Biogénèse des lipoprotéines de haute densité (HDL): implication du transporteur ABCA1

Les patients atteints de la maladie de Tangier présentent des niveaux très bas de lipoprotéines de haute densité (HDL), un facteur de risque pour le développement des maladies cardiovasculaires. In vivo, les HDL ont un effet protecteur important contre l’athérosclérose puisqu’elles effectuèrent le transport à rebours du cholestérol des tissus périphériques vers le foie. Or, la maladie de Tangier est causée par des mutations dans le gène du transporteur « ATP-binding cassette A1 » (ABCA1). Le modèle actuel stipule que ce transporteur assure la lipidation de l’apolipoprotéine A-I (apoA-I), la composante protéique majeure des HDL, pour former des particules HDL naissantes discoïdales. Un défaut dans la lipidation de l’apoA-I par l’ABCA1 abolit la biogénèse des HDL. Nous avons voulu étudier les sites d’interaction de l’ABCA1 avec son ligand (l’apoA-I), les voies de biogénèse impliquées, et l’implication des pré-β-HDL dans l’efflux du cholestérol par la voie de l’ABCA1. D’abord, nous avons utilisé un système de culture cellulaire (fibroblastes humaines et BHK-ABCA1-inductible) afin de déterminer les sites de liaison cellulaires de l’apoA-I, leurs localisations et l’implication de l’ABCA1. Nous avons trouvé que la majorité de l’apoA-I n’est pas associée à l’ABCA1 et, deux tiers de cet apoA-I, était à la membrane plasmique. Ensuite, Une étude plus détaillée examinait les voies de lipidation de l’apoA-I, soit au niveau de la membrane plasmique (MP), soit aux compartiments intracellulaires (CICs). Nous avons montré que la lipidation de l’apoA-I a lieu aux deux niveaux (MP et CICs) selon deux voies différentes cinétiquement. Finalement, nous avons montré que les pré-β-HDL effluent aussi (efficacement que l’apoA-I) le cholestérol par la voie de l’ABCA1. Ces observations réunies démontrent que 1) la majorité de l’apoA-I s’est trouvé non-associée à l’ABCA1; 2) deux tiers de l’apoA-I s’associent a la membrane plasmique; 3) la lipidation de l’apoA-I se fait en partie à la membrane plasmique et, par la voie de retro-endocytose du complexe apoA-I/ABCA1.

Étude du mécanisme de régulation de la sénescence et de p53 par la protéine SOCS1

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide.

Rôle de l’acétylation/déacétylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes de la COX-2, iNOS et mPGES-1 dans les tissus articulaires.

