Avaliação da expressão das moléculas HLA de classe I não clássicas HLA-G E HLA-E em espécimes gástricas de pacientes acometidos com a bactéria Helicobacter Pylori

The expression of human leukocyte antigen G (HLA-G) and human leukocyte antigen E (HLA-E) in physiological and pathological processes remains unknown, it is believed that these molecules play a fundamental role in the establishment and maintenance of immune tolerance by inhibiting the functions of immunocompetent cells. In literature we found no published study involving the bacterium Helicobacter pylori (H. pylori) with expression of HLA-G and HLA-E. The objective this study is investigated the expression of this protein in gastric biopsies of patients with the bacterium H. pylori. Sixty-four biopsies of the patients with diagnosis of infection by H. pylori were evaluated to expression of HLA-G and HLA-E. The samples were stratified according to the presence of carcinoma or peptic ulcers. Patients without H. pylori were used to control. To investigate the expression of this protein were used immunohistochemistry technique with monoclonal antibody anti-HLA-G and anti-HLA-E. Other criteria such as analysis of the inflammatory infiltrate (hematoxylin-eosin) and identification of H. pylori (Giemsa) were analyzed. We detected HLA-G and HLA-E molecules in the most samples containing ulcer and gastric carcinoma. In negative control group was not detected the presence of HLA-G and HLA-E. The presence of H. pylori seems modulate the expression of HLA-G and HLA-E, favoring the evolution of infection, giving different degrees of gastric lesion in epithelium of these patients

NO EVIDENCE of PATHOLOGICAL AUTOIMMUNITY FOLLOWING MYCOBACTERIUM LEPRAE HEAT-SHOCK PROTEIN 65-DNA VACCINATION IN MICE

Heat-shock proteins (HSPs) are currently one of the most promising targets for the development of immunotherapy against tumours and autoimmune disorders. This protein family has the capacity to activate or modulate the function of different immune system cells. They induce the activation of monocytes, macrophages and dendritic cells, and contribute to cross-priming, an important mechanism of presentation of exogenous antigen in the context of MHC class I molecules, These various immunological properties of HSP have encouraged their use in several clinical trials. Nevertheless, an important issue regarding these proteins is whether the high homology among HSPs across different species may trigger the breakdown of immune tolerance and induce autoimmune diseases. We have developed a DNA vaccine codifying the Mycobacterium leprae Hsp65 (DNAhsp65), which showed to be highly immunogenic and protective against experimental tuberculosis. Here, we address the question of whether DNAhsp65 immunization could induce pathological autoimmunity in mice. Our results show that DNAhsp65 vaccination induced antibodies that can recognize the human Hsp60 but did not induce harmful effects in 16 different organs analysed by histopathology up to 210 days after vaccination. We also showed that anti-DNA antibodies were not elicited after DNA vaccination. The results are important for the development of both HSP and DNA-based immunomodulatory agents.

The influence of dietary vitamin C and E supplementation on the physiological response of pirarucu, Arapaima gigas, in net culture

This study evaluated the efficacy of dietary vitamin C (ascorbic acid or AA), vitamin E (α-tocopherol or α-T), and C + E supplementation on the blood parameters of Arapaima gigas grown in net cages for 45 days. Four treatments were tested: control (commercial feed); C800; E500 and C + E (800 + 500) with supplementation of 800 mg AA kg- 1, 500 mg α-T kg- 1 and 800 + 500 mg AA + α-T kg- 1, respectively. Hematocrit (Ht), red blood cells (RBC), and hemoglobin concentration (Hb) (oxidative status indicators), thrombocytes and leukocytes (immunological indicators), plasma protein and glucose were evaluated. Fish fed vitamin C and C + E supplemented diets showed greater weight gain and survival. Dietary vitamin C and C + E diet supplementation resulted in increased Ht, Hb, RBC, MCHC, total leukocytes, total proteins, thrombocytes and eosinophils compared to the control and α-T. The α-tocopherol-supplemented diet reduced the number of total thrombocytes, lymphocytes and neutrophils and increased glucose and eosinophils relatively to the control. In general, leukocytes and thrombocytes were good indicators of the efficiency of vitamin on the defense mechanism of the A. gigas reared in cages. Results indicate that high α-T diet supplementation provides no benefit for the maintenance of the oxidative or the immunological status of A. gigas. However, it was demonstrated that high dietary AA improves A. gigas immunological status. Red blood cell indices and immune system indicators showed no synergistic effect between the vitamins after supplementing the A. gigas diet with α-T + AA. © 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.

