Promoção do crescimento de alface por rizobactérias

Rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCPs) podem ser uma alternativa para o aumento da produtividade de várias espécies vegetais, inclusive alface. Conduziram-se quatro experimentos com isolados de rizobactérias de diversas origens para verificar sua capacidade de promoção de crescimento de plantas de alface. Ao todo, testaram-se 77 isolados de Pseudomonas do grupo fluorescente, 23 de Bacillus e 11 de outras bactérias rizosféricas em areia esterilizada, em solo esterilizado, em substrato formado por uma mistura de solo e esterco (1:1, em volume), de forma semelhante à usada pelos produtores, e em areia com a solução nutritiva recomendada para cultivos hidropônicos, em duas concentrações. Foi marcante o benefício exercido pelas bactérias do gênero Pseudomonas em contraposição às dos outros gêneros, revelando algum favorecimento dessas bactérias na rizosfera de alface, de forma a promover melhor crescimento das plantas. Houve diferenças no comportamento dos isolados conforme a fertilidade do substrato.

Rizobactérias e promoção do crescimento de plantas cítricas

Desenvolveram-se três experimentos em casa de vegetação para verificar a possibilidade de as rizobactérias atuarem como promotoras do crescimento de plantas cítricas. Ao todo, testaram-se 10 isolados de Pseudomonas do grupo fluorescente, 13 de Bacillus e sete de outras bactérias rizosféricas em porta-enxertos utilizados na citricultura: tangerineira 'Cleópatra' (Citrus reshni), limoeiro 'Cravo' (Citrus limonia) e limoeiro 'Volcameriano' (Citrus volkameriana). Dependendo do porta-enxerto, sete isolados de Pseudomonas, um de Bacillus e um de outra bactéria rizosférica tiveram efeito benéfico sobre a matéria seca de raízes ou de parte aérea, indicando uma alta proporção de promotores de crescimento entre as bactérias do primeiro grupo. Procedeu-se também à contagem de bactérias fluorescentes do gênero Pseudomonas e de bactérias não-fluorescentes em raízes de tangerineira 'Cleópatra' e de limoeiro 'Cravo', procedentes de viveiro de mudas e do campo. Ambos os grupos bacterianos tiveram sua multiplicação favorecida na rizosfera de tangerineira 'Cleópatra', em condições de viveiro.

Rizobactérias e alface: colonização rizosférica, promoção de crescimento e controle biológico

Rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCPs) podem aumentar a produção agrícola de diversas culturas. O objetivo deste trabalho foi relacionar a colonização radicular e, ou, do colo de plântulas por RPCPs, avaliada in vitro, com sua capacidade de promoção do crescimento, de maneira a agilizar os testes de seleção de isolados de rizobactérias. Além disso, testou-se o antagonismo in vitro entre as bactérias e o fungo Fusarium sp., para verificar a possibilidade de ser a promoção do crescimento exercida por controle biológico de fitopatógeno. Avaliaram-se 64 isolados de rizobactérias do grupo fluorescente de Pseudomonas spp., de diversas origens. A avaliação foi feita visualmente, considerando-se que a presença de uma névoa turva de aspecto esbranquiçado ao longo e em volta da raiz ou de névoa em volta do colo da plântula indicava a colonização das raízes pela bactéria. De todos os isolados bacterianos, apenas oito resultaram em névoa ao longo das raízes e trinta e oito colonizaram a região do colo. Desenvolveu-se também um experimento em casa de vegetação para verificar a capacidade desses isolados de promover crescimento em plantas de alface. O substrato utilizado foi formado por uma mistura de solo e esterco de galinha, semelhante ao usado pelos produtores. Doze isolados promoveram o crescimento das plantas, tendo quatro aumentado a massa de matéria seca da raiz e nove, o número de folhas. Onze isolados que promoveram o crescimento das plantas de alface apresentaram colonização radicular na região do colo. No teste de antagonismo in vitro em meio B de King e em meio BDA, doze dos sessenta e quatro isolados avaliados apresentaram antagonismo contra Fusarium sp., e, desses, apenas três foram eficientes na promoção de crescimento de plantas de alface, tendo colonizado a região do colo das plântulas.