L’arthrose ou ostéoarthrose (OA) est l’affection rhumatologique la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée principalement par une perte du cartilage articulaire et l’inflammation de la membrane synoviale. L’interleukine (IL)-1ß, une cytokine pro-inflammatoire, joue un rôle très important dans la pathogenèse de l’OA. Elle exerce son action en induisant l’expression des enzymes cyclo-oxygénase 2 (COX-2), prostaglandine E synthétase microsomale 1 (mPGES-1) et l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) ainsi que la production de la prostaglandine E2 (PGE2) et de l’oxyde nitrique (NO). Ces derniers (PGE2 et NO) contribuent à la synovite et la destruction du cartilage articulaire par leurs effets pro-inflammatoires, pro-cataboliques, anti-anaboliques, pro-angiogéniques et pro-apoptotiques. Les modifications épigénétiques, telles que la méthylation de l’ADN, et l’acétylation et la méthylation des histones, jouent un rôle crucial dans la régulation de l’expression des gènes. Parmi ces modifications, l’acétylation des histones est la plus documentée. Ce processus est contrôlé par deux types d’enzymes : les histones acétyltransférases (HAT) qui favorisent la transcription et les histones déacétylases (HDAC) qui l’inhibent. L’objectif de ce travail est d’examiner le rôle des enzymes HDAC dans la régulation de l’expression de la COX-2, mPGES-1 et iNOS. Nous avons montré qu’au niveau des chondrocytes, les inhibiteurs des HDAC (iHDAC), trichostatine A (TSA) et butyrate de sodium (NaBu), suppriment l’expression de la COX-2 et iNOS au niveau de l’ARNm et protéique, ainsi que la production de la PGE2 et du NO, induites par l’IL-1ß. L’effet inhibiteur à lieu sans affecter l’activité de liaison à l’ADN du facteur de transcription NF-κB (nuclear factor κ B). La TSA et le NaBu inhibent également la dégradation induite par l’IL-1ß des protéoglycanes au niveau du cartilage. Nous avons également montré, qu’au niveau des fibroblastes synoviaux, les iHDAC, TSA, NaBu et acide valproïque (VA), suppriment l’expression de la mPGES-1 ainsi que la production de la PGE2 induites par l’IL-1ß. En utilisant diverses approches expérimentales, nous avons montré que HDAC4 est impliquée dans l’induction de l’expression de la mPGES-1 par l’IL-1ß. HDAC4 exerce son action, via son activité déacétylase, en augmentant l’activité transcriptionnelle de Egr-1 (early growth factor 1), facteur de transcription principal de l’expression de la mPGES-1. L’ensemble de ces résultats suggère que les inhibiteurs des HDAC pourraient être utilisés dans le traitement de l’OA.

The role of Microsomal prostaglandin synthase-1 (mPGES-1) and Ephrin B2 in Scleroderma

