Desenho e validação de iniciadores microssatélites SSR para mamoneira

O objetivo deste trabalho foi desenhar, validar e otimizar pares de iniciadores microssatélites SSR para mamoneira. O desenho dos pares de iniciadores foi feito por meio do aplicativo Websat, a partir de sequências depositadas no GenBank do National Center for Biotechnology Information (GenBank/NCBI), e a sua qualidade foi aferida com uso do aplicativo web NetPrimer. Foram utilizadas diferentes concentrações de DNA, cloreto de magnésio, pares de iniciadores, dNTPs e temperatura de anelamento para otimização das condições de PCR. Um total de 30 pares de iniciadores SSR foi desenhado, sintetizado e otimizado. O gel de agarose foi utilizado para detecção dos produtos amplificados, e o gel desnaturante de poliacrilamida, na otimização das condições de PCR e na identificação de polimorfismo. Os pares de iniciadores apresentaram percentagem média de guanina/citosina (GC) igual a 47,29% e produtos amplificados com tamanhos entre 128 e 381 pb. Vinte e nove pares de iniciadores SSR (96,7%) foram validados, dos quais nove foram polimórficos (23,3%). As concentrações otimizadas para amplificação são: DNA, 25 ng; cloreto de magnésio, 1,2 mmol L-1; iniciadores Forward e Reverse, 0,4 mmol L-1; dNTPs, 0,1 mmol L-1; e temperatura de anelamento, 62 a 64ºC. As ferramentas de bioinformática Websat e Net Primer podem ser utilizadas para desenvolver iniciadores microssatélites de qualidade, para a mamoneira, a partir de sequências depositadas no GenBank/NCBI.

Análise da diversidade genética por AFLP e identificação de marcadores associados à resistência a doenças em videira

Com objetivo de estudar diversidade genética e identificar marcadores associados à resistência ao míldio (Plasmopara viticola) e ao oídio (Uncinula necator), foram analisadas as cultivares de videira A 1976, CG 87746, CNPUV 154-27, Crimson Seedless, Gota de Ouro, Itália, Seyve Villard 12327 e Seyve Villard 12375. As análises de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP) seguiram as etapas de digestão, ligação, pré-amplificação e amplificação. Efetuou-se a separação dos fragmentos amplificados em gel de 7% de poliacrilamida desnaturante (uréia 7M) e coloração com nitrato de prata. A similaridade foi estimada com base no coeficiente de Jaccard, e a agregação, por UPGMA. Foi gerada uma matriz de similaridade com bom ajustamento da agregação (r = 0,84). Os agrupamentos obtidos corresponderam à origem e classificação botânica das cultivares. Foram identificadas 15 marcas dissimilares associadas à resistência, sendo oito para míldio e sete para oídio.

Estudio clínico del tratamiento de las exóstosis digitales mediante la implantación de un gel biocompatible

