Estudo das interações entre a proteína TRF de Leishmania amazonensis (LaTRF) e suas possíveis parcerias

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Genética) - IBB

Análise estrutural das proteínas da seda da teia da aranha Nephila clavipes por uma abordagem proteômica

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Peptídeos derivados da toxina ParE: síntese, estrutura e estudos de inibição de DNA topoisomerases

Pós-graduação em Biotecnologia - IQ

Interação entre o gene TKN2 (KNOX-type I) e o miR156 node durante a transição de fase vegetativa para reprodutiva em tomateiro (Solanum lycopersicum)

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Genética) - IBB

Diversidade de Bacillus thuringiensis e seus genes cry e vip em amostras metagenômicas de DNA extraído do solo com cultivo de cana-de-açúcar e solo de floresta nativa em estações climáticas diferentes

Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária - FCAV

Interação da proteina e2 do vírus da hepatite c com o receptor de ldl e cd81 presentes em células endoteliais e ativação da resposta inflamatória

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização funcional da proteína MxA: estudo do seu envolvimento com a mauinaria de SUMOilação

Pós-graduação em Biotecnologia - IQ

Análise do envolvimento do fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) na translocação de proteínas para o retículo endoplasmático em Saccharomyces cerevisiae

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Estudo das interações in vivo entre as proteínas teloméricas LaRPA-1 e LaRbp38 usando o sistema do duplo híbrido

A leishmaniose é um conjunto de doenças infecciosas causadas por parasitas do gênero Leishmania, que afligem milhões de pessoas no mundo, tendo a cada ano dois milhões de novos casos e 70 mil mortes. As drogas utilizadas no tratamento das diferentes formas clínicas da doença apresentam alta toxicidade e baixa eficácia, além de apresentarem muitos efeitos colaterais e colaborarem com o aparecimento de parasitas e vetores resistentes. Devido a estas adversidades, o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento desta parasitose é incentivada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e um maior conhecimento sobre a biologia molecular destes protozoários poderá facilitar estas descobertas. Ultimamente, os telômeros, estruturas nucleoproteícas nos terminais dos cromossomos de eucariotos, têm sido alvo intenso de estudos, que visam utilizá-los como alvo terapêutico contra tumores malignos e microrganismos patogênicos. Os telômeros geralmente se apresentam como estruturas dinâmicas onde ocorrem interações entre o DNA e proteínas, resultando na formação do complexo telomérico, que é responsável pela proteção e manutenção dos cromossomos e estabilidade do genoma, caracterizando uma função imprescindível para viabilidade celular. Componentes do complexo telomérico de Leishmania amazonensis foram identificados por ensaios bioquímicos em extratos positivos para a atividade de telomerase. Entre estes componentes identificou-se as proteínas LaRPA-1 (L. amazonensis Replication Protein A-1) e a LaRbp38 (L. amazonensis RNA binding protein) as quais mostraram habilidade de interagir com o DNA telomérico in vitro e in vivo. Mais recentemente, utilizando-se ensaios de imunoprecipitação e de captura por “pull-down” foi demonstrado que estas proteínas fazem parte de um mesmo complexo nos telômeros do parasita. Este trabalho pretende confirmar estas possíveis interações entre as proteínas teloméricas LaRPA-1 e ...

Estudos estruturais com a importina-α e Sequências de Localização Nuclear (NLS) de proteínas envolvidas no metabolismo de Neurospora crassa

