1384 y N-177.