Desenvolvimento de Ophyra albuquerquei Lopes (Diptera, Muscidae) em condições de laboratório

Ophyra albuquerquei may often be a potential predator of Musca domestica Linnaeus, 1758 in poultry and pig houses in southern Brazil. Here we address the developmental period of immatures stages and their viability. To obtain eggs, larvae and pupae, a colony was established in the laboratory. Adult flies were fed on a diet comprising two parts dry milk, two parts sugar and one part fish flour. Larval diet comprised one part fish flour and one part sawdust and water. The eggs, larvae and pupae were incubated at 26º ± 1ºC, 75% ± 10% R.H. and 12 h photoperiod. The egg to adult cycle took 573 h with a total viability of 64%. The shortest of the stages was the egg stage, which lasted about 20 h. The larval stage had the lowest viability (about 82%) and longest time interval (279 h). Overall, the results of this study show that O. albuquerquei can be readily maintained in the laboratory.

Larva, pupa and adult of Aeolus cinctus Candèze (Coleoptera, Elateridae, Agrypninae)

Larva and pupa of Aeolus cinctus Candèze, 1859 are described and adult redescribed. The larvae were collected inside termite nests and reared in laboratory. This is the first description of Aeolus immatures from Neotropical region and the second to the genus. Besides, it is the first record to the genus inside termite nest. The comparison with larva of A. mellilus (Say) is also presented.

Records of Anopheles (Nyssorhynchus) (Diptera, Culicidae) in artificial containers in Ribeirão Preto City, State of São Paulo, Brazil

Thirty immatures of Anopheles darlingi Root, Anopheles argyritarsis Robineau-Desvoidy and Anopheles rondoni (Neiva & Pinto) (were found in an artificial lagoon situated near Pardo River, in Ribeirão Preto City, State of São Paulo, Brazil. The presence of immatures of Anopheles darlingi breeding in a lagoon is suggestive of the potential capacity of that species to adapt and occupy new habitats and to invade urban areas along the species distribution range and also disperse to new localities.

The previously unknown pupa and adult male of Neobezzia fittkaui Wirth & Ratanaworabhan (Diptera, Ceratopogonidae)

The previously unknown pupa and adult male of Neobezzia fittkaui Wirth & Ratanaworabhan (Diptera, Ceratopogonidae). The pupa of Neobezzia fittkaui Wirth & Ratanaworabhan, 1972, collected from a mat of floating fern (Salvinia auriculata Aubl., Salviniaceae) in Ilha da Marchantaria near Manaus, Brazil and the reared adult male are described, photographed and illustrated for the first time. This is the first detailed pupal description for the genus Neobezzia Wirth & Ratanaworabhan.

Biology and management of the masked chafer Cyclocephala distincta Burmeister (Melolonthidae, Dynastinae, Cyclocephalini)

Adults of Cyclocephala distincta are flower visitors of Neotropical palms (Arecaceae) and commonly found in the Atlantic Forest of Pernambuco, Brazil. Males and females were collected in the wild and subjected to captive rearing and breeding. The egg hatching rate, the life cycle, longevity of immatures and adults, and oviposition parameters in captivity were analyzed. The average duration of the life cycle of C. distinctawas 108.2 days (n = 45). The egg stage lasted on average 10.9 days, and the egg-hatching rate was 73.9%. The immature stage lasted on average 93.4 days. The larvae stage exhibited negative phototaxis, and the size of their head capsules increased at a constant rate of 1.6 between instars, following Dyar's rule. The average duration of the first instar was 24.8 days (n = 88), whereas the second and third instars lasted for 17.2 (n = 76) and 40.4 (n = 74) days respectively, and survival rates were 21.6%, 86.4% and 97.4%. The pre-pupal stage was recorded, and pupal chambers were built before pupation. The average number of eggs laid per female was 15.5, the total reproductive period lasted for 3.3 days, and the total fertility was 81.2%. Adults that emerged in captivity exhibited an average longevity of 18.9 days. Adult C. distincta exhibited thanatosis behavior upon manipulation, a strategy observed for the first time in Cyclocephala.

External morphology of immature stages of Zaretis strigosus (Gmelin) and Siderone galanthis catarina Dottax and Pierre comb. nov., with taxonomic notes on Siderone (Lepidoptera: Nymphalidae: Charaxinae)

ABSTRACT The external morphology of immature stages of Zaretis strigosus (Gmelin, [1790]) and Siderone galanthis catarina Dottax and Pierre, 2009 comb. nov. from southern Brazil are described. Additionally, morphology of the adults and sequences of the mitochondrial gene cytochrome oxidase, subunit I, were analyzed in order to evaluate the taxonomy of Siderone galanthis Hübner, [1823]. Immatures were collected on Casearia sylvestris (Salicaceae) in Curitiba, Paraná, and Balneário Barra do Sul, Santa Catarina, Brazil, and reared at the laboratory. Morphological descriptions and illustrations are provided, based on observations through stereoscopic and optic microscopes attached to camera lucida; results are compared and discussed and immature stages of some other species of Charaxinae. The results indicates that the morphology of the immature stages of the studied species differ greatly from other Anaeini, representing a distinct lineage of leafwings butterflies. Morphology and molecular evidence indicate that S. nemesis mexicana Dottax and Pierre, 2009 and S. nemesis catarina Dottax and Pierre, 2009 are conspecific with S. galanthis (Cramer, 1775); additionally, S. thebais C. Felder and R. Felder 1862, S. nemesis var. confluens Staudinger, 1887, S. nemesis f. leonora Bargmann, 1928 and S. nemesis f. exacta Bargmann, 1929 are synonymized with S. galanthis galanthis (Cramer, 1775).

Establishment of models to study mouse and human retinogenesis "in vitro" : isolation and characterization of retinal stem cells