The role of AUF1 in AU-rich interleukin-6 mRNA regulation

Abstract: The AU-rich elements (AREs) consisting of repeated AUUUA motifs confer rapid degradation to many cellular mRNAs when present in the 3' untranslated region (3'UTR). We have studied the instability of interleukin-6 mRNA by grafting its 3' untranslated region to a stable green fluorescent protein mRNA. Subsequent scanning mutagenesis identified two conserved elements, which taken together account for most of the instability. The first corresponds to a short non-canonical AU-rich element. The other comprises a sequence predicted to form astern-loop structure. Both elements need to be present in order to confer full instability (Paschoud et al. 2006). Destabilization of ARE-containing mRNAs is thought to involve ARE-binding proteins such as AUF1. We tested whether AUF1 binding to interleukin-6 mRNA correlates with decreased mRNA stability. Overexpression of myc-tagged p37AUFl and p42AUF1 as well as suppression of all four AUF1 isoforms by RNA interference stabilized the interleukin-6 mRNA. Furthermore, the interleukin-6 mRNA co-immunoprecipitated specifically with myc-tagged p37AUF1 and p42AUF1 in cell extracts. Both the stabilization and AUF1-binding required the non-canonical AU-rich sequence. These results indicate that AUF1 binds to the AU-rich element in vivo and promotes interleukin6 mRNA degradation. The combination of mRNA co-immunoprecipitation with microarray technology revealed that at least 500 cellular mRNAs associate with AUF1. Résumé: "La présence d'éléments riches en A et U (ARE), en particulier les motifs répétés d'AUUUA dans la région 3' non traduite, confère une dégradation rapide à beaucoup d'ARN cellulaires. Nous avons étudié l'instabilité de l'ARN codant pour l'interleukine 6 en greffant sa région 3' non traduite à un ARN stable codant pour la protéine fluorescente verte. La mutagenèse systématique des séquences non traduites a permis l'identification de deux éléments conservés qui confèrent l'instabilité à l'ARN. Le premier correspond à un élément AU-riche non canonique court. Le second comporte une structure en 'épingle à cheveux'. Tous les deux éléments doivent être présents afin de conférer une instabilité complète (Paschoud et al. 2006). On pense que des protéines telles que AUF1, pouvant se lier aux éléments ARE, sont impliquées dans la dégradation des ARN messagers. Nous avons examiné si la liaison de AUFl sur l'ARN de l'interleukine 6 corrèle avec une stabilité diminuée. La surexpression des protéines p37AUF1 et de p42AUF1 myc-étiquetées ainsi que la suppression de chacun des quatre isoformes de AUF1 par interférence d'ARN a stabilisé l'ARN messager d'interleukine 6. En outre, cet ARN co-immunoprécipite spécifiquement avec p37AUF1 et p42AUF1 dans des extraits cellulaires. La présence de l'élément AUriche non canonique est nécessaire pour la stabilisation de l'ARN et sa liaison avec AUFI. Ces résultats indiquent qu'AUF1 se lie à l'élément AU-riche in vivo et favorise la dégradation de l'ARN messager d'interleukine 6. La combinaison des techniques de coimmunoprécipitation des ARN messagers et des analyses par `microarray' indique qu'au moins 500 ARN cellulaires s'associent à AUF1.

Movimentos de migração e dispersão de adultos da cigarrinha-das-pastagens

O efeito do movimento de adultos da cigarrinha-das-pastagens (Deois flavopicta Stal) em sua dinâmica populacional foi avaliado em pastagens de Brachiaria ruziziensis na região do Distrito Federal, Brasil. Foram utilizados painéis de plástico com cola adesiva para monitorar as taxas de movimentação. Os dados sugerem a ausência de um padrão predominante de movimentação em relação à posição geográfica das armadilhas. A ocorrência de vegetação baixa, semelhante às pastagens em volta da área estudada, aparentemente favoreceu a dispersão, ao passo que a ocorrência de cerrados ou matas na vizinhança inibiu o movimento nesta direção e aumentou a taxa de retorno da cigarrinha às pastagens. O inseto se deslocou principalmente mediante saltos ou vôos curtos e baixos (abaixo de 1 m). Uma proporção aproximada de 4:1 (macho:fêmea) foi capturada nas armadilhas, indicando que os machos movimentam-se mais que as fêmeas. A velocidade média de movimentação, de populações marcadas com pó fluorescente atóxico e recapturadas após períodos variáveis de liberação, foi inferior a 5 m por dia. O movimento de dispersão de adultos não contribui significativamente para a perda ou recrutamento de adultos em populações de D. flavopicta, a não ser em casos de explosões populacionais ou extinção local.

Correlation of photodynamic activity and fluorescence signaling for free and pegylated mTHPC in mesothelioma xenografts