La sclérodermie (sclérose systémique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée  par  l’épaississement  de  la  peau,  l’apparition  spontanée de lésions cicatricielles, des maladies   des   vaisseaux   sanguins,   divers   degrés   d’inflammation,   en   association   avec   un   système   immunitaire hyperactif. La pathogénèse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement approprié   n’est   disponible.   La fibrose est un élément distinctif de la maladie de ScS et est considérée   résulter   d’une   incapacité   à   mettre   fin   de   façon   appropriée   à   la   réponse   normale   de   réparation   des   plaies.   L’analyse   histologique   du   stade   initial   de   la   ScS   révèle   une   infiltration   périvasculaire de cellules mononucléaires dans le derme, associée à une synthèse accrue de collagène dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la compréhension des moyens de contrôler le stade inflammatoire de la ScS pourrait être bénéfique pour contrôler la progression de la maladie peu après son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygénase (COX) pour catalyser spécifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1  joue  un  rôle  clé  dans  l’inflammation,  la  douleur  et  l’arthrite;;  toutefois,  le   rôle de la mPGES-1 dans les mécanismes de fibrose, spécifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a précédemment montré que les souris à mPGES-1 nulle sont résistantes à la fibrose   cutanée   induite   par   la   bléomycine,   à   l’inflammation,   à   l’épaississement  cutané,  à  la  production  de  collagène  et  à  la  formation  de  myofibroblastes.  Sur  la   base  de  ces  résultats,  j’ai  formulé  l’hypothèse  que  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 régulera à la baisse la production de médiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie   de   ScS.   Afin   d’explorer   le   rôle   de   la   mPGES-1   dans   l’inflammation   et   la   fibrose   associées  à  la  maladie  de  ScS,  j’ai  d’abord  examiné  l’expression  de  la  mPGES-1 dans la peau normale comparativement à des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes résultats ont montré que la mPGES-1 est nettement élevée dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 dérivés de la mPGES-1 étaient également significativement plus élevés dans les fibroblastes cutanés isolés de patients  atteints  de  ScS  comparativement  aux  fibroblastes  isolés  de  témoins  sains.  J’ai  également   étudié  l’effet  de  l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1  sur  l’expression  de  marqueurs  pro- fibreux.   Mes   études   ont   montré   que   l’expression   de   médiateurs   pro-fibreux clés (α-SMA, endothéline-1, collagène de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est élevée dans les fibroblastes cutanés ScS en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de réduire significativement l’expression  de  l’α-SMA,  de  l’endothéline-1, du collagène de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes  ScS,  sans  effet  significatif  sur  les  fibroblastes  normaux.  J’ai  en  outre  examiné  l’effet   de  l’inhibition  de  la  mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires clés impliquées dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1.  L’inhibition  pharmacologique  de  la  mPGES- 1 a eu pour effet de réduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lésion ScS comparativement à des fibroblastes non traités. De plus, les patients atteints de ScS ont présenté des niveaux plus élevés de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. L’inhibiteur  de  la  mPGES-1 a pu réguler à la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3,  dans  les  fibroblastes  ScS.  Ces  résultats  ont  suggéré  que  l’inhibition   de la mPGES-1 pourrait être une méthode viable pour réduire le développement de sclérose cutanée et constituent une cible thérapeutique potentielle pour contrôler les mécanismes fibreux et inflammatoires associés à la pathophysiologie de la maladie de ScS. L’un   des   autres   processus   critiques   reliés   à   l’évolution de la réponse fibreuse associée à la maladie de ScS est la différenciation des fibroblastes en des cellules activées spécialisées iii iv appelées myofibroblastes, responsables de déclencher une signalisation adhésive excessive et le dépôt excessif de matrice extracellulaire,   conduisant   à   la   destruction   de   l’architecture   de   l’organe.   Ainsi,   l’identification   des   facteurs   endogènes   qui   initient/   favorisent   la   différenciation   fibroblaste-myofibroblaste peut mener à des stratégies thérapeutiques prometteuses pour contrôler  l’excès  de  signalisation  adhésive  et  de  fibrose  associé  à  la  maladie  de  ScS.  Des  études   antérieures  dans  le  domaine  de  la  biologie  du  cancer  ont  suggéré  que  l’éphrine  B2,  une  protéine   transmembranaire appartenant à la famille des éphrines, est impliquée dans la signalisation adhésive   et   le   remodelage   extracellulaire.   Cependant,   son   rôle   dans   la   fibrose   n’a   jamais   été   exploré.   Dans   la   deuxième   partie   de   mon   étude,   j’ai   donc   étudié   le   rôle   de   l’éphrine   B2   dans   la   fibrose.   Mes   études   montrent   que   l’expression   de   l’éphrine   B2   est   significativement   augmentée   dans la peau humaine ScS comparativement à la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de   fibroblastes   de   la   peau   humaine   normale   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractéristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de  fibres  de  tension,  des  adhérences  focales,  l’activation  accrue  de  la  FAK,  un  accroissement  de   l’expression  et  de  la  migration  de  fibroblastes  et  de  leur  adhérence  à  la  fibronectine  à  la  fois  chez   les   fibroblastes   cutanés   normaux   et   ScS.   En   outre,   j’ai   traité   des   souris   avec   de   l’éphrine   B2   recombinante et montré que ces souris ont développé une fibrose cutanée significative associée à une épaisseur dermique et à une synthèse de collagène augmentées, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagène) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de   l’α-SMA, une activation augmentée de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagène de type 1 et le FCTC. Dans  l’ensemble,  mes  études  ont  identifié  deux  médiateurs  endogènes  cruciaux  impliqués  dans  la   propagation  de  l’inflammation  et  de  la  fibrose  associées  à  la  maladie  de  ScS.  L’inhibition  de  la   mPGES-1   pourrait   représenter   une   bonne   stratégie   alternative   pour   contrer   l’inflammation   et   la   fibrose au moins durant les stades précoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive   de   l’éphrine B2 favorise la signalisation adhésive et fibreuse en déclenchant la différenciation   de   fibroblastes   en   myofibroblastes   par   l’activation   de   la   voie   de   signalisation   de   la  FAK.  Ainsi,  l’inhibition  d’éphrine  B2  bloquera  la  formation  de  fibroblastes-myofibroblastes et régulera à la baisse la fibrose associée à la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1  et  l’éphrine   B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont reliés.