SUMMARY IN FRENCH Les cellules souches sont des cellules indifférenciées capables a) de proliférer, b) de s'auto¬renouveller, c) de produire des cellules différenciées, postmitotiques et fonctionnelles (multipotencialité), et d) de régénérer le tissu après des lésions. Par exemple, les cellules de souches hematopoiétiques, situées dans la moelle osseuse, peuvent s'amplifier, se diviser et produire diverses cellules différenciées au cours de la vie, les cellules souches restant dans la moelle osseuse et consentant leur propriété. Les cellules souches intestinales, situées dans la crypte des microvillosités peuvent également régénérer tout l'intestin au cours de la vie. La rétine se compose de six classes de neurones et d'un type de cellule gliale. Tous ces types de cellules sont produits par un progéniteur rétinien. Le pic de production des photorécepteurs se situe autour des premiers jours postnatals chez la souris. A cette période la rétine contient les cellules hautement prolifératives. Dans cette étude, nous avons voulu analyser le phénotype de ces cellules et leur potentiel en tant que cellules souches ou progénitrices. Nous nous sommes également concentrés sur l'effet de certains facteurs épigéniques sur leur destin cellulaire. Nous avons observé que toutes les cellules prolifératives isolées à partir de neurorétines postnatales de souris expriment le marqueur de glie radiaire RC2, ainsi que des facteurs de transcription habituellement trouvés dans la glie radiaire (Mash1, Pax6), et répondent aux critères des cellules souches : une capacité élevée d'expansion, un état indifférencié, la multipotencialité (démontrée par analyse clonale). Nous avons étudié la différentiation des cellules dans différents milieux de culture. En l'absence de sérum, l'EGF induit l'expression de la β-tubulin-III, un marqueur neuronal, et l'acquisition d'une morphologie neuronale, ceci dans 15% des cellules présentes. Nous avons également analysé la prolifération de cellules. Seulement 20% des cellules incorporent le bromodéoxyuridine (BrdU) qui est un marqueur de division cellulaire. Ceci démontre que l'EGF induit la formation des neurones sans une progression massive du cycle cellulaire. Par ailleurs, une stimulation de 2h d'EGF est suffisante pour induire la différentiation neuronale. Certains des neurones formés sont des cellules ganglionnaires rétiniennes (GR), comme l'indique l'expression de marqueurs de cellules ganglionnaires (Ath5, Brn3b et mélanopsine), et dans de rare cas d'autres neurones rétiniens ont été observés (photorécepteurs (PR) et cellules bipolaires). Nous avons confirmé que les cellules souches rétiniennes tardives n'étaient pas restreintes au cours du temps et qu'elles conservent leur multipotencialité en étant capables de générer des neurones dits précoces (GR) ou tardifs (PR). Nos résultats prouvent que l'EGF est non seulement un facteur contrôlant le développement glial, comme précédemment démontré, mais également un facteur efficace de différentiation pour les neurones rétiniens, du moins in vitro. D'autre part, nous avons voulu établir si l'oeil adulte humain contient des cellules souches rétiniennes (CSRs). L'oeil de certains poissons ou amphibiens continue de croître pendant l'âge adulte du fait de l'activité persistante des cellules souches rétiniennes. Chez les poissons, le CSRs se situe dans la marge ciliaire (CM) à la périphérie de la rétine. Bien que l'oeil des mammifères ne se développe plus pendant la vie d'adulte, plusieurs groupes ont prouvé que l'oeil de mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes également dans la marge ciliaire plus précisément dans l'épithélium pigmenté et non dans la neurorétine. Ces CSRs répondent à certains critères des cellules souches. Nous avons identifié et caractérisé les cellules souches rétiniennes résidant dans l'oeil adulte humain. Nous avons prouvé qu'elles partagent les mêmes propriétés que leurs homologues chez les rongeurs c.-à-d. auto-renouvellement, amplification, et différenciation en neurones rétiniens in vitro et in vivo (démontré par immunocoloration et microarray). D'autre part, ces cellules peuvent être considérablement amplifiées, tout en conservant leur potentiel de cellules souches, comme indiqué par l'analyse de leur profil d'expression génique (microarray). Elles expriment également des gènes communs à diverses cellules souches: nucleostemin, nestin, Brni1, Notch2, ABCG2, c-kit et son ligand, aussi bien que cyclin D3 qui agit en aval de c-kit. Nous avons pu montré que Bmi1et Oct4 sont nécessaires pour la prolifération des CSRs confortant leur propriété de cellules souches. Nos données indiquent que la neurorétine postnatale chez la souris et l'épithélium pigmenté de la marge ciliaire chez l'humain adulte contiennent les cellules souches rétiniennes. En outre, nous avons développé un système qui permet d'amplifier et de cultiver facilement les CSRs. Ce modèle permet de disséquer les mécanismes impliqués lors de la retinogenèse. Par exemple, ce système peut être employé pour l'étude des substances ou des facteurs impliqués, par exemple, dans la survie ou dans la génération des cellules rétiniennes. Il peut également aider à disséquer la fonction de gènes ou les facteurs impliqués dans la restriction ou la spécification du destin cellulaire. En outre, dans les pays occidentaux, la rétinite pigmentaire (RP) touche 1 individu sur 3500 et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) affecte 1 % à 3% de la population âgée de plus de 60 ans. La génération in vitro de cellules rétiniennes est aussi un outil prometteur pour fournir une source illimitée de cellules pour l'étude de transplantation cellulaire pour la rétine. SUMMARY IN ENGLISH Stem cells are defined as undifferentiated cells capable of a) proliferation, b) self maintenance (self-renewability), c) production of many differentiated functional postmitotic cells (multipotency), and d) regenerating tissue after injury. For instance, hematopoietic stem cells, located in bone marrow, can expand, divide and generate differentiated cells into the diverse lineages throughout life, the stem cells conserving their status. In the villi crypt, the intestinal stem cells are also able to regenerate the intestine during their life time. The retina is composed of six classes of neurons and one glial cell. All these cell types are produced by the retinal progenitor cell. The peak of photoreceptor production is reached around the first postnatal days in rodents. Thus, at this stage the retina contains highly proliferative cells. In our research, we analyzed the phenotype of these cells and their potential as possible progenitor or stem cells. We also focused on the effect of epigenic factor(s) and cell fate determination. All the proliferating cells isolated from mice postnatal neuroretina harbored the radial glia marker RC2, expressed transcription factors usually found in radial glia (Mash 1, Pax6), and met the criteria of stem cells: high capacity of expansion, maintenance of an undifferentiated state, and multipotency demonstrated by clonal analysis. We analyzed the differentiation seven days after the transfer of the cells in different culture media. In the absence of serum, EGF led to the expression of the neuronal marker β-tubulin-III, and the acquisition of neuronal morphology in 15% of the cells. Analysis of cell proliferation by bromodeoxyuridine incorporation revealed that EGF mainly induced the formation of neurons without stimulating massively cell cycle progression. Moreover, a pulse of 2h EGF stimulation was sufficient to induce neuronal differentiation. Some neurons were committed to the retinal ganglion cell (RGC) phenotype, as revealed by the expression of retinal ganglion markers (Ath5, Brn3b and melanopsin), and in few cases to other retinal phenotypes (photoreceptors (PRs) and bipolar cells). We confirmed that the late RSCs were not restricted over-time and conserved multipotentcy characteristics by generating retinal phenotypes that usually appear at early (RGC) or late (PRs) developmental stages. Our results show that EGF is not only a factor controlling glial development, as previously shown, but also a potent differentiation factor for retinal neurons, at least in vitro. On the other hand, we wanted to find out if the adult human eye contains retina stem cells. The eye of some fishes and amphibians continues to grow during adulthood due to the persistent activity of retinal stem cells (RSCs). In fish, the RSCs are located in the ciliary margin zone (CMZ) at the periphery of the retina. Although, the adult mammalian eye does not grow during adult life, several groups have shown that the adult mouse eye contains retinal stem cells in the homologous zone (i.e. the ciliary margin), in the pigmented epithelium and not in the neuroretina. These RSCs meet some criteria of stem cells. We identified and characterized the human retinal stem cells. We showed that they posses the same features as their rodent counterpart i.e. they self-renew, expand and differentiate into retinal neurons in vitro and in vivo (indicated by immunostaining and microarray analysis). Moreover, they can be greatly expanded while conserving their sternness potential as revealed by the gene expression profile analysis (microarray approach). They also expressed genes common to various stem cells: nucleostemin, nestin, Bmil , Notch2, ABCG2, c-kit and its ligand, as well as cyclin D3 which acts downstream of c-kit. Furthermore, Bmil and Oct-4 were required for RSC proliferation reinforcing their stem cell identity. Our data indicate that the mice postnatal neuroretina and the adult pigmented epithelium of adult human ciliary margin contain retinal stem cells. We developed a system to easily expand and culture RSCs that can be used to investigate the retinogenesis. For example, it can help to screen drugs or factors involved, for instance, in the survival or generation of retinal cells. This could help to dissect genes or factors involved in the restriction or specification of retinal cell fate. In Western countries, retinitis pigmentosa (RP) affects 1 out of 3'500 individuals and age-related macula degeneration (AMD) strikes 1 % to 3% of the population over 60. In vitro generation of retinal cells is thus a promising tool to provide an unlimited cell source for cellular transplantation studies in the retina.