Rapport de synthèse : Introduction : Les premières applications cliniques de la thérapie photodynamique (PDT) remontent à plus d'une vingtaine d'années. Basée sur l'activation d'un médicament photosensibilisateur par une source lumineuse à une longueur d'onde spécifique, la PDT permet la destruction sélective de tissus contenant le produit actif. Ce procédé a été expérimenté dans le traitement de cancers en raison de la propriété du médicament à se concentrer dans les tumeurs tout en épargnant les structures normales contigües. Cependant, les photosensibilisateurs utilisés jusqu'à ce jour n'ont pas démontré une accumulation exclusive dans les tissus néoplasiques mais également dans les structures saines avoisinantes induisant une destruction tissulaire non sélective. Notamment, d'importantes complications ont été rapportées suite à l'utilisation de la PDT dans la cavité thoracique après la résection de mésothéliomes pleuraux, et ce malgré l'arrivée de photosensibilisateurs de secondes générations. De ce fait, plusieurs études expérimentales ont été menées afin d'améliorer la sélectivité tumorale du médicament en modulant différentes conditions de traitement et en modifiant la structure du photosensibilisateur par pégylation. Le but de cette étude expérimentale est de corréler l'activité photodynamique, la phototoxicité et la distribution du m-tetrahydroxyphenylchlorin (mTHPC) et de sa forme pégylée, le PEG-mTHPC. De ce fait, un modèle de souris nues porteur de xenogreffes de mésothéliome humain a été utilisé pour étudier les deux photosensibilisateurs. De récents travaux avec ce modèle ont montré que la mesure de la concentration tissulaire du mTHPC et de sa forme pégylée par HPLC restait limitée afin de prédire l'activité photodynamique. De ce fait, nous pensons que les mesures de fluorescence peuvent être plus appropriée. Le signalement fluorescent est mesuré dans le tissu tumoral et dans une région contrôle de la peau afin d'étudier la distribution et l'intensité des deux sensibilisateurs. Méthode : Des souris nues (cd1nu/nu mice) de 8 semaines ont été transplantées avec des fragments de mésothéliome malin humain (H-meso-1). Ces derniers ont été obtenus à partir d'une suspension cellulaire. Au moins trois passages ont été faits dans les animaux, avant que le traitement soit initié. Deux groupes de 6 souris chacun ont été utilisés pour l'injection intraveineuse par la queue du mTHPC à 0.15 mg/kg et du PEG-mTHPC à dose équimolaire. Après trois jour, la tumeur ainsi qu'une région contrôle de la cuisse ont été illuminées sur une surface d'un diamètre de 1.2 cm et pendant 133 secondes avec un laser à une longueur d'onde à 652 nm (fluence 20 J/cm2, fluence rate 150 mW/cm2). Les animaux ont été ensuite sacrifiés 72 heures après l'illumination. L'étendue de la nécrose tumorale et de la région contrôle ont été déterminées en aveugle par histomorphometrie par un pathologue (HJA). La fluorescence microscopique a été évaluée dans 12 souris à une concentration de 0.15 et 0.5 mg/kg pour le mTHPC, et à doses équimolaires pour le PEG-mTHPC. Trois animaux ont été injectés avec le mTHPC à 0.15 mg/kg, 3 autres à dose équimolaire avec la forme pégylée et 6 souris avec le mTHPC à 0.5 mg/kg et à dose équimolaire. Les animaux ont été sacrifiés 72 heures après injection. L'intensité fluorescente des sensibilisateurs a été mesurée dans la tumeur et la région contrôle. Suite à cela, les coupes ont été fixées par H&E et superposées aux images fluorescentes, afin de localiser la distribution des deux photosensibilisateurs dans les différents compartiments tissulaires. Six souris transplantées n'ayant ni été injectées avec les sensibilisateurs ou illuminées ont servi de groupe contrôle. Résultats : Trois jours après l'illumination, la PDT provoque une nécrose tumorale de 10 ±5.4 mm2 pour le mTHPC à 0.15mg/kg et 5.2 ± 4.6 mm2 pour sa forme pégylée à dose équimolaire. Cependant, la nécrose tumorale induite par les deux formulations du sensibilisateur est significativement plus élevée que dans le groupe contrôle (0.33 ± 0.58 mm2) (P=0.02). Toutefois, le mTHPC pégylé provoque une photosensibilité cutanée moins importante que la forme non-pegylée. Dans les deux groupes, aucune nécrose n'a été observée dans la cuisse des animaux. Trois jours après l'injection du mTHPC et de la forme pégylée à 0.15 mg/kg, aucune activité fluorescente n'a été détectée. Cependant, à 0.5 mg/kg, la fluorescence microscopique révèle une distribution hétérogène des deux photo-sensibilisateurs dans le tissu tumoral avec une accumulation prédominante dans les régions peri-vasculaires. Les deux médicaments montrent une distribution intracellulaire homogène dans le cytoplasme et une absence de signalement dans le nucleus. La mesure de l'intensité fluorescente du mTHPC à 0.5mg/kg ne montre pas de différence significative entre le tissu tumoral et la région contrôle. Par contre, le PEG-mTHPC montre une intensité fluorescente supérieure dans le tissu tumoral que dans la peau (ratio tumeur- peau 0.94 pour le mTHPC et 1.73 pour le PEG-mTHPC). Conclusion : L'utilisation du mTHPC à 0.15mg/kg induit une nécrose tumorale similaire à celle du PEG-mTHPC à dose équimolaire. Cependant, ce dernier démontre une photo-toxicité plus atténuée de la peau. La fluorescence microscopique permet de localiser les deux sensibilisateurs dans les différents compartiments tissulaires à partir d'une dose de 0.5 mg/kg. Le PEG-mTHPC induit un signalement fluorescent supérieur dans le tissu tumoral par rapport à la peau. La mesure du signalement fluorescent a le potentiel de prédire l'activité photodynamique du mTHPC et de sa forme pégylée dans les xénogreffes de mésothéliome humain dans un modèle de souris nue.

Estabelecimento e multiplicação in vitro de Prunus sp. em diferentes meios de cultivo

O trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar diferentes meios de cultivo no estabelecimento e multiplicação in vitro de espécies do gênero Prunus. Os segmentos nodais de 1,0 cm foram mantidos sob luz fluorescente com radiação de 20 mE.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25±2ºC. No estabelecimento, testaram os meios MS, MS ¾, SH e Villegas, e na multiplicação: SH e MS ¾. O meio MS ¾ foi testado em diferentes concentrações de ágar (4,5; 5,5; 6,5 g.L-1). Avaliaram-se as percentagens de estabelecimento dos explantes, contaminação, oxidação e segmentos não brotados. O meio Villegas apresentou menor oxidação durante o período de estabelecimento in vitro. Com o meio MS ¾, verificou-se maior percentagem de estabelecimento dos explantes. Na fase de multiplicação, avaliaram-se a percentagem de crescimento, a taxa de multiplicação e o número de brotações. O meio MS ¾, com 5,5 g.L-1 de ágar, apresentou os melhores resultados.