Antecedentes: La exóstosis digital es una patología común que se presenta con frecuencia en las consultas de podología. A pesar del alto grado de incidencia es una entidad clínica muy poco estudiada. En la actualidad, los tratamientos propuestos para resolver esta patología son el tratamiento conservador mediante ortesis de silicona y el tratamiento quirúrgico consistente en la resección de la exostosis. Consideramos necesario otra alternativa de tratamiento como la infiltración de un gel de Poliacrilamida (PAAG) que presente mayores beneficios y menos inconvenientes a los pacientes que los tratamientos propuestos hasta el momento. Material y Métodos: Estudio realizado durante los meses de octubre de 2006 y febrero de 2009, sobre 54 pacientes (2 varones y 52 mujeres) de edades comprendidas entre 43 y 85 años afectados de exostosis digital. Se procede a la infiltración de un gel biocompatible en la zona de la exostosis para aislar la misma y evitar presiones según técnica de infiltración descrita. Todos los pacientes firman el documento de consentimiento informado. Los datos fueron recogidos de forma objetiva y subjetivamente en cada uno de los pacientes. La posterior evaluación de los datos y su tratamiento estadístico se llevó a cabo de forma disociada y anónima. El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico SPSS-PC 17.0. Resultados: El heloma interdigital en 4º espacio y 5º dedo se presentó en el 35,2% de los casos; el heloma en dorso del 5º dedo en el 29,6%; el heloma en dorso de dedo central en el 11,1% de los casos; heloma interdigital en 4º espacio y 4º dedo en el 9,3%; y el resto de lesiones primarias en un 14,9% del total de los casos. De cada uno de los casos se observó: tratamientos previos, cantidad de fármaco infiltrada, reacción al fármaco, controles y satisfacción del paciente al tratamiento. A un 57,4% de los pacientes no se les había realizado ningún tratamiento previo, mientras que a un 33,3% se le había realizado una ortesis de silicona. Analizando la cantidad de PAAG infiltrado en cada caso nos resultó una media de 0,542 cc con una desviación típica de 0,2237 cc. La cantidad mínima fue de 0,20 cc, hasta un máximo de 1,50 cc. La reacción observada al fármaco a las 24 y 48 horas de la infiltración fue prácticamente la misma que la del periodo inicial, observándose el habón en ambos tiempos de valoración. Se practicaron cuatro controles posinfiltración a la semana, al mes, a los tres meses y a los seis meses, en los que a seis meses pudimos concluir que en la mayoría de los casos ? 45 de 54 - persistió el habón de PAAG del inicio. La satisfacción se valora a la semana, al mes, a los tres meses y a los seis meses siendo a los 6 meses el grado de satisfacción de los pacientes del 98%. Conclusiones: El tratamiento del heloma provocado por exostosis digital mediante infiltración de gel de poliacrilamida según la técnica protocolizada en este estudio clínico es factible, reproductible y eficaz. Alcanzando el producto un alto nivel de tolerancia y adaptación a las estructuras anatómicas y disminuyendo los efectos secundarios, lo que nos hace afirmar que es una técnica segura con la que hemos obtenido óptimos resultados en lo que se refiere a efectividad del tratamiento y disminución del dolor. Podemos concluir que la infiltración de gel de poliacrilamida se convierte una nueva opción de tratamiento en el caso de exostosis digitales.

Estudio clínico del tratamiento de las exóstosis digitales mediante la implantación de un gel biocompatible

Antecedentes: La exóstosis digital es una patología común que se presenta con frecuencia en las consultas de podología. A pesar del alto grado de incidencia es una entidad clínica muy poco estudiada. En la actualidad, los tratamientos propuestos para resolver esta patología son el tratamiento conservador mediante ortesis de silicona y el tratamiento quirúrgico consistente en la resección de la exostosis. Consideramos necesario otra alternativa de tratamiento como la infiltración de un gel de Poliacrilamida (PAAG) que presente mayores beneficios y menos inconvenientes a los pacientes que los tratamientos propuestos hasta el momento. Material y Métodos: Estudio realizado durante los meses de octubre de 2006 y febrero de 2009, sobre 54 pacientes (2 varones y 52 mujeres) de edades comprendidas entre 43 y 85 años afectados de exostosis digital. Se procede a la infiltración de un gel biocompatible en la zona de la exostosis para aislar la misma y evitar presiones según técnica de infiltración descrita. Todos los pacientes firman el documento de consentimiento informado. Los datos fueron recogidos de forma objetiva y subjetivamente en cada uno de los pacientes. La posterior evaluación de los datos y su tratamiento estadístico se llevó a cabo de forma disociada y anónima. El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico SPSS-PC 17.0. Resultados: El heloma interdigital en 4º espacio y 5º dedo se presentó en el 35,2% de los casos; el heloma en dorso del 5º dedo en el 29,6%; el heloma en dorso de dedo central en el 11,1% de los casos; heloma interdigital en 4º espacio y 4º dedo en el 9,3%; y el resto de lesiones primarias en un 14,9% del total de los casos. De cada uno de los casos se observó: tratamientos previos, cantidad de fármaco infiltrada, reacción al fármaco, controles y satisfacción del paciente al tratamiento. A un 57,4% de los pacientes no se les había realizado ningún tratamiento previo, mientras que a un 33,3% se le había realizado una ortesis de silicona. Analizando la cantidad de PAAG infiltrado en cada caso nos resultó una media de 0,542 cc con una desviación típica de 0,2237 cc. La cantidad mínima fue de 0,20 cc, hasta un máximo de 1,50 cc. La reacción observada al fármaco a las 24 y 48 horas de la infiltración fue prácticamente la misma que la del periodo inicial, observándose el habón en ambos tiempos de valoración. Se practicaron cuatro controles posinfiltración a la semana, al mes, a los tres meses y a los seis meses, en los que a seis meses pudimos concluir que en la mayoría de los casos ? 45 de 54 - persistió el habón de PAAG del inicio. La satisfacción se valora a la semana, al mes, a los tres meses y a los seis meses siendo a los 6 meses el grado de satisfacción de los pacientes del 98%. Conclusiones: El tratamiento del heloma provocado por exostosis digital mediante infiltración de gel de poliacrilamida según la técnica protocolizada en este estudio clínico es factible, reproductible y eficaz. Alcanzando el producto un alto nivel de tolerancia y adaptación a las estructuras anatómicas y disminuyendo los efectos secundarios, lo que nos hace afirmar que es una técnica segura con la que hemos obtenido óptimos resultados en lo que se refiere a efectividad del tratamiento y disminución del dolor. Podemos concluir que la infiltración de gel de poliacrilamida se convierte una nueva opción de tratamiento en el caso de exostosis digitales.