New insights into the role of microRNAs in pancreatic ß-cell maturation and plasticity

Le diabète est une maladie chronique caractérisée par une élévation du taux de sucre dans le sang aussi appelé « glycémie » reflétant un état pathologique. L'élévation de la glycémie au long cours a des répercussions délétères sur nombreux de nos tissus et organes d'où l'apparition de complications sévères chez les sujets diabétiques pouvant atteindre les yeux, les reins, le système nerveux, le système cardiovasculaire et les membres inférieurs. La carence en une hormone essentielle à notre organisme, l'insuline, est au coeur du développement de la maladie. L'insuline induit la captation du glucose circulant dans le sang en excès suite à une prise alimentaire riche en glucides et favorise son utilisation et éventuellement son stockage dans les tissus tels que le foie, le tissu adipeux et les muscles. Ainsi, l'insuline est vitale pour réguler et maintenir stable notre niveau de glycémie. Les cellules bêta du pancréas sont les seules entités de notre corps capables de produire de l'insuline et une perte de fonctionnalité associée à leur destruction ont été mises en cause dans le processus pathologique du diabète de type 2. Cependant la pleine fonctionnalité et la maturation des cellules bêta n'apparaissent qu'après la naissance lorsque le pancréas en développement a atteint sa masse adulte définitive. Enfin, une fois la masse des cellules bêta définitive établie, leur nombre et volume restent relativement constants au cours de la vie adulte chez un sujet sain. Néanmoins, au cours de périodes critiques les besoins en insuline sont augmentés tel qu'observé chez les femmes enceintes et les personnes obèses qui ont une perte de sensibilité à l'insuline qui se traduit par la nécessité de sécréter plus d'insuline afin de maintenir une glycémie normale. Dans l'hypothèse où la compensation n'a pas lieu ou n'est pas aboutie, le diabète se développe. Le processus de maturation postnatale ainsi que les événements compensatoires sont donc des étapes essentielles et de nombreuses questions sont encore non résolues concernant l'identification des mécanismes les régulant. Parmi les acteurs potentiels figurent de petites molécules d'ARN découvertes récemment appelées microARNs et qui ont été rapidement suggérées très prometteuses dans l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre du diabète et d'autres pathologies. Les microARNs vont réguler l'expression de notre génome sans en modifier la séquence, phénomène également appelé épigénétique, ce qui résulte en des différences de comportement et de fonction cellulaires. Les microARNs sont donc susceptibles de jouer un rôle clé dans l'ensemble des processus biologiques et notre environnement associé à nos prédispositions génétiques peuvent grandement modifier leur niveau et donc leur action, qui à son tour se répercutera sur notre état physiologique. En effet nous avons identifié des changements de microARNs dans les cellules d'îlots pancréatiques de modèles animaux (rats et souris) associés à un état de résistance à l'insuline (grossesse et obésité). Par le biais d'expériences in vitro sur des cellules bêta extraites de rats et conservées en culture, nous avons pu analyser de plus près l'implication des microARNs dans la capacité des cellules bêta à sécréter de l'insuline mais aussi à se multiplier et à survivre au sein d'un environnement toxique. Ainsi, nous avons identifié des microARNs qui participent positivement à la compensation des cellules bêta, sous la direction d'hormones telles les estrogènes ou d'une hormone libérée par l'intestin au cours de la digestion (l'inerétine GLP1) et qui est largement utilisée comme agent thérapeutique dans la médication contre le diabète. Dans un second temps nous avons utilisé une stratégie similaire afin de déterminer le rôle de microARNs préalablement détectés comme étant changés au cours du développement postnatal des cellules bêta chez le rat. Cette étude a également mené à l'identification de microARNs participant à la maturation et à l'expansion de la masse des cellules bêta sous l'influence de la composition du régime alimentaire et des besoins en insuline adéquats qui en dépendent. Ces études apportent la vision de nouveaux mécanismes moléculaires impliquant les microARNs et démontrant leur importance pour le bon fonctionnement des cellules bêta et leur capacité d'adaptation à l'environnement. -- Les cellules bêta sont une composante des îlots pancréatiques de Langerhans et sont des cellules hautement différenciées qui ont l'unique capacité de sécréter de l'insuline sous l'influence des nutriments suite à une prise alimentaire. L'insuline facilite l'incorporation de glucose dans ses tissus cibles tels le foie, le tissu adipeux et les muscles. Bien que les besoins en insuline soient relativement constants au cours de la vie d'un individu sain, certaines conditions associées à un état de résistance à l'insuline, telles la grossesse ou l'obésité, requièrent une libération d'insuline majorée. En cas de résistance à l'insuline, une dysfonction des cellules bêta plus ou moins associée à leur mort cellulaire, conduisent à une sécrétion d'insuline insuffisante et au développement d'une hyperglycémie chronique, caractéristique du diabète de type 2. Jusqu'à présent, les mécanismes moléculaires sous- jacents à la compensation des cellules bêta ou encore menant à leur dysfonction restent peu connus. Découverts récemment, les petits ARNs non-codant appelés microARNs (miARNs), suscitent un intérêt grandissant de par leur potentiel thérapeutique pour la prise en charge et le traitement du diabète. Les miARNs sont de puissants régulateurs de l'expression génique qui lient directement le 3'UTR de leurs ARN messagers cibles afin d'inhiber leur traduction ou d'induire leur dégradation, ce qui leur permet de contrôler des fonctions biologiques multiples. Ainsi, nous avons pris pour hypothèse que les miARNs pourraient jouer un rôle essentiel en maintenant la fonction des cellules bêta et des processus compensatoires afin de prévenir le développement du diabète. Lors d'une première étude, une analyse transcriptomique a permis l'identification de miARNs différemment exprimés au sein d'îlots pancréatiques de rattes gestantes. Parmi eux, le miR-338-3p a démontré la capacité de promouvoir la prolifération et la survie des cellules bêta exposées à des acides gras saturés et des cytokines pro-inflammatoires, sans altérer leur propriété sécrétrice d'insuline. Nous avons également identifié deux hormones reconnues pour leurs propriétés bénéfiques pour la physiologie de la cellule bêta, l'estradiol et l'incrétine GLP1, qui régulent les niveaux du miR-338-3p. Ce miARN intègre parfaitement les voies de signalisation de ces deux hormones dépendantes de l'AMP cyclique, afin de contrôler l'expression de nombreux gènes conduisant à son action biologique. Dans un projet ultérieur, notre objectif était de déterminer la contribution de miARNs dans l'acquisition de l'identité fonctionnelle des cellules bêta en période postnatale. En effet, directement après la naissance les cellules bêta sont reconnues pour être encore immatures et incapables de sécréter de l'insuline spécifiquement en réponse à l'élévation de la glycémie. Au contraire, la réponse insulinique induite par les acides aminés ainsi que la biosynthèse d'insuline sont déjà fonctionnelles. Nos recherches ont permis de montrer que les changements de miARNs corrélés avec l'apparition du phénotype sécrétoire en réponse au glucose, sont régis par la composition nutritionnelle du régime alimentaire et des besoins en insuline qui en découlent. En parallèle, le taux de prolifération des cellules bêta est considérablement réduit. Les miARNs que nous avons étudiés coordonnent des changements d'expression de gènes clés impliqués dans l'acquisition de propriétés vitales de la cellule bêta et dans la maintenancé de son identité propre. Enfin, ces études ont permis de clairement démontrer l'importance des miARNs dans la régulation de la fonction des cellules bêta pancréatiques. -- Beta-cells are highly differentiated cells localized in the pancreatic islets and are characterized by the unique property of secreting insulin in response to nutrient stimulation after meal intake. Insulin is then in charge of facilitating glucose uptake by insulin target tissues such as liver, adipose tissue and muscles. Despite insulin needs stay more or less constant throughout life of healthy individuals, there are circumstances such as during pregnancy or obesity which are associated to insulin resistance, where insulin needs are increased. In this context, defects in beta-cell function, sometimes associated with beta-cell loss, may result in the release of inappropriate amounts of insulin leading to chronic hyperglycemia, properly defined as type 2 diabetes mellitus. So far, the mechanisms underlying beta- cell compensation as well as beta-cell failure remain to be established. The recently discovered small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) are emerging as interesting therapeutic targets and are bringing new hope for the treatment of diabetes. miRNAs display a massive potential in regulating gene expression by directly binding to the 3'UTR of messenger RNAs and by inhibiting their translation and/or stability, enabling them to modify a wide range of biological functions. In view of this, we hypothesized that miRNAs may play an essential role in preserving the functional beta-cell mass and permitting to fight against beta-cell exhaustion and decompensation that can lead to diabetes development. In a first study, global profiling in pancreatic islets of pregnant rats, a model of insulin resistance, led to the identification of a set of differentially expressed miRNAs. Among them, miR-338- 3p was found to promote beta-cell proliferation and survival upon exposure of islet cells to pro- apoptotic stimuli such as saturated fatty acids or pro-inflammatory cytokines, without impairment in their capacity to release insulin. We also discovered that miR-338-3p changes are driven by two hormones, the estradiol and the incretin GLP1, both well known for their beneficial impact on beta- cell physiology. Consistently, we found that miR-338-3p integrates the cAMP-dependent signaling pathways regulated by these two hormones in order to control the expression of numerous genes and execute its biological functions. In a second project, we aimed at determining whether miRNAs contribute to the acquisition of beta-cell identity. Indeed, we confirmed that right after birth beta-cells are still immature and are unable to secrete insulin specifically in response to elevated concentrations of glucose. In contrast, amino acid-stimulated insulin release as well as insulin biosynthesis are already fully functional. In parallel, newborn beta-cells are proliferating intensively within the expanding pancreas. Interestingly, we demonstrated that the miRNA changes and the subsequent acquisition of glucose responsiveness is influenced by the diet composition and the resulting insulin needs. At the same time, beta-cell proliferation declines. The miRNAs that we have identified orchestrate expression changes of essential genes involved in the acquisition of specific beta-cell properties and in the maintenance of a mature beta-cell identity. Altogether, these studies clearly demonstrate that miRNAs play important roles in the regulation of beta-cell function.