Efecto de la hipoxia-reoxigenación y las radiaciones ionizantes en la captación de glucosa en líneas tumorales de seno y colon cocultivadas con células endoteliales.

La captación de glucosa y su conversión en lactato juega un papel fundamental en el metabolismo tumoral, independientemente de la concentración de oxígeno presente en el tejido (efecto Warburg). Sin embrago, dicha captación varía de un tipo tumoral a otro, y dentro del mismo tumor, situación que podría depender de las características microambientales tumorales (fluctuaciones de oxígeno, presencia de otros tipos celulares) y de factores estresores asociados a los tratamientos. Se estudió el efecto de la hipoxia-reoxigenación (HR) y las radiaciones ionizantes (RI) sobre la captación de glucosa, en cultivos de líneas tumorales MCF-7 y HT-29, cultivadas de forma aislada o en cocultivo con la línea celular EAhy296. Se encontró que la captación de glucosa en HR es diferente para lo descrito en condiciones de hipoxia permanente y que es modificada en el cocultivo. Se identificaron poblaciones celulares dentro de la misma línea celular, de alta y baja captación de glucosa, lo que implicaría una simbiosis metabólica de la célula como respuesta adaptativa a las condiciones tumorales. Se evaluó la expresión de NRF2 y la translocación nuclear de NRF2 y HIF1a, como vías de respuesta a estrés celular e hipoxia. La translocación nuclear de las proteínas evaluadas explicaría el comportamiento metabólico de las células tumorales de seno, pero no de colon, por lo cual deben existir otras vías metabólicas implicadas. Las diferencias en el comportamiento de las células tumorales en HR en relación con hipoxia permitirá realizar planeaciones dosimétricas más dinámicas, que reevalúen las condiciones de oxigenación tumoral constantemente.

Inducible hydrogen sulfide synthesis in chondrocytes and mesenchymal progenitor cells: is H2S a novel cytoprotective mediator in the inflamed joint?

Hydrogen sulfide (H(2)S) has recently been proposed as an endogenous mediator of inflammation and is present in human synovial fluid. This study determined whether primary human articular chondrocytes (HACs) and mesenchymal progenitor cells (MPCs) could synthesize H(2)S in response to pro-inflammatory cytokines relevant to human arthropathies, and to determine the cellular responses to endogenous and pharmacological H(2)S. HACs and MPCs were exposed to IL-1β, IL-6, TNF-α and lipopolysaccharide (LPS). The expression and enzymatic activity of the H(2)S synthesizing enzymes cystathionine-β-synthase (CBS) and cystathionine-γ-lyase (CSE) were determined by Western blot and zinc-trap spectrophotometry, respectively. Cellular oxidative stress was induced by H(2)O(2), the peroxynitrite donor SIN-1 and 4-hydroxynonenal (4-HNE). Cell death was assessed by 3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays. Mitochondrial membrane potential (DCm) was determined in situ by flow cytometry. Endogenous H(2) S synthesis was inhibited by siRNA-mediated knockdown of CSE and CBS and pharmacological inhibitors D,L-propargylglycine and aminoxyacetate, respectively. Exogenous H(2)S was generated using GYY4137. Under basal conditions HACs and MPCs expressed CBS and CSE and synthesized H(2)S in a CBS-dependent manner, whereas CSE expression and activity was induced by treatment of cells with IL-1β, TNF-α, IL-6 or LPS. Oxidative stress-induced cell death was significantly inhibited by GYY4137 treatment but increased by pharmacological inhibition of H(2)S synthesis or by CBS/CSE-siRNA treatment. These data suggest CSE is an inducible source of H(2)S in cultured HACs and MPCs. H(2)S may represent a novel endogenous mechanism of cytoprotection in the inflamed joint, suggesting a potential opportunity for therapeutic intervention.