Monitoramento de coleobrocas associadas à mangueira no município de José de Freitas, Estado do Piauí

Este trabalho foi desenvolvido de junho de 2004 a maio de 2005, objetivando o reconhecimento de espécies de coleobrocas (Insecta: Coleoptera) que se encontram associadas a pomar comercial de manga (Mangifera indica) das variedades Tommy Atkins, Keitt, Kent e Palmer, no município de José de Freitas, Estado do Piauí. Foram instaladas duas armadilhas etanólicas modelo Carvalho 47 em cada área das referidas variedades e realizadas coletas semanais. As coleobrocas foram separadas dos resíduos vegetais, secas sob lâmpada e quantificadas. Posteriormente, exemplares de cada morfoespécie coletada foram identificados. Coleobrocas das famílias Bostrichidae, Cerambycidae, Curculionidae estão associadas às variedades de manga cultivadas no município de José de Freitas, Estado do Piauí, onde se destacam as espécies Hylettus seniculus (Germar) (Coleoptera: Cerambycidae), Hypothenemus sp. 1 e sp. 2. (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), apresentando maior expressão numérica e variedade de morfoespécies durante o período de menor precipitação pluviométrica, fator correlacionado positivamente à família Cerambycidae.

Regulation of bistable ICEclc transfer in pseudomonas knackmussii B13

L'élément génétique intégratif et conjugatif auto-transférable de 103 kb qui se trouve dans le génome de Pseudomonas knackmussii B13 (ICEc/c) confère la capacité de dégrader le 3-chlorobenzoate et le 2-aminophénol. L'élément ICE c/c peut être transféré par conjugaison de la souche B13 à diverses bêta- et gamma- protéobactéries. Seule une sous-population de 3 à 5% des cellules transfère l'élément, les cellules dites "compétentes pour le transfert". L'acquisition de la compétence pour le transfert est vraisemblablement la conséquence d'une régulation bistable, conduisant une partie des cellules au transfert de l'élément ICE c/c tandis que, dans les autres, l'élément reste quiescent et ne se transfère pas. À ce jour, les mécanismes et les acteurs moléculaires qui régulent l'activation bistable de l'élément sont restés inconnus. Mon travail de doctorat visait à identifier les éléments bistables du régulon de la compétence pour le transfert et d'analyser les fondements moléculaires de la bistabilité de l'élément ICE c/c chez P. knackmussii. Le premier chapitre introduit le thème du transfert génétique horizontal avec un accent particulier sur les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE) et ICEcIc. L'état actuel des connaissances sur l'organisation génétique, la régulation, l'intégration et le transfert de différents modèles de ICEs est exposé en détail. En outre, je m'étends sur les phénomènes d'hétérogénéité et de bistabilité phénotyplques, qu'on peut distinguer dans une population isogénique dans des conditions de culture homogènes, et qui sont susceptibles de jouer un rôle dans le transfert de l'élément ICE c/c, dans la mesure où il ne s'active et n'est transférable que dans une très petite sous-population de cellules. Dans le chapitre 2, je présente une analyse globale des régions promotrices minimales des gènes appartenant au régulon de la compétence pour le transfert de l'élément ICE c/c. Nous avons étudié les caractéristiques d'expression des promoteurs et, s'ils s'avéraient bistables, leur activation dans le temps par comparaison avec le mutant lntB13. Pour ce faire, nous avons utilisé des fusions de promoteurs avec des gènes rapporteurs et testé l'expression bistable chez P. knackmussii par microscopie à épifluorescence. Pour six promoteurs présentant une expression bistable, nous avons employé de la microscopie temporelle pour déterminer la chronologie de leur expression par rapport à Pint et PinR. Parmi eux, nous avons identifié deux gènes exprimés précocement et trois gènes exprimés tardivement dans le processus d'acquisition de la compétence de transfert. Dans le chapitre 3, j'expose une analyse d'expression génétique pour l'un des groupes de gènes dont la transcription est la plus élevée dans la région conservée de ICE c/c, les gènes orf81655-orf68241 contenus dans une région de 14 kb. Nous montrons d'abord que cet opéron fait partie du même régulon bistable que intB13 et inrR et analysons les caractéristiques génétiques qui conduisent à une transcription élevée. Nous étudions les fonctions biologiques de ce groupe de gènes par des délétlons ciblées et montrons que certaines d'entre elles empêchent le transfert de l'élément. Nous approfondissons la caractérlsatlon de I'orf8l655 en construisant une fusion transcrlptionnelle avec le gène codant pour la protéine fluorescente verte (egfp) (en utilisant le système minl-Tn5). L'expression de Vorf81655 dans des cellules individuelles est comparée au signal mesuré par hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur le ARN messager du gène. En utilisant FISH, des délétlons du promoteur et de l'analyse directe de transcription, nous avons localisé la région promotrice du groupe de gènes. En outre, nous avons utilisé des mutations dirigées pour comprendre la bistabilité de cette région promotrice, caractérisée par une transcription très élevée et une traduction lente de l'ARN messager.  