Age and growth of leaping grey mullet (Liza saliens (Risso, 1810)) in Minorca (Balearic Islands)

A population of leaping grey mullet (Liza saliens (Risso, 1810) was studied in order to measure seasonal and annual growth rates. The annual growth rates were similar to those reported for other populations from the central Western Mediterranean and intermediate between those living in northern and southern areas. As usual, the growth rate of adult males was slower than that of females. Males reached adulthood in their third summer. Females of the same age showed a moderate gonadal development, but did not ripen until the next summer. Mullets of all ages gained weight only when the water temperature was higher than 20°C. However adults and immature fish showed reduced growth in mid-summer, when that of the juveniles peaked. This difference is not a consequence of the reproductive cost, because the growth rate of immatures was greatly reduced although they did not spawn.

The role of the transcription factor Tcf-1 for the development and the function of NK cells

Natural Killer (NK) cells are innate immune cells that can eliminate malignant and foreign cells and that play an important role for the early control of viral and fungal infections. Further, they are important regulators of the adaptive and innate immune responses. During their development in the bone marrow (BM) NK cells undergo several maturation steps that directly establish an effector program. The transcriptional network that controls NK cell development and maturation is still incompletely understood. Based on earlier findings that NK cell numbers are reduced in the absence of the transcription factor T cell factor-1 (Tcf-1), my thesis has addressed the precise role of this transcription factor for NK cell development, maturation and function and whether Tcf-1 acts as a nuclear effector of the canonical Wnt signaling pathway to mediate its effects. It is shown that Tcf-1 is selectively required for the emergence of mature BM NK cells. Surprisingly, the emergence of BM NK cells depends on the repressor function of Tcf-1 and is independent of the Wnt pathway. In BM and peripheral NK cells Tcf-1 is found to suppress Granzyme B (GzmB) expression, a key cytotoxic effector molecule required to kill target cells. We provide evidence that GzmB over-expression in the absence of Tcf-1 results in accelerated spontaneous death of bone marrow NK cells and of cytokine stimulated peripheral NK cells. Moreover, Tcf-1 deficient NK cells show reduced target cell killing, which is due to enhanced GzmB-dependent NK cell death induced by the recognition of tumour target cells. Collectively, these data provide significant new insights into the transcriptional regulation of NK cell development and function and suggest a novel mechanism that protects NK cells from the deleterious effects of highly cytotoxic effector molecules. - Les cellules NK (de l'anglais Natural Killer) font partie du système immunitaire inné et sont capables d'éliminer à elles seules les cellules cancéreuses ou infectées. Ces cellules participent dans la régulation et la coordination des réponses innée et adaptative. Lors de leur développement dans la moelle osseuse, les cellules NK vont acquérir leurs fonctions effectrices, un processus contrôlé par des facteurs de transcription mais encore peu connu. Des précédentes travaux ont montré qu'une diminution du nombre de cellules NK corrélait avec l'absence du facteur de transcription Tcf-1 (T cell factor-1), suggérant un rôle important de Tcf-1 dans le développement de cellules NK. Cette thèse a pour but de mieux comprendre le rôle du facteur de transcription Tcf-1 lors du développement et la maturation des cellules NK, ainsi que son interaction avec la voie de signalisation Wnt. Nous avons montré que Tcf-1 est essentiel pour la transition des cellules immatures NK (iNK) à des cellules matures NK (mNK) dans la moelle osseuse, et cela de manière indépendamment de la voie de signalisation Wnt. De manière intéressante, nous avons observé qu'en absence du facteur de transcription Tcf-1, les cellules NK augmentaient l'expression de la protéine Granzyme B (GzmB), une protéine essentielle pour l'élimination des cellules cancéreuses ou infectées. Ceci a pour conséquence, une augmentation de la mort des cellules mNK dans la moelle osseuse ainsi qu'une diminution de leur fonction «tueuses». Ces résultats montrent pour la première fois, le rôle répresseur du facteur de transcription Tcf-1 dans l'expression de la protéine GzmB. L'ensemble de ces résultats apporte de nouveaux éléments concernant le rôle de Tcf-1 dans la régulation du développement et de la fonction des cellules NK et suggèrent un nouveau mécanisme cellulaire de protection contre les effets délétères d'une dérégulation de l'expression des molécules cytotoxique.