Tumor-associated macrophages and the profile of inflammatory cytokines in oral squamous cell carcinoma

Objective: To evaluate and characterize macrophage populations (M1/M2) in the tumor microenvironment of oral cavity squamous cell carcinoma (OCSCC). The relationship between macrophages and clinicopathological factors, such as survival data, lymph node metastasis, tumoral proliferation, and WHO histological grading are also analyzed. Materials and methods: The samples consisted of surgically excised specimens from patients with non-metastatic and metastatic OCSCC and normal oral mucosa (control). Immunohistochemistry, flow cytometry, and qRT-PCR were used to evaluate macrophage populations and the expression of pro- (IL-12, IL-23, and INF-γ) and anti-inflammatory (IL-10 and TGF-β) cytokines. The level required for statistical significance was defined as p < 0.05. Results: The data showed a predominance of M2 phenotype (high percentage of IL-10+TGF-β+) macrophages in the tumor microenvironment of OCSCC. A higher percentage of macrophages expressing TGF-β was seen in the OCSCC group when compared with healthy individuals. The assessment of mRNA expression also presented a greater expression of anti-inflammatory cytokines TGFβ and IL10 in OCSCC when compared with the control group. The percentage of macrophages, demonstrated by immunohistochemistry, was significantly higher in the metastatic OCSCC group than in the non-metastatic and control groups. The log-rank test also showed that the mean survival time for patients with high levels of macrophages was less (44 months) when compared with patients with a low percentage of such cells (93 months). Conclusion: A predominance of the M2 phenotype in the tumor microenvironment of OCSCC could contribute to local immunosuppression, via TGF-β production, and consequently greater lymph node involvement and reduced patient survival time. © 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Antígenos leucocitários humanos não-clássicos HLA-G e HLA-E em lesões benignas, pré-malignas e malignas de laringe associadas à infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Worldwide genetic variation at the 3 ' untranslated region of the HLA-G gene: balancing selection influencing genetic diversity

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Análise do polimorfismo da região 3’não traduzida (3’NT) do gene HLA-G de pacientes com esclerose múltipla e neuromielite óptica da região noroeste do estado de São Paulo

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Transcriptional response to GAA deficiency (Pompe disease) in infantile-onset patients

Pompe disease is a genetic disorder resulting from a deficiency of lysosomal acid alpha-glucosidase (GAA) that manifests as a clinical spectrum with regard to symptom severity and rate of progression. In this study, we used microarrays to examine gene expression from the muscle of two cohorts of infantile-onset Pompe patients to identify transcriptional differences that may contribute to the disease phenotype. We found strong similarities among the gene expression profiles generated from biceps and quadriceps, and identified a number of signaling pathways altered in both cohorts. We also found that infantile-onset Pompe patient muscle had a gene expression pattern characteristic of immature or regenerating muscle, and exhibited many transcriptional markers of inflammation, despite having few overt signs of inflammatory infiltrate. Further, we identified genes exhibiting correlation between expression at baseline and response to therapy. This combined dataset can serve as a foundation for biological discovery and biomarker development to improve the treatment of Pompe disease. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.

Are the severe injuries of cutaneous leishmaniasis caused by an exacerbated Th1 response?

American tegumentary leishmaniasis (ATL) is a disease whose clinical features are strongly related to the type of immune response it induces. Herein we report an atypical presentation of cutaneous leishmaniasis in a woman with a severe and extensive sore located in her leg, and we describe the differences between the usual local immune response in ATL and the local immune response in this patient. We observed an intense inflammatory response characterized by Th1 cells and cytokines with conspicuous expression of Toll-like receptor 3 (TLR-3). Few parasites were present, but there was an extensive tissue damage. We also discuss the immunological factors that could be related to the atypical presentation.

Espressione dell'Enzima ad Azione Immunoregolatoria Indoleamina 2,3-Diossigenasi nella Leucemia Mieloide Acuta dell'Adulto: correlazioni Clinico-Biologiche

L’enzima IDO interviene nella via di degradazione del triptofano, essenziale per la vita cellulare; l’iperespressione di IDO favorisce la creazione di un microambiente immunotollerante. Nelle LAM IDO è funzionalmente attivo nelle cellule blastiche e determina l’acquisizione di un fenotipo regolatorio da parte delle cellule T alloreattive; l’espressione della proteina aumenta in modo consensuale con l’evoluzione clinica della patologia. Scopo della Tesi è indagare l’esistenza di una correlazione tra l’iperespressione di IDO da parte delle cellule leucemiche, le caratteristiche di rischio alla diagnosi e l’outcome dei pazienti. Sono stati esaminati 45 pazienti adulti affetti da LAM afferiti all’Istituto di Ematologia di Bologna. I pazienti sono stati stratificati a seconda di: età di insorgenza della leucemia, secondarietà a Mielodisplasia o radio chemioterapia, iperleucocitosi, citogenetica, biologia molecolare (sono state valutate le alterazioni a carico dei geni FLT3 ed NPM). I pazienti sono stati analizzati per l’espressione del gene IDO mediante RT-PCR, seguita da Western Blot, allo scopo di stabilire la presenza di una proteina attiva; successivamente si è proceduto a verificare l’esistenza di una correlazione tra l’espressione di IDO e le caratteristiche di rischio alla diagnosi per identificare una relazione tra l’espressione del gene ed un subset di pazienti a prognosi favorevole o sfavorevole. Dei 45 pazienti adulti affetti da LAM il 28,9% è risultato negativo per l’espressione di IDO, mentre il rimanente 71,1% è risultato positivo ed è stato suddiviso in tre ulteriori categorie, in base ai livelli di espressione. I dati non sembrano al momento suggerire l’esistenza di una correlazione tra l’espressione di IDO e le caratteristiche di rischio alla diagnosi. Nel gruppo di pazienti ad elevata espressione di IDO si riscontra un rate di resistenza alla chemioterapia di induzione più elevato, con una quota di pazienti resistenti pari al 71,4%, contro il 23,1% nel gruppo di pazienti IDO-negativi.