Self-assembly and bioactivity of a polymer/peptide conjugate containing the RGD cell adhesion motif and PEG

The self-assembly and bioactivity of the peptide–polymer conjugate DGRFFF–PEG3000 containing the RGD cell adhesion motif has been examined, in aqueous solution. The conjugate is designed to be amphiphilic by incorporation of three hydrophobic phenylalanine residues as well as the RGD unit and a short poly(ethylene glycol) (PEG) chain of molar mass 3000 kg mol-1. Above a critical aggregation concentration, determined by fluorescence measurements, signals of b-sheet structure are revealed by spectroscopic measurements, as well as X-ray diffraction. At high concentration, a self-assembled fibril nanostructure is revealed by electron microscopy. The fibrils are observed despite PEG crystallization which occurs on drying. This suggests that DGRFFF has an aggregation tendency that is sufficiently strong not to be prevented by PEG crystallization. The adhesion, viability and proliferation of human corneal fibroblasts was examined for films of the conjugate on tissue culture plates (TCPs) as well as low attachment plates. On TCP, DGRFFF–PEG3000 films prepared at sufficiently low concentration are viable, and cell proliferation is observed. However, on low attachment surfaces, neither cell adhesion nor proliferation was observed, indicating that the RGD motif was not available to enhance cell adhesion. This was ascribed to the core–shell architecture of the self-assembled fibrils with a peptide core surrounded by a PEG shell which hinders access to the RGD unit.

Inactivation of the antibacterial and cytotoxic properties of silver ions by biologically relevant compounds

There has been a recent surge in the use of silver as an antimicrobial agent in a wide range of domestic and clinical products, intended to prevent or treat bacterial infections and reduce bacterial colonization of surfaces. It has been reported that the antibacterial and cytotoxic properties of silver are affected by the assay conditions, particularly the type of growth media used in vitro. The toxicity of Ag+ to bacterial cells is comparable to that of human cells. We demonstrate that biologically relevant compounds such as glutathione, cysteine and human blood components significantly reduce the toxicity of silver ions to clinically relevant pathogenic bacteria and primary human dermal fibroblasts (skin cells). Bacteria are able to grow normally in the presence of silver nitrate at >20-fold the minimum inhibitory concentration (MIC) if Ag+ and thiols are added in a 1:1 ratio because the reaction of Ag+ with extracellular thiols prevents silver ions from interacting with cells. Extracellular thiols and human serum also significantly reduce the antimicrobial activity of silver wound dressings Aquacel-Ag (Convatec) and Acticoat (Smith & Nephew) to Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli in vitro. These results have important implications for the deployment of silver as an antimicrobial agent in environments exposed to biological tissue or secretions. Significant amounts of money and effort have been directed at the development of silver-coated medical devices (e.g. dressings, catheters, implants). We believe our findings are essential for the effective design and testing of antimicrobial silver coatings.

Self-assembly of a dual functional bioactive peptide amphiphile incorporating both matrix metalloprotease substrate and cell adhesion motifs

We describe a bioactive lipopeptide that combines the capacity to promote the adhesion and subsequent self-detachment of live cells, using template-cell-environment feedback interactions. This self-assembling peptide amphiphile comprises a diene-containing hexadecyl lipid chain (C16e) linked to a matrix metalloprotease-cleavable sequence, Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln, and contiguous with a cell-attachment and signalling motif, Arg-Gly-Asp-Ser. Biophysical characterisation revealed that the PA self-assembles into 3 nm diameter spherical micelles above a critical aggregation concentration (cac). In addition, when used in solution at 5–150 nM (well below the cac), the PA is capable of forming film coatings that provide a stable surface for human corneal fibroblasts to attach and grow. Furthermore, these coatings were demonstrated to be sensitive to metalloproteases expressed endogenously by the attached cells, and consequently to elicit the controlled detachment of cells without compromising their viability. As such, this material constitutes a novel class of multi-functional coating for both fundamental and clinical applications in tissue engineering.