Proteínas que apresentam atividades no núcleo e possuem sequência de localização nuclear (NLS) tem seu deslocamento dependente do heterodímero importina-α/β. A importina- (ImpA) é responsável pelo reconhecimento inicial do substrato a ser importado através da interação com os NLS. Os sinais são caracterizados por apresentar um ou mais grupos de aminoácidos básicos, denominados como sequências monopartidas e bipartidas. O fungo Neurospora crassa vem sendo utilizado há mais de 70 anos como organismo modelo em estudos de expressão gênica, desenvolvimento e diferenciação celular, ritmo circadiano, defesa do genoma, bem como outros aspectos da biologia de eucariotos. A presença de um grande número de genes no genoma de N. crassa ainda com funções desconhecidas aponta este organismo como um promissor modelo para o estudo de novos mecanismos genéticos e bioquímicos ainda não identificados. Considerando a importância do metabolismo do glicogênio para os organismos, o presente trabalho teve como objetivo o estudo estrutural de complexos de ImpA com peptídeos NLSs (NCM e NCB) de proteínas envolvidas no metabolismo de glicogênio do fungo N. crassa, utilizando técnicas de cristalografia de proteínas. Monocristais dos complexos ImpA-NCM e ImpA-NCB foram obtidos para a coleta dos dados de difração de raios-X, resultando em dois conjuntos de dados à 2,1Å e 2,45Å de resolução, respectivamente. Após elucidação da estrutura da ImpA, mapas de densidade eletrônica gerados revelaram uma densidade eletrônica no sítio principal de reconhecimento de NLS da ImpA de ambas estruturas, possibilitando modelagem dos peptídeos. Em uma comparação do mapa de densidade eletrônica obtido de ambos complexos com um mapa de uma estrutura nativa de ImpA (70-529) coletada à 2,0Å de resolução, a qual usualmente apresenta um peptídeo “contaminante” no sitio de ligação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Clonagem, expressão e purificação de três mutantes truncados da proteína LaRPA-1 de Leishmania amazonensis

A leishmaniose é uma doença que atinge milhões de pessoas no mundo e, de acordo com a FUNASA, está se espalhando por todas as regiões do Brasil. O tratamento desta zoonose é ineficaz, pois os fármacos utilizados apresentam muitos efeitos colaterais e colaboram com o aparecimento de parasitas e vetores resistentes. Portanto um maior conhecimento sobre a biologia molecular destes protozoários poderá facilitar o descobrimento de novas terapias e desenvolvimento de drogas antiparasitárias. O complexo telomérico é formado pela interação de DNA com proteínas, sendo que estas últimas podem também interagir entre si. A proteína RPA de eucariotos compreende um complexo trimérico subdividido em três subunidades. Este cumpre independentemente ou juntamente com outras proteínas diversas funções vitais para a célula, entre elas, auxiliar na manutenção dos telômeros e ajudar a recrutar a telomerase. Além disso, ela parece ser um dos principais componentes do complexo de proteínas que interagem com o terminal simples fita telomérico de protozoários tripanosomatídeos. Curiosamente, em Leishmania spp., as subunidades 2 e 3, ao contrário da subunidade 1 da RPA, não fazem parte do complexo telomérico. Portanto a LaRPA-1 pode apresentar comportamentos peculiares quando comparada a RPA dos outros eucariotos, e se tornar um importante alvo ao se estudar a biologia molecular do parasita. Este trabalho tem como objetivo clonar, expressar e purificar os três diferentes mutantes truncados da proteína LaRPA-1 para, futuramente, utilizar-se estas proteínas recombinantes como ligantes em ensaios de interação proteína:proteína, visando mapear possíveis sítios ou domínios na proteína LaRPA-1.O gene que codifica LaRPA-1 já encontrava-se clonado e sequenciado no laboratório de Telômeros da UNESP de Botucatu....(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Clonagem, Expressão e Purificação da Proteína Telomérica LaTRF em sistema bacteriano (pMAL)

