Avaliação de duas técnicas de reação em cadeia da polimerase na detecção do Mycobacterium tuberculosis em diferentes amostras biológicas

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis e que permanece como um importante problema de saúde pública mundial, sendo a TB pulmonar a forma mais comum de apresentação da doença. O diagnóstico precoce e tratamento adequado são essenciais para a eficácia dos programas públicos de controle da TB. Novos metodologias mais rápidas, sensíveis e específicas, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), vem sendo propostas no diagnóstico da doença. O objetivo desse estudo foi avaliar o desempenho de duas PCR, a PCR em tempo real (qPCR) e a Nested PCR em único tubo (STNPCR), em diferentes amostras biológicas, no diagnóstico da tuberculose pulmonar, além de compará-las com as metodologias convencionais (baciloscopia e cultura) e entre si. Para isso foram analisados 125 pacientes que tiveram amostras de sangue (125 amostras de plasma e 116 amostras de PBMC), urina (n=125) e escarro (n=125) coletadas, totalizando a análise de 491 amostras biológicas. Amostras de escarro e urina foram descontaminadas pelo método de Petroff NAOH 4 por cento modificado e semeadas em meio de cultura Lõwenstein-Jensen (LJ), enquanto as amostras de sangue eram separadas em plasma e PBMC. Após processamento, deu-se a extração de DNA através do kit comercial da Qiagen seguida de amplificação pelas duas metodologias de PCR. Para análise estatística calculou-se a sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e índice kappa das técnicas. A STNPCR apresentou, em amostras de sangue, sensibilidade de 26,3 por cento e especificidade de 97,7 por cento. Em amostras de urina observou-se uma S = 7,9 por cento e E = 98,9 por cento e em escarro S = 21,1 por cento e E = 98,9 por cento. Quando analisadas as asmotras em paralelo, a sensibilidade da STNPCR foi igual a 44,7 por cento enquanto sua especificidade foi 97,7 por cento. Já a qPCR, em amostras de sangue, obteve sensibilidade igual a 26,3 por cento e especificidade de 95,4 por cento. Em amostras de urina a sensibilidade obtida foi 47,4 por cento e a especificidade 79,3 por cento e, em escarro, S = 36,8 por cento e E = 95,4 por cento. Quando analisada em paralelo, a sensibilidade da qPCR foi 65,8 por cento e a especificidade foi 79,3 por cento. A baciloscopia de escarro apresentou sensibilidade de 41,7 por cento e especificidade de 100 por cento, enquanto as culturas em urina e escarro apresentaram sensibilidade e especificidade, respectivamente, de 10,5 por cento e 100 por cento e 60,5 por cento e 96,6 por cento. Pode-se concluir que a qPCR apresentou melhor desempenho quando comparada à STNPCR e também bom desempenho quando comparada às metodologias convencionais, e que quando analisa-se mais de um tipo de amostras biológica, a eficácia das técnicas é aumentada. Espera-se que com a utilização dessa técnica molecular, seja possível a melhor elucidação dos casos de TB pulmonar, promovendo maior taxa de tratamento dos pacientes e menor risco de transmissão da doença

Efeito do transporte radial de partículas na eficiência da geração de corrente por ondas do tipo híbrida inferior em tokamaks

Usamos a teoria quase-linear para estudar os efeitos do transporte radial de partículas na eficiência da geração de corrente por ondas do tipo híbrida inferior (lower hybrid ou LH), em um tokamak modelado como uma lâmina. Nossos resultados numéricos foram obtidos com cinco diferentes modelos do termo de transporte e indicaram que embora a potência absorvida e a corrente gerada possam ser modificadas por efeito do transporte, a proporção de variação dessas quantidades não é muito sensível a uma forma particular do termo de transporte. Na formulação quase-linear utilizada, a evolução no tempo da função distribuição de elétrons, em um dado ponto da geometria de lâmina proposta, ocorre sob a ação de ondas do tipo híbrida inferior, colisões e transporte, e é descrita pela seguinte equação: 8rfe = (8rfehH + (8rfe)COL + (8rfeh . Oterceiro termo pretende demonstrar a natureza e a magnitude dos efeitos de transporte, e é dado pela seguinte forma: (8rfeh = 8s [DT(S) 8sie] , com um coeficiente para difusão espacial dependente de posição. Utilizamos cinco formas totalmente arbitrárias para a dependência de posição, com as quais pretendemos verificar a sensibilidade do processo de geração de corrente a aspectos do termo de difusão.

Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Fungos anemófilos em Porto Alegre, RS.