Supra-molecular assembly of a lumican-derived peptide amphiphile enhances its collagen-stimulating activity

C16-YEALRVANEVTLN, a peptide amphiphile (PA) incorporating a biologically active amino acid sequence found in lumican, has been examined for its influence upon collagen synthesis by human corneal fibroblasts in vitro, and the roles of supra-molecular assembly and activin receptor-like kinase ALK receptor signaling in this effect were assessed. Cell viability was monitored using the Alamar blue assay, and collagen synthesis was assessed using Sirius red. The role of ALK signaling was studied by receptor inhibition. Cultured human corneal fibroblasts synthesized significantly greater amounts of collagen in the presence of the PA over both 7-day and 21-day periods. The aggregation of the PA to form nanotapes resulted in a notable enhancement in this activity, with an approximately two-fold increase in collagen production per cell. This increase was reduced by the addition of an ALK inhibitor. The data presented reveal a stimulatory effect upon collagen synthesis by the primary cells of the corneal stroma, and demonstrate a direct influence of supra-molecular assembly of the PA upon the cellular response observed. The effects of PA upon fibroblasts were dependent upon ALK receptor function. These findings elucidate the role of self-assembled nanostructures in the biological activity of peptide amphiphiles, and support the potential use of a self-assembling lumican derived PA as a novel biomaterial, intended to promote collagen deposition for wound repair and tissue engineering purposes

An adhesive elastomeric supramolecular polyurethane healable at body temperature

In this paper, we report the synthesis and healing ability of a non-cytotoxic supramolecular polyurethane network whose mechanical properties can be recovered efficiently (> 99%) at the temperature of the human body (37 ºC). Rheological analysis revealed an acceleration in the drop of the storage modulus above 37 ºC, on account of the dissociation of the supramolecular polyurethane network, and this decrease in viscosity enables the efficient recovery of the mechanical properties. Microscopic and mechanical characterisation has shown that this material is able to recover mechanical properties across a damage site with minimal contact required between the interfaces and also demonstrated that the mechanical properties improved when compared to other low temperature healing elastomers or gel-like materials. The supramolecular polyurethane was found to be non-toxic in a cytotoxicity assay carried out in human skin fibroblasts (cell viability > 94% and non-significantly different compared to the untreated control). This supramolecular network material also exhibited excellent adhesion to pig skin and could be healed completely in situ post damage indicating that biomedical applications could be targeted, such as artificial skin or wound dressings with supramolecular materials of this type.

Genetic diversity and toxic activity of Aggregatibacter actinomycetemcomitans isolates

Introduction: Very little is known of the diversity and expression of virulence factors of serotypes of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Toxic activity on Chinese hamster ovary (CHO) cells and cdt and ltx genotyping were evaluated in A. actinomycetemcomitans serotypes. Methods: Forty-one A. actinomycetemcomitans isolates were analysed for CHO cell growth inhibition. Genotyping was performed by polymerase chain reactions specific to the ltx promoter region, serotype-specific and cdt region and by sequencing of cdtB. Results: cdtABC was detected in 40 strains. Analysis of the cdtA upstream region revealed 10 cdt genotypes. Toxicity to CHO cells was detected for 92.7% of the isolates; however, no correlation between the toxic activity and the cdt genotype was detected. Serotype c was more prevalent among Brazilian samples (68.0%). Four serotype b isolates from subjects with aggressive periodontitis were associated with high leukotoxin production and exhibited moderate to strong toxic activity in CHO cells, but were classified in different cdt genotypes. High levels of toxicity in CHO cells were not associated with a particular serotype; 57.1% of serotype a isolates presented low toxicity to CHO cells whereas the highly toxic strains belonged to serotypes b and c. Sequencing of cdtB revealed a single nucleotide polymorphism of amino acid 281 but this was not related to the toxic activity in CHO cells. Conclusion: Differences in prevalence of the low and highly cytotoxic strains among serotypes reinforce the hypothesis that serotype b and c isolates of A. actinomycetemcomitans are more virulent than serotype a strains.