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schlüsselmolekül zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine große Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in frühen Phasen als Tumorsuppressor, währenddessen es in späten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher für ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Spleißform des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. Für diese Spleißform konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Überexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine veränderte Lokalisation der Smurf2 Spleißformen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Spleißen des Exons2 führte dabei zu Änderungen der Topologie der N-terminalen C2-Domäne, wodurch sich eine veränderte Lokalisation in der Zelle beschreiben ließ. Mit der veränderten intrazellulären Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine Änderung. So konnte überraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine Überexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verstärkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegenüber TGF-beta. Dies führte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse bestätigt werden konnte, daß das dE2Smurf2 nach Überexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abhängig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, daß durch die höhere Sensitivität gegenüber TGF-beta naive T-Zellen unter Einfluß von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, daß die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INFγ produzierten.So zeigten in vivo Versuche, daß die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entzündung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine stärkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INFγ und Granzym B erklärt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten Mäuse, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant stärkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer Überproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erklärt werden. Klonierungsexperimente führten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell über die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein für die Modulation von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn

Acquired factor XIII deficiency: a therapeutic challenge

Less than 60 cases of acquired factor (F)XIII deficiencies have been reported, most having distinct clinical features. To illustrate the therapeutic challenges of acquired FXIII inhibitors, we report a case of a 65-year-old patient with no previous bleeding history who suddenly developed massive haemorrhages associated to a strong and isolated FXIII inhibitor. No underlying disorder has been detected till now after three years of follow-up. Despite aggressive treatment with prednisone, rituximab, cyclophosphamide, immunoglobulin, immunoadsorption and immune tolerance his inhibitor is still present, although at low titre and with a clinical benefit since the patient has no more bleed since more than one year. Moreover the patient had a venous thromboembolic complication. After a review of the management of acquired FXIII deficiency patients and based on the management of acquired haemophilia we discuss a possible strategy for such difficult cases.

Exosomes

Exosomes are small natural membrane vesicles released by a wide variety of cell types into the extracellular compartment by exocytosis. The biological functions of exosomes are only slowly unveiled, but it is clear that they serve to remove unnecessary cellular proteins (e.g., during reticulocyte maturation) and act as intercellular messengers because they fuse easily with the membranes of neighboring cells, delivering membrane and cytoplasmic proteins from one cell to another. Recent findings suggests that cell-derived vesicles (exosomes are also named membranous vesicles or microvesicles) could also induce immune tolerance, suppression of natural killer cell function, T cell apoptosis, or metastasis. For example, by secreting exosomes, tumors may be able to accomplish the loss of those antigens that may be immunogenic and capable of signaling to immune cells as well as inducing dysfunction or death of immune effector cells. On the other hand, dendritic cell-derived exosomes have the potential to be an attractive powerful immunotherapeutic tool combining the antitumor activity of dendritic cells with the advantages of a cell-free vehicle. Although the full understanding of the significance of exosomes requires additional studies, these membrane vesicles could become a new important component in orchestrating responses between cells.

[Implantation: physiology, pathology and therapeutic options in disorders of implantation]

So far, implantation is a poorly understood process, which involves several paradoxical cell-biological mechanisms. First, 50% of the embryo is paternal and immunologically foreign material, and second, both the endometrium and embryo are covered by epithelial tissue to prevent cellular fusion. The adhesion and invasion of the blastocyst require an accurate coordination of embryonic and endometrial physiology and the modulation of maternal immune tolerance. Endometrial function plays an important role in assisted reproduction. Pathologies such as fibroids, hydrosalpinges, endometriosis and the polycystic ovary syndrome have a significant negative impact on implantation but can be treated in most cases. Therapeutic strategies to improve endometrial and embryonic function in recurrent implantation disorders are however still controversially discussed.