O conhecimento dos fungos anemófilos em determinada cidade ou região é importante para o diagnóstico etiológico e o tratamento específico das manifestações alérgicas respiratórias. Várias técnicas quantitativas e qualitativas são preconizadas para coleta e identificação desses fungos na dependência do local estudado. Nesta pesquisa, sobre esporos de fungos do ar, foi utilizado o equipamento Rotorod Sampler®, que retira a amostra do ar através de um bastão de plástico preso a um motor elétrico que o faz girar rapidamente, sendo as partículas suspensas no ar recolhidas pelo bastão. As amostras foram coletadas uma vez por semana, durante 24 horas, correspondendo a um ciclo de coleta. Foram realizadas 52 coletas entre abril de 2000 e março de 2001. Os resultados mostraram prevalência de ascosporos (50,49%), Cladosporium (17,86%), Aspergillus/Penicillium (15,03%), basidiosporos (3,84%), rusts (3,82%), Helminthosporium (2,49%), Botrytis (1,22%), Alternaria (1,19%), smuts (0,90%), Curvularia (0,87%), Nigrospora (0,61%) e Fusarium (0,08%). Não foi possível identificar 1,59% dos esporos de fungos coletados no período. O maior número de esporos foi observado nos meses de verão e o menor, durante o outono. Utilizando provas in vivo e in vitro, avaliou-se a hipersensibilidade a fungos entre 39 pacientes atópicos sofrendo de rinite e ou asma brônquica. Os testes cutâneos identificaram sensibilização em 17,94% dos pacientes, enquanto as provas sorológicas caracterizaram presença de IgE específica em 12,82% dos casos avaliados. A detecção de significativo número de esporos de fungos no ar de Porto Alegre, com muitas espécies comprovadamente alergênicas, e os índices de sensibilização observados em indivíduos atópicos confirmam a importância do estudo dos fungos anemófilos nessa cidade, com vistas a aprimorar o diagnóstico e o manejo de pacientes com manifestações alérgicas respiratórias.

Reprodutibilidade e validade In Vivo e In Vitro da inspeção visual associada ao exame radiográfico interproximal para a detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos

O objetivo do presente estudo foi comparar os diagnósticos de lesões de cárie oclusal de molares decíduos obtidos in vivo e in vitro, a partir da inspeção visual associada à radiografia interproximal e avaliar in vivo e in vitro a efetividade destes exames para a detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos. A amostra foi constituída de 52 molares decíduos superiores e inferiores. Os pacientes foram radiografados com posicionadores que possuíam os registros das mordidas em acrílico dos dentes posteriores aos dentes que seriam examinados. Moldagens dos hemiarcos foram obtidas com silicona de adição. O exame visual associado ao radiográfico da superfície oclusal dos molares decíduos foi realizado. Os dentes foram extraídos e posicionados nas moldagens para obtenção de modelos de gesso simulando as condições in vivo. Os posicionadores com as mordidas em acrílico foram novamente utilizados para as radiografias in vitro. O exame clínico associado ao radiográfico foi repetido in vitro pelo mesmo examinador, depois de em média 120 dias. Os dentes foram avaliados no estereomicroscópio para a obtenção dos diagnósticos definitivos. Através do teste de Wilcoxon, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os exames in vivo e in vitro (p = 0,356). Nas análises de todas as lesões, a sensibilidade foi de 0,95 in vivo e in vitro e a especificidade foi de 0,75 in vivo e 1 in vitro. Quando apenas as lesões em dentina foram validadas, a sensibilidade foi de 0,80 in vivo e in vitro e a especificidade foi de 0,77 in vivo e 0,83 in vitro. Assim, os resultados confirmam que os estudos de diagnóstico de cárie em condições laboratoriais são viáveis e possuem aplicabilidade clínica. Os exames associados foram considerados efetivos na detecção de lesões de cárie na superfície oclusal de molares decíduos in vivo e in vitro.

Detecção de salmonella sp. em psitacídeos de cativeiro através da reação em cadeia da polimerase (PCR)

O interesse da Medicina Veterinária nas espécies silvestres tem aumentado gradativamente, principalmente no estudo dos contextos ecológicos de saúde. Dentro desse contexto, autores realizaram estudos com o objetivo de conhecer a importância de Salmonella sp. na saúde das aves silvestres e seu potencial de transmissão para humanos e outros animais. Informações sobre a prevalência e distribuição dos sorovares de salmonelas na população de animais silvestres e domésticos são essenciais para relacionar os possíveis reservatórios que possam ser responsáveis pela transmissão dessa zoonose. Este trabalho teve como objetivo a detecção de Salmonella sp. em psitacídeos clinicamente sadios por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram coletados suabes cloacais de 280 psitacídeos mantidos em cativeiro no Estado do Rio Grande do Sul, pertencentes a treze espécies, provenientes de um zoológico, um criadouro conservacionista e um criadouro comercial. O DNA das amostras foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e examinados pela PCR com a utilização de um par de iniciadores que amplifica um fragmento de 284 pb do gene invA pertencente ao gênero Salmonella, resultando em 37 amostras positivas. Não houve diferença na prevalência de salmonela entre os três plantéis nem entre as 13 espécies analizadas. Não foi possível a detecção desse patógeno pela PCR com iniciadores para a identificação de S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Pullorum e S. Gallinarum, nem através da Técnica Microbiológica Convencional nas amostras detectadas pela PCR genérica, provavelmente devido a maior sensibilidade e especificidade da PCR genérica. De acordo com a revisão bibliográfica realizada, este foi o primeiro trabalho de detecção direta de Salmonella em psitacídeos utilizando a PCR. Os resultados indicaram que aproximadamente 13,2% dos psitacídeos mantidos em cativeiro eram portadores assintomáticos ou eram transientemente infectados pelo gênero Salmonella.