Increased Viability of Odontoblast-Like Cells Subjected to Low-Level Laser Irradiation

Studies have shown that the increase of cell metabolism depends on the low level laser therapy (LLLT) parameters used to irradiate the cells. However, the optimal laser dose to up-regulate pulp cell activity remains unknown. Consequently, the aim of this study was to evaluate the metabolic response of odontoblast-like cells (MDPC-23) exposed to different LLLT doses. Cells at 20000 cells/cm(2) were seeded in 24-well plates using plain culture medium (DMEM) and were incubated in a humidified incubator with 5% CO(2) at 37 degrees C. After 24 h, the culture medium was replaced by fresh DMEM supplemented with 5% (stress by nutritional deficit) or 10% fetal bovine serum (FBS). The cells were exposed to different laser doses from a near infrared diode laser prototype designed to provide a uniform irradiation of the wells. The experimental groups were: G1: 1.5 J/cm(2) + 5% FBS; G2: 1.5 J/cm(2) + 10% FBS; G3: 5 J/cm(2) + 5% FBS; G4: 5 J/cm(2) + 10% FBS; G5: 19 J/cm(2) + 5% FBS; G6: 19 J/cm(2) + 10% FBS. LLLT was performed in 3 consecutive irradiation cycles with a 24-hour interval. Non-irradiated cells cultured in DMEM supplemented with either 5 or 10% FBS served as control groups. The analysis of the metabolic response was performed by the MTT assay 3 h after the last irradiation. G1 presented an increase in SDH enzyme activity and differed significantly (Mann-Whitney test, p < 0.05) from the other groups. Analysis by scanning electron microscopy showed normal cell morphology in all groups. Under the tested conditions, LLLT stimulated the metabolic activity of MDPC-23 cultured in DMEM supplemented with 5% FBS and exposed to a laser dose of 1.5 J/cm(2). These findings are relevant for further studies on the action of near infrared lasers on cells with odontoblast phenotype.

Fibroblast functionality on novel Ti-30Ta nanotube array

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Porphyromonas gingivalis-mediated shedding of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) by oral epithelial cells: a potential role in inflammatory periodontal disease

Extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) or CD 147 is a transmembrane glycoprotein expressed by various cell types, including oral epithelial cells. Recent studies have brought evidence that EMMPRIN plays a role in periodontitis. In the present study, we investigated the effect of Porphyromonas gingivalis, a major pathogen in chronic periodontitis, on the shedding of membrane-anchored EMMPRIN and on the expression of the EMMPRIN gene by oral epithelial cells. A potential contribution of shed EMMPRIN to the inflammatory process of periodontitis was analyzed by evaluating the effect of recombinant EMMPRIN on cytokine and matrix metalloproteinase (MMP) secretion by human gingival fibroblasts. ELISA and immunofluorescence analyses revealed that P. gingivalis mediated the shedding of epithelial cell-surface EMMPRIN in a dose- and time-dependent manner. Cysteine proteinase (gingipain)-deficient P. gingivalis mutants were used to demonstrate that both Arg- and Lys-gingipain activities are involved in EMMPRIN shedding. Real-time PCR showed that P. gingivalis had no significant effect on the expression of the EMMPRIN gene in epithelial cells. Recombinant EMMPRIN induced the secretion of IL-6 and MMP-3 by gingival fibroblasts, a phenomenon that appears to involve mitogen activated protein kinases. The present study brought to light a new mechanism by which P. gingivalis can promote the inflammatory response during periodontitis. (C) 2011 Institut Pasteur. Published by Elsevier Masson SAS. All rights reserved.