VEGF is a mediator of retinal pigment epithelium permeability leading to photoreceptor cell death in light-induced retinal degeneration : gene therapy strategy to prevent AMD-disorders

ABSTRACTIn normal tissues, a balance between pro- and anti-angiogenic factors tightly controls angiogenesis. Alterations of this balance may have pathological consequences. For instance, concerning the retina, the vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent pro-angiogenic factor, and has been identified has a key player during ocular neovascularization implicated in a variety of retinal diseases. In the exudative form (wet-form) of age-related macular degeneration (AMD), neovascularizations occurring from the choroidal vessels are responsible for a quick and dramatic loss of visual acuity. In diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity, sprouting from the retinal vessels leads to vision loss. Furthermore, the aging of the population, the increased- prevalence of diabetes and the better survival rate of premature infants will lead to an increasing rate of these conditions. In this way, anti-VEGF strategy represents an important therapeutic target to treat ocular neovascular disorders.In addition, the administration of Pigmented Epithelial growth factor, a neurotrophic and an anti- angiogenic factor, prevents photoreceptor cell death in a model of retinal degeneration induced by light. Previous results analyzing end point morphology reveal that the light damage (LD) model is used to mimic retinal degenerations arising from environmental insult, as well as aging and genetic disease such as advanced atrophic AMD. Moreover, light has been identified as a co-factor in a number of retinal diseases, speeding up the degeneration process. This protecting effect of PEDF in the LD retina raises the possibility of involvement of the balance between pro- and anti-angiogenic factors not only for angiogenesis, but also in cell survival and maintenance.The aim of the work presented here was to evaluate the importance of this balance in neurodegenerative processes. To this aim, a model of light-induced retinal degeneration was used and characterized, mainly focusing on factors simultaneously controlling neuron survival and angiogenesis, such as PEDF and VEGF.In most species, prolonged intense light exposure can lead to photoreceptor cell damage that can progress to cell death and vision loss. A protocol previously described to induce retinal degeneration in Balb/c mice was used. Retinas were characterized at different time points after light injury through several methods at the functional and molecular levels. Data obtained confirmed that toxic level of light induce PR cell death. Variations were observed in VEGF pathway players in both the neural retina and the eye-cup containing the retinal pigment epithelium (RPE), suggesting a flux of VEGF from the RPE towards the neuroretina. Concomitantly, the integrity of the outer blood-retinal-barrier (BRB) was altered, leading to extravascular albumin leakage from the choroid throughout the photoreceptor layer.To evaluate the importance of VEGF during light-induced retinal degeneration process, a lentiviral vector encoding the cDNA of a single chain antibody directed against all VEGF-A isoforms was developed (LV-V65). The bioactivity of this vector to block VEGF was validated in a mouse model of laser-induced choroidal neovascularization mediated by VEGF upregulation. The vector was then used in the LD model. The administration of the LV-V65 contributed to the maintenance of functional photoreceptors, which was assessed by ERG recording, visual acuity measurement and histological analyses. At the RPE level, the BRB integrity was preserved as shown by the absence of albumin leakage and the maintenance of RPE cell cohesion.These results taken together indicate that the VEGF is a mediator of light induced PR degeneration process and confirm the crucial role of the balance between pro- and anti-angiogenic factors in the PR cell survival. This work also highlights the prime importance of BRB integrity and functional coupling between RPE and PR cells to maintain the PR survival. VEGF dysregulation was already shown to be involved in wet AMD forms and our study suggests that VEGF dysregulation may also occur at early stages of AMD and could thus be a potential therapeutic target for several RPE related diseases.RESUMEDans les différents tissues de l'organisme, l'angiogenèse est strictement contrôlée par une balance entre les facteurs pro- et anti-angiogéniques. Des modifications survenant dans cette balance peuvent engendrer des conséquences pathologiques. Par exemple, concernant la rétine, le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) est un facteur pro-angiogénique important. Ce facteur a été identifié comme un acteur majeur dans les néovascularisations oculaires et les processus pathologiques angiogéniques survenant dans l'oeil et responsables d'une grande variété de maladies rétiniennes. Dans la forme humide de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), la néovascularisation choroïdienne est responsable de la perte rapide et brutale de l'acuité visuelle chez les patients affectés. Dans la rétinopathie diabétique et celle lié à la prématurité, l'émergence de néovaisseaux rétiniens est la cause de la perte de la vision. Les néovascularisations oculaires représentent la principale cause de cécité dans les pays développés. De plus, l'âge croissant de la population, la progression de la prévalence du diabète et la meilleure survie des enfants prématurés mèneront sans doute à l'augmentation de ces pathologies dans les années futures. Dans ces conditions, les thérapies anti- angiogéniques visant à inhiber le VEGF représentent une importante cible thérapeutique pour le traitement de ces pathologies.Plusieurs facteurs anti-angiogéniques ont été identifiés. Parmi eux, le facteur de l'épithélium pigmentaire (PEDF) est à la fois un facteur neuro-trophique et anti-angiogénique, et l'administration de ce facteur au niveau de la rétine dans un modèle de dégénérescence rétinienne induite par la lumière protège les photorécepteurs de la mort cellulaire. Des études antérieures basées sur l'analyse morphologique ont révélé que les modifications survenant lors de la dégénération induite suite à l'exposition à des doses toxiques de lumière représente un remarquable modèle pour l'étude des dégénérations rétiniennes suite à des lésions environnementales, à l'âge ou encore aux maladies génétiques telle que la forme atrophique avancée de la DMLA. De plus, la lumière a été identifiée comme un co-facteur impliqué dans un grand nombre de maladies rétiniennes, accélérant le processus de dégénération. L'effet protecteur du PEDF dans les rétines lésées suite à l'exposition de des doses toxiques de lumière suscite la possibilité que la balance entre les facteurs pro- et anti-angiogéniques soit impliquée non seulement dans les processus angiogéniques, mais également dans le maintient et la survie des cellules.Le but de ce projet consiste donc à évaluer l'implication de cette balance lors des processus neurodégénératifs. Pour cela, un modèle de dégénération induite par la lumière à été utilisé et caractérisé, avec un intérêt particulier pour les facteurs comme le PEDF et le VEGF contrôlant simultanément la survie des neurones et l'angiogenèse.Dans la plupart des espèces, l'exposition prolongée à une lumière intense peut provoquer des dommages au niveau des cellules photoréceptrices de l'oeil, qui peut mener à leur mort, et par conséquent à la perte de la vision. Un protocole préalablement décrit a été utilisé pour induire la dégénération rétinienne dans les souris albinos Balb/c. Les rétines ont été analysées à différents moments après la lésion par différentes techniques, aussi bien au niveau moléculaire que fonctionnel. Les résultats obtenus ont confirmé que des doses toxiques de lumière induisent la mort des photorécepteurs, mais altèrent également la voie de signalisation du VEGF, aussi bien dans la neuro-rétine que dans le reste de l'oeil, contenant l'épithélium pigmentaire (EP), et suggérant un flux de VEGF provenant de ΙΈΡ en direction de la neuro-rétine. Simultanément, il se produit une altération de l'intégrité de la barrière hémato-rétinienne externe, menant à la fuite de protéine telle que l'albumine, provenant de la choroïde et retrouvée dans les compartiments extravasculaires de la rétine, telle que dans la couche des photorécepteurs.Pour déterminer l'importance et le rôle du VEGF, un vecteur lentiviral codant pour un anticorps neutralisant dirigée contre tous les isoformes du VEGF a été développé (LV-V65). La bio-activité de ce vecteur a été testé et validée dans un modèle de laser, connu pour induire des néovascularisations choroïdiennes chez la souris suite à l'augmentation du VEGF. Ce vecteur a ensuite été utilisé dans le modèle de dégénération induite par la lumière. Les résultats des électrorétinogrammes, les mesures de l'acuité visuelle et les analyses histologiques ont montré que l'injection du LV-V65 contribue à la maintenance de photorécepteurs fonctionnels. Au niveau de l'EP, l'absence d'albumine et la maintenance des jonctions cellulaires des cellules de l'EP ont démontré que l'intégrité de la barrière hémato-rétinienne externe est préservée suite au traitement.Par conséquent, tous les résultats obtenus indiquent que le VEGF est un médiateur important impliquée dans le processus de dégénération induit par la lumière et confirme le rôle cruciale de la balance entre les facteurs pro- et anti-angiogéniques dans la survie des photorécepteurs. Cette étude révèle également l'importance de l'intégrité de la barrière hémato-rétinienne et l'importance du lien fonctionnel et structurel entre l'EP et les photorécepteurs, essentiel pour la survie de ces derniers. Par ailleurs, Cette étude suggère que des dérèglements au niveau de l'équilibre du VEGF ne sont pas seulement impliqués dans la forme humide de la DMLA, comme déjà démontré dans des études antérieures, mais pourraient également contribuer et survenir dans des formes précoces de la DMLA, et par conséquent le VEGF représente une cible thérapeutique potentielle pour les maladies associées à des anomalies au niveau de l'EP.