Dans le chapitre 4, nous nous efforçons de comprendre comment la bistabilité est générée au sein du régulon te de l'élément ICE c/c. Pour ce faire, nous avons tenté de reconstituer une expression bistable, dans un hôte qui ne présente pas de bistabilité naturellement, à partir d'éléments génétiques individuels. L'hôte choisi est Pseudomonas putida dans lequel nous avons introduit une copie unique de Pint, PinR ou PaipA fusionnés à la egfp, construits qui permettent d'observer l'apparition de bistabilité. Nous avons ensuite construit différents assemblages de composants génétiques de l'élément ICE c/c, en nous concentrant sur la région parA-inrR. En effet, nous avons pu démontrer qu'une expression bistable apparaît dans P. putida grâce à ces éléments en l'absence de l'élément ICE c/c complet. À noter que la plupart des construits génétiques activent PaipA ou P|,,R, mais qu'un seul recrée la bistabilité de Pint, ce qui suggère que la région parA-inrR permet à la fois d'engendrer la bistabilité et d'opérer la transition entre les promoteurs précoces et les promoteurs tardifs du régulon de la bistabilité. Dans le chapitre 5, nous concluons sur une discussion de la pertinence de nos résultats et sur de futures perspectives de recherche. -- The 103-kb self-transmissible integrative and conjugative element (ICE) of Pseudomonas knackmussii B13 (ICEc/c) confers the capacity to degrade 3- chlorobenzoate and 2-aminophenol. ICEc/c can be conjugated from strain B13 to a variety of Beta- and Gammaproteobacteria. Interestingly, ICE c/c transfer is observed in a subpopulatlon of cells (3-5%) only, the so-called 'transfer competent' cells. The formation of transfer competence (tc) is thought to be the consequence of a 'bistable' decision, which forces those cells to follow the developmental path which leads to ICEc/c transfer, whereas in others ICE c/c remains silent and does not transfer. So far, the mechanisms and molecular partners generating this bistable transfer activation in cells of P. knackmussii B13 remain mostly unidentified. This thesis aimed at understanding the extent of the tc bistability regulon and to dissect the molecular basis of bistabillty formation of ICEc/c in P. knackmussii. The first chapter is a general Introduction on horizontal gene transfer (HGT) with particular emphasis on ICEs and ICE c/c. The emphasis is made on the current knowledge about the HGT gene organization, regulation and specific integration and transfer aspects of the different ICEs models. Furthermore, I focus on the phenomena of phenotypic heterogeneity and bistability (the property of two distinguishable phenotypes existing within an isogenic population under homogeneous conditions), which may play a particular role in ICEc/c behaviour, since ICE activation and transfer only occurs in a very small subpopulation of cells. In Chapter Two, I focus on a global analysis of the different core promoters that might belong to the ICEc/c tc pathway regulon. We studied both expression patterns of ICEc/c promoters and, once being identified as "bistable", their temporal activation compared to that of intB13. In order to do this, we used promoter reporter fusions and tested blstability expression in P. knackmussii using epifluorescence microscopy. For the 6 promoters that showed bistable expression, we used time-lapse microscopy to study the timing of promoter expression in comparison to that of P,,,t or PlnR. We could establish two "early" and 3 "late" phase promoters in the process of transfer competence. In Chapter Three, I focused my attention on analysis of gene expression of one of the most highly transcribed gene clusters in the conserved core region of ICEc/c, a 14-kb gene cluster formed by the genes orf81655-orf68241. First we showed that this operon is part of the same bistability 'regulon' as intB13 and inrR, and analysed the genetic features that lead to high transcription. We studied the potential biological function of this cluster for ICE c/c by making specific gene deletions, showing that some interrupt ICEc/c transfer. We further analysed the orfdl655 promoter by constructing transcriptional egfp fusion reporter strains using the miniTn5 delivery system. Expression of the orf81655 promoter in single cells was compared to signals measured by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) on orfSl655 mRNA. We localized the promoter region of the gene cluster using FISH, promoter deletions, and by direct transcript analysis. We further used site-directed mutagenesis to understand the bistability character of the promoter region and the extremely high transcription but low translation from this mRNA. In Chapter Four, we set out to understand how bistability is generated in the tc pathway of ICEc/c. For this we tried rebuilding bistable expression from ICEc/c individual gene components in a host, which normally does not display bistability. As host we used P. putida without ICEc/c but with a single copy Pint-, PlnR- or PalpA- egfp fusion that enabled us to verify bistability formation. Subsequently, we built different assemblages of ICEc/c gene components, focusing on the parA-inrR region. Indeed, we found that bistable expression can be build from those components in P. putida without ICEc/c. Interestingly, most genetic constructs activated PaipA or PlnR, but only one resulted in bistable activation of PinT. This suggests that the parA-inrR region acts as a bistability "generator", but also as a bistability "relay" from early to late promoters in the tc pathway hierarchy. In the final fifth chapter, we conclude with a discussion of the relevance of the present thesis and the resulting perspectives for future studies.