Transmisión experimental del virus del mal de Río Cuarto por Delphacodes kuscheli

Entre las enfermedades que afectan al cultivo de maíz (Zea mays) en Argentina, la producida por el virus del mal de Río Cuarto (MRCV) es la más importante. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, y su propagación en la naturaleza es realizada por Delphacodes kuscheli (Hemiptera: Delphacidae). La modalidad de transmisión para los miembros de este género de virus es persistente propagativa. Se estableció la necesidad de ajustar un sistema de transmisión eficiente del virus para estudios de caracterización, partiendo de poblaciones libres de virus criadas en laboratorio, para lo cual se ensayaron distintos períodos de adquisición, latencia e inoculación, evaluándose además un rango de hospedantes diferenciales. Se lograron obtener insectos libres de virus en cantidad suficiente para llevar a cabo los trabajos, mediante su cría en fitotrones y cámaras aclimatadas. La transmisión experimental del MRCV se efectuó exitosamente, bajo idénticas condiciones, empleando períodos de adquisición, latencia e inoculación de dos, 10 y uno día respectivamente para los cereales de grano fino y de dos, 10 y dos días para el maíz. Se infectaron de este modo las siguientes especies: maíz, cebada (Hordeum vulgare), avena (Avena sativa), trigo (Triticum aestivum), centeno (Secale cereale), grama rhodes (Chloris gayana) y alpiste (Phalaris canariensis). La detección del virus en las plantas inoculadas se efectuó mediante pruebas serológicas, análisis de dsRNA en electroforesis en gel de poliacrilamida (obteniéndose las 10 bandas típicas de los fijivirus) y microscopía electrónica, detectándose las partículas isométricas de entre 60 y 70 nm de diámetro.

Padrões isoenzimáticos e morfologia de isolados de Alternaria spp. patogênicos a Senna obtusifolia

Isolados de Alternaria spp. patogênicos ao fedegoso (Senna obtusifolia) foram estudados quanto aos aspectos morfológicos e padrões isoenzimáticos, em gel de poliacrilamida. Com base nas características culturais, morfologia de colônias e morfometria de conídios, verificou-se que 11 dos 13 isolados pertenciam à espécie A. cassiae e os outros dois à A. alternata. Os resultados da análise eletroforética corroboraram as informações obtidas por meio de critérios morfológicos. Portanto, esta técnica tem potencial para ser usada na separação destas espécies de Alternaria. A ocorrência de mais de uma espécie deste gênero fúngico em S. obtusifolia foi constatada, ampliando o número de patógenos a serem avaliados no programa de desenvolvimento de um bioherbicida para esta espécie de planta daninha.