Role of notch signalling in mammary gland

ÁBSTRACT : Mammary gland is composed of two main epithelial cell types, myoepithelial and luminal. The mechanisms involved in determination and maintenance of them remain poorly understood. Notch signaling is known to regulate cell fate determination in other tissues like skin and nervous system. It was also shown that it can act as tumor suppressor or oncogene depending on the tissue type. The mouse models overexpressing active Notch receptors indicated that Notch signaling is oncogenic in the mammary gland. This observation was followed by some descriptive and functional studies in human breast cancer and it was reported that Notch signaling activity or expression of its components are increased in some of the breast tumor samples compared to normal tissue. However, the physiological role of the Notch signaling and its downstream mechanisms in mammary gland is poorly defined. p63, a member of p53 family, has been implicated in the cell fate determination of keratinocytes. Knockout mouse models revealed that p63 is required for the formation of the mammary anlagen in embryo and its ΔN isoform is expressed exclusively in the myoepithelial layer of the adult breast. In order to understand its function in normal breast epithelial cells, I activated Notch signaling by expression of Notch1 intracellular domain (NICD) in normal primary human breast epithelial cells (HBECs). In this context, NICD reduced growth of HBECs and led to downmodulation of extracellular matrix-receptor interaction network (ECM) components as well as ΔNp63. Expression of ΔNp63 together with NICD partially rescued Notch induced growth reduction, which was correlated with an increase in ECM components. Moreover, silencing ΔNp63 in myoepithelial HBECs reduced growth similar to Notch activation and it led to downregulation of myoepithelial and upregulation of luminal markers. Complementing this observation, forced expression of ONp63 in luminal HBECs induced myoepithelial phenotype and decreased luminal markers. In vivo, by the analysis of a Notch reporter mouse strain, I showed that Notch is activated during puberty specifically at the sites of ductal morphogenesis, terminal end buds. FAGS analysis revealed that it can be detected in two different populations based on CD24 expression (low (lo) or high (high)): at lower levels in CD24lo, which includes stem/progenitor and myoepithelial cells and higher levels in CD24hi, which contains luminal cells. In parallel with in vitro results, the CD24lo mouse mammary epithelial cells displaying Notch activity have lower levels of p63 expression. Furthermore, deletion of RBPjk, the main mediator of Notch signaling, or the overexpression of ΔNp63 inhibited luminal cell lineage in vivo. Another important point revealed by Notch reporter mouse strain is the simultaneous activation of Notch with estrogen signaling during pubertal development. The expression of FOXA1, the mediator of estrogen receptor (ER) transcriptional activity, is correlated with Notch activation in vivo that it is lower in CD24lo than in CD24hi cells. Moreover, FOXA1 is regulated by NICD in vitro supporting the presence of a link between Notch and ER signaling. Taken together, I report that Notch signaling is involved in luminal cell fate determination and its effects are partially mediated through inhibition of ONp63. Besides, ΔNp63 is required for the maintenance and sufficient for the induction of myoepithelial phenotype in HBECs in vitro and is not compatible with luminal lineage in vivo. Based on these results, I propose a model for epithelial cell hierarchy in mammary gland, whereby there are two different types of luminal progenitors, early and late, displaying different levels of Notch activity. Notch signaling contributes to the determination of luminal cell lineage in these two progenitor steps: In "Early Luminal Progenitor" stage, it inhibits myoepithelial fate by decreasing p63 expression, and in "Late Luminal Progenitor" stage, Notch signaling is involved in induction of luminal lineage by acting on ER-FOXA1 axis. It has to be investigated further whether Notch signaling might behave as an oncogene or tumor suppressor depending on which cell type in the epithelial hierarchy it is modulated and which one is more likely to occur in different human breast cancer types. RÉSUMÉ : La glande mammaire est composée de deux types principaux de cellules: les cellules luminales, qui bordent le lumen et les cellules myoépithéliales, qui se trouvent entre la lame basale et les cellules luminales. Les mécanismes intervenant dans leur différenciation et leur maintenance demeurent encore mal compris. La protéine transmembranaire Notch est connue pour déterminer le destin des cellules dans plusieurs types de tissus comme la peau ou le système nerveux. Selon le type de tissu dans lequel se trouve Notch, il agira soit comme un suppresseur de tumeur soit comme un oncogène. A l'aide de modèles de souris surexprimant les récepteurs actifs de Notch, il a été démontré que la voie de signalisation de Notch est oncogénique au niveau de la glande mammaire. Des études descriptives et fonctionnelles dans le cadre du cancer du sein ont permis de mettre en évidence une augmentation de l'activité de Notch ou de l'expression de ces composants dans certains tissus cancéreux. Toutefois, le rôle physiologique de Notch et des mécanismes qu'il active restent méconnus. P63, une protéine membre de la famille p53, est impliquée dans la différenciation des kératinocytes. Le modèle issu de l'étude des souris p63 knockout a révélé que cette protéine est requise pour la formation des primordia mammaires chez l'embryon et que son isoforme ΔNp63 est exclusivement exprimée dans la couche myoépithéliale de la glande mammaire adulte. Dans le but de comprendre les fonctions physiologiques de Notch, je l'ai activé en exprimant le domaine intracellulaire de Notch 1 (NICD) dans des cellules épithéliales primaires de glande mammaire humaine (HBECs). Le NICD a alors réduit la croissance des HBECs et conduit à la régulation négative non seulement de p63 mais également des