Molecular basis and regulation of insect pathogenicity in plant-beneficial pseudomonads

Les bactéries du genre Pseudomonas ont la capacité étonnante de s'adapter à différents habitats et d'y survivre, ce qui leur a permis de conquérir un large éventail de niches écologiques et d'interagir avec différents organismes hôte. Les espèces du groupe Pseudomonas fluorescens peuvent être facilement isolées de la rhizosphère et sont communément connues comme des Pseudomonas bénéfiques pour les plantes. Elles sont capables d'induire la résistance systémique des plantes, d'induire leur croissance et de contrer des phytopathogènes du sol. Un sous-groupe de ces Pseudomonas a de plus développé la capacité d'infecter et de tuer certaines espèces d'insectes. Approfondir les connaissances sur l'interaction de ces bactéries avec les insectes pourraient conduire au développement de nouveaux biopesticides pour la protection des cultures. Le but de cette thèse est donc de mieux comprendre la base moléculaire, l'évolution et la régulation de la pathogénicité des Pseudomonas plante-bénéfiques envers les insectes. Plus spécifiquement, ce travail a été orienté sur l'étude de la production de la toxine insecticide appelée Fit et sur l'indentification d'autres facteurs de virulence participant à la toxicité de la bactérie envers les insectes. Dans la première partie de ce travail, la régulation de la production de la toxine Fit a été évaluée par microscopie à épifluorescence en utilisant des souches rapportrices de Pseudomonas protegens CHA0 qui expriment la toxine insecticide fusionnée à une protéine fluorescente rouge, au site natif du gène de la toxine. Celle-ci a été détectée uniquement dans l'hémolymphe des insectes et pas sur les racines des plantes, ni dans les milieux de laboratoire standards, indiquant une production dépendante de l'hôte. L'activation de la production de la toxine est contrôlée par trois protéines régulatrices dont l'histidine kinase FitF, essentielle pour un contrôle précis de l'expression et possédant un domaine "senseur" similaire à celui de la kinase DctB qui régule l'absorption de carbone chez les Protéobactéries. Il est donc probable que, durant l'évolution de FitF, un réarrangement de ce domaine "senseur" largement répandu ait contribué à une production hôte-spécifique de la toxine. Les résultats de cette étude suggèrent aussi que l'expression de la toxine Fit est plutôt réprimée en présence de composés dérivés des plantes qu'induite par la perception d'un signal d'insecte spécifique. Dans la deuxième partie de ce travail, des souches mutantes ciblant des facteurs de virulence importants identifiés dans des pathogènes connus ont été générées, dans le but d'identifier ceux avec une virulence envers les insectes atténuée. Les résultats ont suggéré que l'antigène O du lipopolysaccharide (LPS) et le système régulateur à deux composantes PhoP/PhoQ contribuent significativement à la virulence de P. protegens CHA0. La base génétique de la biosynthèse de l'antigène O dans les Pseudomonas plante-bénéfiques et avec une activité insecticide a été élucidée et a révélé des différences considérables entre les lignées suite à des pertes de gènes ou des acquisitions de gènes par transfert horizontal durant l'évolution de certaines souches. Les chaînes latérales du LPS ont été montrées comme vitales pour une infection des insectes réussie par la souche CHA0, après ingestion ou injection. Les Pseudomonas plante-bénéfiques, avec une activité insecticide sont naturellement résistants à la polymyxine B, un peptide antimicrobien modèle. La protection contre ce composé antimicrobien particulier dépend de la présence de l'antigène O et de la modification du lipide A, une partie du LPS, avec du 4-aminoarabinose. Comme les peptides antimicrobiens cationiques jouent un rôle important dans le système immunitaire des insectes, l'antigène O pourrait être important chez les Pseudomonas insecticides pour surmonter les mécanismes de défense de l'hôte. Le système PhoP/PhoQ, connu pour contrôler les modifications du lipide A chez plusieurs bactéries pathogènes, a été identifié chez Pseudomonas chlororaphis PCL1391 et P. protegens CHA0. Pour l'instant, il n'y a pas d'évidence que des modifications du lipide A contribuent à la pathogénicité de cette bactérie envers les insectes. Cependant, le senseur-kinase PhoQ est requis pour une virulence optimale de la souche CHA0, ce qui suggère qu'il régule aussi l'expression des facteurs de virulence de cette bactérie. Les découvertes de cette thèse démontrent que certains Pseudomonas associés aux plantes sont de véritables pathogènes d'insectes et donnent quelques indices sur l'évolution de ces microbes pour survivre dans l'insecte-hôte et éventuellement le tuer. Les résultats suggèrent également qu'une recherche plus approfondie est nécessaire pour comprendre comment ces bactéries sont capables de contourner ou surmonter la réponse immunitaire de l'hôte et de briser les barrières physiques pour envahir l'insecte lors d'une infection orale. Pour cela, les futures études ne devraient pas uniquement se concentrer sur le côté bactérien de l'interaction hôte-microbe, mais aussi étudier l'infection du point de vue de l'hôte. Les connaissances gagnées sur la pathogénicité envers les insectes des Pseudomonas plante-bénéfiques donnent un espoir pour une future application en agriculture, pour protéger les plantes, non seulement contre les maladies, mais aussi contre les insectes ravageurs. -- Pseudomonas bacteria have the astonishing ability to survive within and adapt to different habitats, which has allowed them to conquer a wide range of ecological niches and to interact with different host organisms. Species of the Pseudomonas fluorescens group can readily be isolated from plant roots and are commonly known as plant-beneficial pseudomonads. They are capable of promoting plant growth, inducing systemic resistance in the plant host and antagonizing soil-borne phytopathogens. A defined subgroup of these pseudomonads evolved in addition the ability to infect and kill certain insect species. Profound knowledge about the interaction of these particular bacteria with insects could lead to the development of novel biopesticides for crop protection. This thesis thus aimed at a better understanding of the molecular basis, evolution and regulation of insect pathogenicity in plant-beneficial pseudomonads. More specifically, it was outlined to investigate the production of an insecticidal toxin termed Fit and to identify additional factors contributing to the entomopathogenicity of the bacteria. In the first part of this work, the regulation of Fit toxin production was probed by epifluorescence microscopy using reporter strains of Pseudomonas protegens CHAO that express a fusion between the insecticidal toxin and a red fluorescent protein in place of the native toxin gene. The bacterium was found to express its insecticidal toxin only in insect hemolymph but not on plant roots or in common laboratory media. The host-dependent activation of Fit toxin production is controlled by three local regulatory proteins. The histidine kinase of this regulatory system, FitF, is essential for the tight control of toxin expression and shares a sensing domain with DctB, a sensor kinase regulating carbon uptake in Proteobacteria. It is therefore likely that shuffling of a ubiquitous sensor domain during the evolution of FitF contributed to host- specific production of the Fit toxin. Findings of this study additionally suggest that host-specific expression of the Fit toxin is mainly achieved by repression in the presence of plant-derived compounds rather than by induction upon perceiving an insect-specific signal molecule. In the second part of this thesis, mutant strains were generated that lack factors previously shown to be important for virulence in prominent pathogens. A screening for attenuation in insect virulence suggested that lipopolysaccharide (LPS) O-antigen and the PhoP-PhoQ two-component regulatory system significantly contribute to virulence of P. protegens CHAO. The genetic basis of O-antigen biosynthesis in plant-beneficial pseudomonads displaying insect pathogenicity was elucidated and revealed extensive differences between lineages due to reduction and horizontal acquisition of gene clusters during the evolution of several strains. Specific 0 side chains of LPS were found to be vital for strain CHAO to successfully infect insects by ingestion or upon injection. Insecticidal pseudomonads with plant-beneficial properties were observed to be naturally resistant to polymyxin B, a model antimicrobial peptide. Protection against this particular antimicrobial compound was dependent on the presence of O-antigen and modification of the lipid A portion of LPS with 4-aminoarabinose. Since cationic antimicrobial peptides play a major role in the immune system of insects, O-antigenic polysaccharides could be important for insecticidal pseudomonads to overcome host defense mechanisms. The PhoP-PhoQ system, which is well-known to control lipid A modifications in several pathogenic bacteria, was identified in Pseudomonas chlororaphis PCL1391 and P. protegens CHAO. No evidence was found so far that lipid A modifications contribute to insect pathogenicity in this bacterium. However, the sensor kinase PhoQ was required for full virulence of strain CHAO suggesting that it additionally regulates the expression of virulence factors in this bacterium. The findings of this thesis demonstrate that certain plant-associated pseudomonads are true insect pathogens and give some insights into how these microbes evolved to survive within and eventually kill the insect host. Results however also point out that more in-depth research is needed to know how exactly these fascinating bacteria manage to bypass or overcome host immune responses and to breach physical barriers to invade insects upon oral infection. To achieve this, future studies should not only focus on the bacterial side of the microbe-host interactions but also investigate the infection from a host-oriented view. The knowledge gained about the entomopathogenicity of plant-beneficial pseudomonads gives hope for their future application in agriculture to protect plants not only against plant diseases but also against insect pests.