Técnicas de detecção de Sniffers

A área de Detecção de Intrusão, apesar de muito pesquisada, não responde a alguns problemas reais como níveis de ataques, dim ensão e complexidade de redes, tolerância a falhas, autenticação e privacidade, interoperabilidade e padronização. Uma pesquisa no Instituto de Informática da UFRGS, mais especificamente no Grupo de Segurança (GSEG), visa desenvolver um Sistema de Detecção de Intrusão Distribuído e com características de tolerância a falhas. Este projeto, denominado Asgaard, é a idealização de um sistema cujo objetivo não se restringe apenas a ser mais uma ferramenta de Detecção de Intrusão, mas uma plataforma que possibilite agregar novos módulos e técnicas, sendo um avanço em relação a outros Sistemas de Detecção atualmente em desenvolvimento. Um tópico ainda não abordado neste projeto seria a detecção de sniffers na rede, vindo a ser uma forma de prevenir que um ataque prossiga em outras estações ou redes interconectadas, desde que um intruso normalmente instala um sniffer após um ataque bem sucedido. Este trabalho discute as técnicas de detecção de sniffers, seus cenários, bem como avalia o uso destas técnicas em uma rede local. As técnicas conhecidas são testadas em um ambiente com diferentes sistemas operacionais, como linux e windows, mapeando os resultados sobre a eficiência das mesmas em condições diversas.

Estudo teórico-experimental do processo de microfiltração de partículas de sílica em suspensão aquosa

Cada vez mais muitos processos industriais convencionais de separação, tais como destilação, centrifugação e extração com solventes, entre outros, estão sendo substituídos pelos processos de separação por membranas em virtude desses apresentarem vantagens em relação aos processos convencionais, além de serem considerados uma tecnologia limpa. Entre estas vantagens pode-se citar a economia de energia, pois não envolvem mudança de fase; a possibilidade de processamento de substâncias termolábeis, pois podem operar à temperatura ambiente; a maior seletividade; a facilidade de scale – up, pois são modulares e não extensivos em mão de obra, entre outros. Uma característica limitante destes processos é a existência de uma camada de elevada concentração de partículas ou moléculas que se forma próxima à superfície da membrana e que ocasiona uma redução no fluxo permeado, podendo modificar as características de retenção da membrana. Este fenômeno é conhecido como polarização por concentração. O entendimento dos mecanismos de polarização é considerado de grande importância neste campo e o estudo e validação de modelos matemáticos preditivos torna-se necessário para se obter sucesso na aplicação dos processos com membranas no meio industrial O objetivo geral deste trabalho consiste na análise teórico-experimental do processo de microfiltração tangencial com suspensão aquosa de partículas de sílica. O objetivo específico é a utilização de dados experimentais para a estimação de um parâmetro do modelo matemático que descreve o perfil de concentração na superfície da membrana ( membrana). A configuração tangencial implica que a alimentação, contendo as partículas a serem removidas ou concentradas, flui paralelamente à superfície da membrana reduzindo, assim, o fenômeno de polarização por concentração. Os experimentos foram efetuados em uma unidade de bancada de microfiltração tangencial, também conhecido como fluxo cruzado, em um módulo para membrana plana com canal de escoamento retangular sob condições de escoamento laminar. Os seguintes parâmetros foram variados durante os experimentos: pressão transmembrana, velocidade tangencial e concentração de partículas de sílica Os dados experimentais foram utilizados em uma modelagem matemática, baseada nas equações fundamentais da mecânica dos fluidos e da transferência de massa, que considera as propriedades físicas da suspensão, viscosidade dinâmica e difusividade mássica, variáveis com a concentração de sílica para se estimar a concentração máxima de sílica junto à superfície da membrana. Esta modelagem engloba os parâmetros operacionais, bem como as características da membrana nesta única variável. Com a finalidade de se verificar como a concentração máxima sobre a membrana é afetada pelas condições operacionais e, conseqüentemente, como esta afeta o fluxo permeado, a concentração máxima sobre a superfície da membrana é apresentada em função das condições operacionais variadas durante os experimentos de microfiltração. Finalmente, após a estimação desta variável, pôde-se concluir que ela é influenciada pelas condições operacionais típicas do processo de microfiltração tangencial, tais como velocidade tangencial de escoamento, pressão através da membrana e concentração da alimentação.