Estudo comparativo de isolados de Colletotrichum graminicola através da análise eletroforética de padrões protéicos e isoenzimáticos

Colletotrichum graminicola, agente causal da antracnose ou podridão do colmo do milho (Zea mays), é um importante patógeno com alta variabilidade genética. Nove isolados desta espécie foram comparados através do uso da análise eletroforética em gel de poliacrilamida, utilizando três sistemas: proteínas totais, esterase e fosfatase ácida. A análise mostrou variação no número e posição das bandas no gel, dentro de cada sistema estudado. Com relação a proteínas totais, foi observado maior polimorfismo, embora os isolados Cgr8 e Cgr9 tenham mostrado idêntico perfil com seis bandas protéicas de mesma mobilidade relativa. Na atividade esterásica, esses mesmos isolados apresentaram um comportamento monomórfico, enquanto os demais revelaram polimorfismo. Na análise fosfatase ácida, todos os isolados mostraram-se semelhantes quanto à presença de duas bandas, porém diferentes em relação a mobilidade das moléculas no gel. Igualdade de comportamento, quanto à mobilidade relativa das bandas de fosfatase ácida, foi observada entre Cgr1 e Cgr2, como também entre Cgr6 , Cgr7 e Cgr8. Em geral, nos três sistemas testados, os isolados de C. graminicola apresentaram bandas em comum, indicando a relação existente entre eles, e que a variação fenotípica observada seja provavelmente decorrente da condição nuclear, homozigótica ou heterozigótica, de cada isolado do fitopatógeno.

Análise de proteínas e isoenzimas de isolados de Rhizoctonia spp. patogênicos a Eucalyptus

Objetivou-se caracterizar isolados de Rhizoctonia solani AG1 e AG4 e isolados binucleados de Rhizoctonia spp. patogênicos a Eucalyptus, por meio de eletroforese de proteínas, em gel de poliacrilamida, e de isoenzimas (ACP, 6-PGDH, LAP, SOD, MDH e IDH), em gel de amido. Para comparação, incluíram-se alguns isolados brasileiros de outros hospedeiros e isolados-padrões de R. solani AG1, procedentes do Japão. Observaram-se diferenças nos padrões gerais de proteínas e nos fenótipos isoenzimáticos entre isolados binucleados e multinucleados e entre isolados de diferentes grupos e subgrupos de anastomose. Isolados de R. solani AG1, procedentes do Brasil e Japão, apresentaram baixa similaridade nos padrões de proteínas e de isoenzimas. Isolados brasileiros morfologicamente semelhantes a R. solani AG1-IB (microesclerodiais) apresentaram padrões de proteínas similares e um maior número de fenótipos isoenzimáticos idênticos entre si. Esta tendência foi independente do hospedeiro e da origem geográfica. Variações nos padrões de proteínas e de isoenzimas foram também observadas dentre isolados brasileiros de R. solani AG4. Discute-se o uso da eletroforese de proteínas e isoenzimas na caracterização de isolados de Rhizoctonia spp. e em estudos genéticos e filogenéticos de fungos deste gênero.

Caracterização enzimática e patogenicidade cruzada de Colletotrichum spp. associados a doenças de pós-colheita

A antracnose, causada por Colletotrichum spp., pode ocasionar grandes perdas a nível de campo e em pós-colheita sobre diversas culturas e seus produtos. O presente trabalho teve por objetivos testar a patogenicidade cruzada de isolados de C. gloeosporioides do caju (Anacardium occidentale) (CAJ), manga (Mangifera indica) (MG), mamão (Carica papaya) (MM), maracujá (Passiflora edulis) (MR) e C. musae da banana (Musa spp.) (BAJ); avaliar a produção de enzimas extracelulares (amilolítica, celulolítica, lipolítica e proteolítica) produzidas pelos isolados em substratos sólidos específicos; e detectar padrões eletroforéticos de proteínas totais e isoenzimas (alfa-esterase, beta-esterase, fosfatase ácida e leucina aminopeptidase). Na análise da patogenicidade cruzada, todos os isolados de Colletotrichum spp. induziram lesões necróticas, deprimidas sobre os frutos, exceto em maracujá que foi suscetível tão somente ao isolado MR. Quanto à produção de enzimas extracelulares hidrolíticas, os isolados de C. gloeosporioides produziram amilase, lipase, protease e celulase, sendo que esta última enzima não foi detectada em C. musae. Com relação à análise eletroforética de proteínas totais e isoenzimas, os isolados apresentaram variações no número e posição das bandas no gel de poliacrilamida em todos os sistemas, com exceção de leucina aminopeptidase, onde bandas monomórficas foram formadas, sem variação na intensidade e pouca variação na mobilidade relativa.