Fotoquímica e fotofísica do ácido 1,4-bis(3-carbóxi-3-oxo-prop-1-enil)benzeno

Este trabalho versa sobre a caracterização espectroscópica do ácido 1,4-bis(3-carbóxi-3-oxo-prop-1-enil)benzeno, substância com potencialidade em complexação de íons metálicos. Para isto foram obtidos espectros de UV/VIS do composto em meio aquoso na presença e ausência de irradiação no ultra-violeta. Foram obtidos um coeficiente de extinção molar de 36.457 L mol-1 cm-1 e uma taxa de degradação de 5,2.10-7 mol L-1 min-1, quando se irradiou uma solução do composto cuja concentração era de 3,2.10-5 mol L-1 em uma cubeta de quartzo de 10mm de caminho ótico a 7,0cm de uma lâmpada de mercúrio de 80W.

Síntese e estudo da fotoestabilidade de derivados azalactônicos encapsulados em beta-ciclodextrina

Neste trabalho foram sintetizados 12 derivados azalactônicos pela metodologia clássica de Plöchl-Erlenmeyer. Destes, um foi avaliado quanto a fotoestabilidade em solução por meio de experimentos de fotodegradação utilizando agentes encapsulantes e diferentes solventes. Para a irradiação das amostras foi empregada uma lâmpada de mercúrio de 80W. Os resultados mostram que a fotodegradação do corante ocorre muito mais rapidamente em solventes polares e que o agente encapsulante é fundamental na sua fotoestabilidade.