composants du réseau d'interaction des récepteurs de la matrice extracellulaire (ECM). En exprimant conjointement ΔNp63 et NICD, il est apparu que la réduction de croissance induite par Notch était partiellement compensée, et qu'il y avait également une augmentation des composants ECM. De plus, lorsque ΔNp63 a été inactivé dans les cellules HBECs myoépithéliales, une réduction de croissance cellulaire identique à celle provoquée par l'activation de Notch a pu être mise en évidence, de même qu'une régulation négative des marqueurs myoépithéliaux ainsi qu'une augmentation des marqueurs luminaux. Afin de compléter ces informations, l'expression de ΔNp63 a été forcée dans les HBECs luminales, ce qui a induit un phénotype myoépithélial et une diminution des marqueurs lumineux. In vivo, par l'analyse de souris ayant un gène rapporteur de l'activité de Notch, j'ai démontré que Notch est activé pendant la puberté au niveau des sites de la morphogenèse canalaire, à savoir les bourgeons terminaux. Les analyses par FACS (Fluorescence-activated cell sorting) basées sur l'expression de l'antigène CD24 ont révélé qu'il peut tre détecté dans deux populations différentes : une population qui l'exprime faiblement, qui regroupe les cellules souches/progéniteurs et les cellules myoépithéliales, et une population qui l'exprime fortement qui est composé des cellules luminales. Parallèlement aux résultats in vitro, j'ai mis en évidence un faible niveau d'expression de p63 dans les cellules épithéliales de la glande mammaire de souris, exprimant faiblement l'antigène CD24 et présentant une activité de Notch. De plus, la délétion de RBPjr~, médiateur principal de la signalisation de Notch, ainsi que la surexpression de ΔNp63 in vivo ont inhibé la lignée des cellules luminales. Un autre point important révélé par les souris rapporteur de l'activité de Notch a été l'activation simultanée de Notch et de la signalisation de l'oestrogène pendant le développement pubertaire. L'expression de FOXA1, médiateur de l'activité transcriptionnelle des récepteurs aux oestrogènes (ER), est en corrélation avec l'activation de Notch in vivo, plus basse dans les cellules avec une faible expression de l'antigène CD24 que dans celles avec une forte expression. De plus, FOXA1 est régulé par NICD in vitro confirmant la présence d'un lien entre Notch et la signalisation des ER. En résumé, la signalisation de Notch est impliquée dans la détermination du destin cellulaire des cellules luminales et ses effets sont partiellement modifiés par l'inhibition de ΔNp63. ΔNp63 est requis pour la maintenance et est suffisant pour l'induction du phénotype myoépithéliale dans les HBECs in vitro et ne peut donc pas se trouver dans les cellules luminales in vivo. Basé sur ces résultats, je propose un modèle de hiérarchisation des cellules épithéliales de la glande mammaire, dans lequel sont présents deux types de progéniteurs des cellules luminales exprimant des niveaux différents d'activité de Notch, les progéniteurs lumineux précoces et tardifs. La signalisation de Notch contribue à la différenciation de la lignée cellulaire luminale au niveau de ces deux progéniteurs : dans la forme précoce, il inhibe la différenciation des cellules myoépithéliales en réduisant l'expression de p63 et dans la forme tardive, Notch est impliqué dans l'induction de la lignée luminale en agissant sur l'axe ER-FOXA1. Il serait nécessaire d'investiguer plus loin si le fait que Notch agisse comme oncogène ou suppresseur de tumeur dépend du stade de différenciation de la cellule dans laquelle il est modulé et laquelle de ces deux fonctions il est le plus probable de rencontrer dans les différents types de cancer du sein.

Ultrastructural changes of the internal limiting membrane removed during indocyanine green assisted peeling versus conventional surgery for idiopathic macular epiretinal membrane

Résumé : Introduction : L'objectif de cette étude était d'une part d'évaluer les caractéristiques histologiques des fragments cellulaires rétiniens attachés à la limitante interne après vitrectomie et pelage d'une membrane epirétinienne, et d'autre part de mettre en évidence des différences histologiques entre les cas opérés avec ou sans l'aide d'ICG dilué dans du glucose 5%. Méthodes Nous avons examiné rétrospectivement l'histologie de 88 spécimens de membranes épimaculaires contenant la limitante interne de la rétine, qui ont été enlevés chirurgicalement entre 1995 et 2003. L'analyse histologique a centré principalement l'attention sur la présence et les caractéristiques des fragments cellulaires rétiniens attachés à la limitante interne. L'analyse statistique a comparé les résultats entre le groupe I (chirurgie conventionnelle sans l'aide de l'ICG) et le groupe II (chirurgie à l'aide de l'ICG). Résultats Soixante et onze patients ont eu une vitrectomie sans l'aide de l'ICG (groupe I) et 17 avec l'aide de l'ICG (groupe II). Le nombre de débris de cellules de Müller à la surface rétinienne de la limitante interne était plus important dans le groupe I (sans ICG) que dans le groupe II (avec ICG) (40.8% versus 11.8% ; p = 0.024). Des larges fragments cellulaires rétiniens attachés à la limitante interne ont été plus fréquemment observés dans le groupe I (sans ICG) que dans le groupe II (avec ICG) (63.4% versus 23.5%; p= 0.003). Dans cinq (7%) cas du groupe I, de gros éléments cellulaires rétiniens ont été mis en évidence (des axones neuraux ou des vaisseaux sanguins). De tels éléments n'ont pas été retrouvés dans les spécimens du groupe II (avec ICG). Conclusions L'utilisation de l'ICG dilué dans du glucose 5% pour faciliter le pelage d'une membrane épimaculaire et notamment l'ablation de la limitante interne de la rétine semble diminuer de manière significative le nombre et la taille des débris des cellules de Muller adhérents à la face rétinienne de la membrane limitante interne de la rétine. Cette observation suggère que l'utilisation per-opératoire d'ICG dilué dans du glucose 5% facilite l'ablation de la limitante interne pendant la chirurgie de la membrane epirétinienne en diminuant l'adhérence de la limitante interne à la rétine.