Dois novos sistemas de diagnose precoce da meleira do mamoeiro

A diagnose da meleira do mamoeiro (Carica papaya)tem sido feita mediante observação de sintomas que aparecem principalmente nos frutos ou pela detecção de dsRNA de cerca de 12 kb, purificado a partir do látex em coluna de CF11, em gel de agarose ou poliacrilamida. Os sintomas nos frutos são tardios e permitem longa permanência de plantas infectadas no campo e o processo usado para detectar dsRNA é laborioso, não se prestando a detecção em larga escala. Visando disponibilizar protocolos de diagnose precoce da meleira que possam ser usados em larga escala, o presente trabalho apresenta dois métodos de detecção relativamente baratos, rápidos e que permitem o manuseio de dezenas de amostras por dia. Os dois métodos utilizam o látex extraído dos frutos, folhas ou caule de plantas, e se baseiam na extração e visualização de ácidos nucléicos. A presença do vírus é confirmada pela visualização do seu dsRNA em gel de agarose (1%) em 1X TBE. Com esta técnica temos conseguido resultados confiáveis a ponto de diagnosticar precocemente a meleira em plantas ainda jovens e em plantas assintomáticas.

Podridão peduncular em manga: patogenicidade, agressividade e caracterização de isolados pela análise isoenzimática

Trinta e quatro isolados de Lasiodiplodia theobromae coletados de diferentes órgãos de mangueira, em duas épocas sazonais diferentes, em distintas regiões geográficas, foram avaliados quanto à patogenicidade, agressividade e produção de enzimas em substratos sólidos específicos e em sistemas de géis de poliacrilamida. Independente do órgão do qual foram isolados, todos foram patogênicos quando inoculados em manga, diferindo no grau de agressividade, sendo separados em três grupos: altamente, medianamente e fracamente agressivos. As atividades amilolítica, celulolítica, lipolítica e proteolítica foram estimadas por meio da difusão enzimática em meio sólido específico e mensuração do halo de degradação do substrato. As atividades das enzimas á-esterase, â-esterase, leucina-aminopeptidase, fosfatase ácida e proteínas totais foram analisadas em géis de poliacrilamida com meios de revelação específicos para cada análise. Os padrões eletroforéticos bem como as análises das enzimas extracelulares apresentaram polimorfismo, demonstrando a diversidade na base genética dos isolados, independente da época de coleta, região geográfica e órgão de isolamento.

Isoenzimas na diferenciação de sementes de três espécies do gênero Euterpe

A análise e o estudo das características morfológicas de sementes e plântulas de palmito-vermelho (Euterpe espiritosantensis Fernandes), juçara (E. edulis Mart.) e açaí (E. oleracea Mart.) não permitem que o analista de sementes, ou o melhorista, faça a identificação e a diferenciação inequívoca das espécies. Neste trabalho, buscou-se avaliar o potencial discriminante da técnica de eletroforese para sementes dessas espécies, utilizando-se nove sistemas enzimáticos. Foram realizadas análises de eletroforese de isoenzimas, testando-se 30 embriões (0 a 1 mm de protrusão) de cada espécie, por corrida e por sistema enzimático. Para a identificação das bandas e determinação do perfil eletroforético foram realizadas, no mínimo, 30 corridas por sistema enzimático avaliado, em gel de poliacrilamida (7,5%). Constatou-se que, dentre as isoenzimas testadas, a polifenol-oxidase e a fosfatase-ácida mostraram-se instáveis, raramente possibilitando a visualização das bandas. As isoenzimasalfa e beta-esterase nem sempre possibilitaram o aparecimento de bandas visíveis, principalmente para E. espiritosantensis, mas foram capazes de distinguir E. edulis de E. oleracea. A glucose-6-fosfato desidrogenase e a glutamato-desidrogenase revelaram perfis eletroforéticos nítidos em todas as corridas, mas a posição das bandas não permitiu a diferenciação das três espécies estudadas. As isoenzimas mais eficientes na avaliação da pureza genética e na diferenciação das sementes foram fosfoglucomutase, fosfoglucose isomerase e peroxidase, por apresentarem perfis eletroforéticos distintos.