Comportamento fotofísico do antraceno em sistemas micro-heterogêneos argila-surfactantes-íons metálicos

Argilas constituem uma classe de complexos micro-heterogêneos e podem ser utilizados como substrato para adsorção. O seu comportamento de sorção em fase sólida intensificada pela presença de surfactantes, argilas organofílicas, é um importante fenômeno explorado pela tecnologia ambiental para a remoção de compostos orgânicos policíclicos (hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, HPA) da água, introduzidos no ambiente por fontes antropogênicas. Este trabalho tem por objetivo estudar o comportamento fotofísico do antraceno, como modelo de HPA, em sistemas micro-heterogêneos argila-surfactantes-íons metálicos (M(II)= Cd(II), Cu(II), Hg(II), Ni(II) e Pb(II); surfactantes: CTACl; SDS; TR-X100). Os estudos foram conduzidos pelo monitoramento na mudança das propriedades de fluorescência estática e na supressão da emissão do antraceno utilizado como sonda fluorescente. Como supressores foram utilizados os cátions metálicos: Cd(II), Cu(II), Hg(II), Ni(II) e Pb(II). O perfil do espectro de fluorescência e os resultados dos ensaios de supressão da fluorescência da sonda permitiram inferir na localização do sítio de solubilização do antraceno nos sistemas micro-heterogêneos estudados e na conseqüente organização dos mesmos.

Fungos associados às sementes (Cariopses) de cana-de-açúcar: métodos para detecção, incidência e relação entre incidência fúngica e ambiente de produção das sementes

O presente trabalho teve como objetivos: determinar o método mais adequado para detecção e identificação de fungos associados às sementes (cariopses) de cana-de-açúcar; caracterizar os fungos associados; verificar as incidências nessas sementes e relacionar a incidência fúngica nessas sementes com o ambiente onde foram produzidas. Para detecção do método mais adequado, foram comparados dois substratos, em placas de Petri: agar-água com papel quadriculado e papel de filtro. Utilizaram-se placas de Petri de plástico e de vidro do tipo pirex, para verificar a influência do recipiente. Também foram comparados dois regimes de luz (12 h luz branca fluorescente/12 h escuro e escuro contínuo). As sementes foram mantidas durante sete dias sob temperatura constante de 28 2ºC, quando se procedeu à avaliação. Os requisitos para comparação dos métodos foram sensibilidade, economicidade e praticidade. A partir do método determinado como o mais adequado, foi realizada análise sanitária de 29 cruzamentos dos anos de 2002, 2003 e 2004, caracterizando os fungos associados e verificando as incidências. Posteriormente, compararam-se estas incidências com as condições ambientes, de temperatura e umidade relativa, em que as sementes foram produzidas no programa de melhoramento genético. O método considerado mais adequado, de acordo com os parâmetros analisados, foi o do papel de filtro em placa de Petri de plástico e incubação sob regime de luz (12 h luz branca fluorescente/12 h escuro). Os fungos detectados foram: Alternaria alternata; Aspergillus sp.; Bipolaris sacchari; três grupos morfológicos distintos pertencentes ao gênero Bipolaris; dois grupos morfológicos de Cladosporium; Colletotrichum sp.; três grupos morfológicos de Curvularia; Epicoccum sp.; Fusarium verticillioides; Fusarium semitectum; Leptosphaerulina sp.; Nigrospora sp.; Penicillium sp.; Periconia sp.; Phoma herbarum; Rhizopus sp. e Trichoderma sp. Os mais freqüentemente encontrados foram: Bipolaris sacchari; Bipolaris spp.; Cladosporium spp.; Curvularia spp.; Fusarium verticillioides; Fusarium semitectum e Phoma herbarum. Quando se comparou a porcentagem de incidência dos diversos fungos com o ambiente de produção das sementes, observou-se que não houve relação de temperatura e umidade relativa com incidência fúngica. Supõe-se que as variações de incidência possam estar relacionadas com diferentes fontes de inóculo nos locais de cruzamento ou características genéticas das sementes.

Indução de resistência sistêmica por rizobactérias em cultivos hidropônicos

Rizobactérias do grupo fluorescente de Pseudomonas spp. foram selecionadas quanto a sua capacidade na promoção de crescimento em plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e atividade antagônica contra Pythium aphanidermatum a partir de teste in vitro. Em seguida, em sistema hidropônico, foi avaliada a aplicação prévia dos isolados visando reduzir os danos provocados por P. aphanidermatum em pepino (Cucumis sativus) por resistência sistêmica induzida (RSI), pela adoção da técnica "raízes subdivididas". As variáveis massa da matéria seca (parte aérea e raízes) e comprimento radicular foram utilizadas na avaliação. A produção de compostos antagônicos e/ou promotores de crescimento pelos isolados de Pseudomonas spp. fluorescente foi verificada de modo a associar sua atividade com os resultados obtidos nos testes in vitro e em hidroponia. No experimento in vitro os isolados Ps 140B e Ps 140C proporcionaram maior crescimento das plantas (raiz e hipocótilo) de alface nos tratamentos com e sem patógeno. Alguns dos isolados avaliados no experimento hidropônico demonstraram uma possível expressão da RSI. Não houve correspondência entre os compostos produzidos e a promoção de crescimento vegetal ou controle da doença.