Effects of neuroinflammation on demyelination and remyelination: an in vitro study in aggregating brain cell cultures

La neuroinflammation joue un rôle important dans de nombreuses maladies neurodégéneratives dont la sclérose en plaques. Les microglies et les astrocytes sont les cellules effectrices de la réponse inflammatoire dans le cerveau et sont impliquées dans les processus de démyélinisation et de remyélinisation. Dans ce travail, nous avons étudié les réactions inflammatoires accompagnant la démyélinisation et leurs conséquences sur la remyélinisation. Dans ce but, trois différents traitements démyélinisants ont été appliqués sur des cultures en agrégats de télencéphales de rats, à savoir (i) la lysophosphatidylcholine, (ii) l'interféron-γ (IFN-γ) combiné avec du lipopolysaccharide (LPS), et (iii) des anticorps dirigés contre la MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) en présence de complément. Nous avons montré que ces traitements induisent différents types de démyélinisation, de réponses inflammatoires et d'effets secondaires sur les neurones. Nous avons ensuite examiné les effets de l'atténuation de la réponse inflammatoire sur la démyélinisation et la remyélinisation, en utilisant la minocycline, un antibiotique bloquant la réactivité microgiale, et le GW 5501516, un agoniste de PPAR-β (peroxisome proliferator-activated receptor-β). Nous avons montré que la minocycline prévient l'activation microgliale induite par le traitement avec l'IFN-γ et le LPS, mais qu'elle ne protège pas de la démyélinisation. Néanmoins, elle induit une remyélinisation, probablement en favorisant la maturation d'oligodendrocytes immatures. Le GW 501516 diminue l'expression de l'IFN-γ après une démyélinisation induite par les anticorps anti-MOG, mais il ne prévient pas la démyélinisation et ne favorise pas la remyélinisation. Ces résultats indiquent que la démyélinisation induite par le traitement avec l'IFN-γ et le LPS n'est pas une conséquence directe de l'activation microgliale, et que l'augmentation de l'expression de l'IFN-γ ne participe pas à la démyélinisation induite par les anticorps anti-MOG. Ces résultats suggèrent que l'atténuation de l'activation microgliale est bénéfique pour la remyélinisation.

Role of β-catenin and γ-catenin in haematopoiesis : Generation of floxed Delta like 4 gene targeted mice

Résumé La voie de signalisation de Wnt est extrêmement conservée au cours de l'évolution. Les protéines Wnt sont des molécules sécrétées qui se lient à la famille de récepteurs Frizzled. Cette interaction mène à la stabilisation de la protéine β-caténine, qui va s'accumuler dans le cytoplasme puis migrer dans le noyau où elle peut s'hétérodimériser avec les facteurs de transcription de la famille TCF/LEF. Il a été démontré que cette voie de signalisation joue un rôle important durant la lymphopoïèse et de récents résultats suggèrent un rôle clé de cette voie dans le renouvellement des Cellules Souches Hématopoïétique (CSH). Des études se basant sur un système de surexpression de protéines montrent clairement que la voie Wnt peut influencer l'hématopoïèse. Cependant, le rôle de la protéine β-caténine dans le système hématopoïétique n'a jamais été testé directement. Ce projet de thèse se propose d'étudier la fonction de la protéine β-caténine par sa délétion inductible via le système Cre-loxP. De façon surprenante, nous avons pu démontrer que les progéniteurs de la moelle osseuse, déficients en β-caténine, ne montrent aucune altération dans leur capacité à s'auto-renouveler et/ou à reconstituer toutes les lignées hématopoïétiques (myéloïde, érythroïde et lymphoïde) dans les souris-chimères. De plus, le développement, la survie des thymocytes ainsi que la prolifération des cellules T périphériques induite par un antigène, sont indépendants de β-caténine. Ces résultats suggèrent soit que la protéine β-caténine ne joue pas un rôle primordial dans le système hématopoiétique, soit que son absence pourrait être compensée par une autre protéine. Un candidat privilégié susceptible de se substituer à β-caténine, serait plakoglobine, aussi connu sous le nom de γ-caténine. En effet, ces deux protéines partagent de multiples caractéristiques structurelles. Afin de démontrer que la protéine γ-caténine peut compenser l'absence de β-caténine, nous avons généré des souris dans lesquelles, le système hématopoïétique est déficient pour ces deux protéines. Cette déficience combinée de β- caténine et γ-caténine ne perturbe pas la capacité des Cellules Souche Hématopoïétique-Long Terme (CSH-LT) de se renouveler, par contre elle agit sur un progéniteur précoce déjà différencié de la moelle osseuse. Ces résultats mettent en évidence que la protéine γ-caténine est capable de compenser l'absence de protéine β-caténine dans le système hématopoïétique. Par conséquent, ce travail contribue à une meilleure connaissance de la cascade Wnt dans l'hématopoïèse. Summary The canonical Wnt signal transduction pathway is a developmentally highly conserved. Wnts are secreted molecules which bind to the family of Frizzled receptors in a complex with the low density lipoprotein receptor related protein (LRP-5/6). This initial activation step leads to the stabilization and accumulation of β-catenin, first in the cytoplasm and subsequently in the nucleus where it forms heterodimers with TCF/LEF transcription factor family members. Wnt signalling has been shown to be important during early lymphopoiesis and has more recently, been suggested to be a key player in self-renewal of haematopoietic stem cells (HSCs). Although mostly gain of function studies indicate that components of the Wnt signalling pathway can influence the haematopoietic system, the role of β-catenin has never been directly investigated. The aim of this thesis project is to investigate the putatively critical role of β-catenin in vivo using the Cre-loxP mediated conditional loss of function approach. Surprisingly, β-catenin deficient bone marrow (BM) progenitors arc not impaired in their ability to self-renew and/or to reconstitute all haematopoietic lineages (myeloid, erythroid and lymphoid) in both mixed and straight bone marrow chimeras. In addition, both thymocyte development and survival, and antigen-induced proliferation of peripheral T cells are β- catenin independent. Our results do not necessarily exclude the possibility of an important function for β-catenin mediated Wnt signalling in the haematopoietic system, it rather raises the question that β-catenin is compensated for by another protein. A prime candidate that may take over the function of β-catenin in its absence, is the close relative plakoglobin, also know as γ-catenin. This protein shares multiple structural features with β-catenin. In order to investigate whether γ-catenin can compensate for the loss of β-catenin we have generated mice in which the haematopoietic compartment is deficient for both proteins. Combined deficiency of β-catenin and γ-catenin does not perturb Long Term-Haematopoietic Stem Cells (LT-HSC) self renewal, but affects an already lineage committed progenitor population within the BM. Our results demonstrate that y-catenin can indeed compensate for the loss of β-catenin within the haematopoietie system.