Isoenzimas no monitoramento da deterioração de sementes de Euterpe espiritosantensis Fernandes

As sementes de Euterpe espiritosantensis são recalcitrantes, pois apresentam redução da germinação com a desidratação e curta longevidade. O objetivo deste trabalho foi identificar sistemas enzimáticos eficientes no monitoramento da deterioração e perda da capacidade germinativa de sementes de palmiteiro-vermelho. As sementes foram colocadas para secar por 0, 20 e 40 h (teor de água de 46, 40 e 36%, respectivamente) e armazenadas a 15 ºC em sacos plásticos fechados durante 54 semanas. Em intervalos de tempo de seis semanas, a qualidade das sementes foi avaliada quanto à germinação e atividade das enzimas glucose-6-fosfato desidrogenase, glutamato desidrogenase, fosfoglucomutase, fosfoglucose isomerase e peroxidase utilizando eletroforese em géis de poliacrilamida. A enzima peroxidase foi a única eficiente no monitoramento da deterioração e perda da capacidade germinativa de sementes de palmiteiro-vermelho.

Efeito da sinvastatina na sepse abdominal de ratos diabéticos

OBJETIVO: Analisar se o pré-tratamento com sinvastatina em modelo experimental de sepse abdominal é benéfico em ratos diabéticos. MÉTODOS: Cinquenta e seis ratos Wistar foram aleatoriamente distribuídos em: grupo não diabético (n-28) e grupo diabetes induzido por estreptozotocina (n=28). Sepse abdominal por ligadura e punção do ceco foi induzida em 14 ratos diabéticos e em 14 não diabéticos. Os demais 28 animais foram alocados em grupo sham. Os grupos de ratos com sepse e os sham (cada com sete animais) foram tratados com microemulsão oral de simvastatina (20 mg kg-1 day-1) e solução salina 0,9%, respectivamente. Sangue periférico foi usado para dosagem de TNFα, IL-1β, IL-6, proteína C reativa, procalcitonina, contagem de leucócitos e neutrófilos em todos os animais. A análise estatística foi realizada pela ANOVA e teste de Tukey, com p<0,05. RESULTADOS: A sinvastatina reduziu a mortalidade nos ratos diabéticos. Os valores séricos de TNF-α, IL-1β, IL-6, proteína C reativa, procalcitonina, leucócitos e neutrófilos mostraram-se mais baixos nos ratos diabéticos e não diabéticos com sepse, tratados com sinvastatina, do que nos tratados com solução salina. CONCLUSÃO: A sinvastatina teve efeito antiinflamatório, que pode ter resultado em proteção contra a sepse em ratos diabéticos.

Diversidade genotípica de rotavírus suínos no Estado de São Paulo

Rotavírus é uma das causas mais comuns de diarréia tanto em humanos quanto em diferentes espécies animais. Foi conduzido um estudo transversal a partir de 144 amostras fecais diarréicas colhidas de leitões, provenientes de 16 criações comerciais distribuídas por 10 municípios do Estado de São Paulo, Brasil, com o objetivo de se detectar a ocorrência de rotavírus e realizar sua caracterização molecular quanto seus genotipos G e P. Um total de 43 amostras (29,86%) foram positivas para rotavírus por Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE) e ELISA, num esquema de triagem em paralelo. A caracterização mediante reações do tipo nested-multiplex RT-PCR demonstrou que, isoladamente, o genotipo P[6] foi o mais frequente, detectado em 25,58% das amostras, seguido pelo P[1] (11,63%) e P[7] (9,3%). Infecções concomitantes de genotipos P[6]+P[7] (9,3%), P[1]+P[6] (4,65%), P[1]+P[6]+P[7] (2,33%) foram também observadas. Analogamente, o genotipo G[5] foi detectado em 30,23% das amostras, seguido pelo G[10] (20,93%) e G[6] (4,65%) e G[5]+G[10] (18,6%). O genotipo G[5]P[6] foi o mais frequente (11,63%), porém outras combinações e amostras não tipificáveis também foram observadas. Considerando-se a diversidade de rotavírus suínos encontrada na população estudada, medidas profiláticas específicas devem levar em conta, para sua efetividade, o grau de proteção cruzada entre os genotipos presentes nas formulações vacinais e aqueles que realmente são circulantes numa região.