As proteínas da família TRF2 (“TTAGGG repeat-binding factor 2”) fazem parte de complexos multiprotéicos responsáveis pela manutenção dos telômeros de alguns eucariotos. Elas apresentam domínios funcionais que a caracterizam como proteínas que interagem com DNA telomérico na forma de dupla fita. São eles, o domínio de interação com o DNA do tipo Myb-like, localizado na porção C-terminal, um domínio acídico N-terminal e um domínio de homodimerização TRFH (“TRF homology domain for homodimerization”). A proteína TRF2 também está envolvida na formação de estruturas teloméricas terminais denominadas “t-loops”. O intuito deste projeto é a clonagem, expressão em vetor bacteriano (pMAL) e a purificação de uma proteína homóloga as proteínas teloméricas TRFs humana em parasitas do gênero Leishmania, especificamente a espécie Leishmania amazonensis (LaTRF). Primeiramente foram desenhados iniciadores (primers) utilizados para a amplificação da sequência LaTRF por PCR. O(s) produto(s) de amplificação foram clonados em vetores de clonagem para produtos de PCR e sequenciados para análise. Uma vez obtida a seqüência da LaTRF, o inserto contendo o gene foi subclonado direcionalmente e na mesma fase de leitura do vetor de expressão bacteriano (pMAL-c5x, NEB) para obtenção e futura purificação da proteína recombinante. Verificou-se a expressão da proteína recombinante LaTRF utilizando SDS-PAGE e “Western Blot”. Pelos resultados obtidos na análise de expressão em pequena escala da proteína recombinante, foi observado possíveis indícios de que esta esteja sendo expressa. Com isso, torna-se possível a tentativa de uma expressão em grande escala utilizando esse mesmo sistema bacteriano (pMAL) a fim de se obter a proteína purificada que poderá ser futuramente utilizada para ensaios de “pull-down” dentre outras aplicações

Obtenção de uma nova proteína recombinante componente do complexo telemérico LAGT1 de Leishmania Amazonensis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

O papel da proteína TET2 no enriquecimento do DNA genômico em 5-hidroximetilcitosina em lesões elanocíticas pré-malignas e pré-metastáticas com fenótipo stem cell-like

Durante a transformação maligna dos melanócitos, padrões de metilação do DNA encontram-se alterados, afetando a expressão gênica. As citosinas metiladas (5mC) podem ser hidroxiladas pelas dioxigenases dependentes de 2-oxoglutarato e Fe(II), Tet1, 2 e 3, resultando na formação de 5-hidroximetilcitosina (5hmC) (Globisch et al., 2010; Ko et al., 2010). A 5hmC pode agir tanto como um produto intermediário na desmetilação ativa do DNA quanto na desmetilação passiva ao longo de sucessivas replicações, o que pode contribuir com a dinâmica da metilação do DNA (Tahiliani et al., 2009). Além disso, demonstrou-se que Tet1 e Tet2 são expressas em células tronco embrionárias (Ito et al., 2010) e que 5hmC desempenha importante papel na manutenção e diferenciação destas células (Koh et al., 2011). No entanto, o papel da 5hmC e das proteínas Tet tanto na fisiologia normal quanto em doenças como o câncer ainda não está claro. Utilizando um modelo linear de progressão do melanoma, observamos aumento na expressão gênica de Tet1 nas linhagens celulares correspondendo a melanócitos pré-malignos (4C) e células de melanoma não metastático (4C11-), comparado a melanócitos não tumorigênicos (melan-a) e células de melanoma metastático (4C11+). Em relação à expressão proteica, há um aumento da expressão de Tet1 nas linhagens 4C e 4C11+, o que pode ser relacionado às fases de transição epitélio-mesênquima (EMT) e mesênquima-epitélio (MET), respectivamente. Além disso, constatamos aumento na expressão gênica e proteica de Tet2 na linhagem metastática 4C11+, o que pode indicar diferenças funcionais entre as proteínas Tet1 e Tet2. Também verificamos aumento significativo do conteúdo de 5hmC na linhagem 4C11+, o que se correlaciona com maior expressão gênica e proteica de Tet2. Por fim, linhagens humanas de melanoma metastático menos agressivas apresentaram aumento significativo na expressão dos genes TET1 ...

Análise funcional da proteína 14-3-3 de Paracoccidioides brasiliensis e prospecção de alvos terapêuticos inibidores da interação de P. brasiliensis à pneumócitos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)