Desórdenes congénitos de la glicosilación (cdg).

Los Desórdenes Congénitos de la Glicosilación (CDG), son un grupo creciente de enfermedades metabólicas hereditarias de herencia autosómica recesiva, salvo dos clases de CDG autosómicas dominantes, causadas por defectos en la síntesis o la remodelación de N-u O-glicanos, de glicoesfingolípidos o en anclajes de glycosylphosphatidylinositol. La formación de la porción glicano, se produce a través de etapas secuenciales y comienza la ruta biosintetica en citoplasma, pasando por retículo endoplasmático y posterior modificación del glicoconjugado en el aparato de Golgi. Los glicanos constituyen compuestos formados por diversos residuos de carbohidratos y han sido seleccionados en la evolución para transmitirle a las macromoléculas a las cuales se encuentran unidos, propiedades estructurales y funcionales, razón por la cual la síntesis correcta de los mismos y de sus glicoconjugados son esenciales para el funcionamiento normal. La caracterización molecular y clínica de más de 70 clases diferentes de CDG ha contribuido enormemente a comprender las funciones fisiológicas de los mecanismos de glicosilación y la importancia de los glicoconjugados en la célula. Mutaciones en genes de esta vía metabólica, ocasionan fenotipos multisistémicos con afectación neurológica severa y muerte temprana. Incluso algunos CDG tienen probabilidad de malignización por ej. osteocondromatosis múltiple (EXT1/EXT2-CDG). Respecto a las estrategias para el diagnóstico de CDG, debido a la gran heterogeneidad fenotípica de estos pacientes, hemos debido implementar el diagnóstico de los trastornos genéticos de N-glicosilación, basado en los cambios bioquímicos y estructurales que se expresan en las glicoproteínas anómalas, demostrados por diferentes metodologías. Existen técnicas de gran sensibilidad utilizadas para la búsqueda de pacientes CDG como electroforesis capilar, ionización por electrospray-espectrometría de masa y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), sin embargo, el isoelectroenfocado (IEF) es la metodología mayormente utilizada para su diagnóstico.

Bioactividad de extractos de Melia azedarach L. sobre el taladro del maíz Sesamia nonagrioides Lef.

A partir de un extracto metanólico de semillas de Melia azedarach se han aislado los compuestos responsables de su actividad biológica como agentes inhibidores de la alimentación y reguladores del desarrollo sobre Sesamia nonagrioides. Las pruebas biológicas de actividad se han realizado incorporando cada fracción a la dieta, hojas de maíz o dieta sintética, de larvas de 2°estadio del insecto. La técnica de cromatografía líquida de alta resolución a escala semipreparativa, utilizando un cartucho de fase reversa, ha permitido separar dos componentes con cantidad y pureza suficientes para poder ser analizados con posterioridad mediante técnicas espectroscópicas.

Estudi dels carotenoides en espècies marrons de bacteris verds del sofre: diversitat, eco-fisiologia i regulació

El present treball es centra en l'estudi a diferents nivells dels carotenoides de les espècies marrons de Bacteris Verds del Sofre (GSB, de l'anglès Green Sulfur Bacteria). L'objectiu global ha estat el d'esbrinar quina és la funció d'aquests pigments dins l'aparell fotosintètic d'aquests microorganismes i aprofundir en el coneixement de la seva estructura i interaccions amb els altres pigments de l'aparell fotosintètic. En primer lloc es va dissenyar un nou mètode de cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) per analitzar de manera més ràpida i precisa els carotenoides de diferents soques de GSB (Capítol 3). Aquest mètode es basa en una purificació prèvia dels extractes pigmentaris amb columnes d'alúmina per eliminar les bacterioclorofil·les (BCls). Això va permetre analitzar amb una elevada resolució i en tan sols 45 min de carrera cromatogràfica els diferents carotenoides i els seus precursors, així com les configuracions trans i cis dels seus isòmers. El segon mètode utilitzat va consistir en una modificació del mètode de Borrego i Garcia-Gil (1994) i va permetre la separació precisa de tot tipus de pigments, procedents tant de cultius purs com de mostres de caràcter complex. Un exemple concret foren uns paleosediments de la zona lacustre de Banyoles. En aquests sediments (0,7-1,5 milions d'anys d'antiguitat) es van detectar, entre d'altres pigments, carotenoides específics de les espècies marrons de GSB, la qual cosa va permetre confirmar la presència d'aquests bacteris a la zona lacustre de Banyoles ja des del Pleistocè inferior. En aquest primer capítol també es van analitzar els carotenoides de Chlorobium (Chl.) phaeobacteroides CL1401 mitjançant cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS/MS), amb l'objectiu de confirmar la seva identificació i el seu pes molecular. A més, també es va avaluar l'efecte de la temperatura, la llum i diferents agents oxidants i reductors en la composició quantitativa i qualitativa dels carotenoides i les BCls d'aquesta espècie. Això va permetre confirmar el caràcter fotosensible de les BCls i que els isòmers trans/cis dels diferents carotenoides no són artefactes produïts durant la manipulació de les mostres, sinó que són constitutius de l'aparell fotosintètic d'aquests microorganismes. El Capítol 4 inclou els experiments de fisiologia duts a terme amb algunes espècies de GSB, a partir dels quals es va intentar esbrinar la dinàmica de síntesi dels diferents pigments de l'aparell fotosintètic (BCl antena, BCl a i carotenoides) durant el creixement d'aquestes espècies. Aquestes investigacions van permetre monitoritzar també els canvis en el nombre de centres de reacció (CR) durant el procés d'adaptació lumínica. La determinació experimental del nombre de CR es va realitzar a partir de la quantificació de la BCl663, l'acceptor primari en la cadena de transport d'electrons dels GSB. L'estimació del nombre de CR/clorosoma es va realitzar tant a partir de dades estequiomètriques i biomètriques presents a la bibliografia, com a partir de les dades experimentals obtingudes en el present treball. El bon ajust obtingut entre les diferents estimacions va donar solidesa al valor estequiomètric calculat, que fou, com a promig, d'uns 70 CR per clorosoma. En aquest capítol de fisiologia també es van estudiar les variacions en les relacions trans/cis pels principals carotenoides de les espècies marrons de GSB. Aquestes es van determinar a partir de cultius purs de laboratori i de poblacions naturals de GSB. Pel que fa als valors trobats en cultius de laboratori no es van observar diferències destacades entre el valor calculat a alta intensitat de llum i el calculat a baixa intensitat, essent en ambdós casos proper a 2. En els clorosomes aïllats de diferents soques marrons aquest quocient prengué un valor similar tant pels isòmers de l'isorenieratè (Isr) com pels del -isorenieratè (-Isr). En poblacions naturals de Chl. phaeobacteroides aquesta relació va ser també de 2 isòmers trans per cada isòmer cis, mantenint-se constant tant en fondària com al llarg del temps. Finalment, en el Capítol 5 es presenta un marcador molecular que permet la identificació específica d'espècies marrons de GSB. Malgrat que inicialment aquest marcador fou dissenyat a partir d'un gen implicat en la síntesi de carotenoides (crtY, el qual codifica per a una licopè ciclasa) la seqüència final a partir de la qual s'han aconseguit els encebadors selectius està relacionada amb la família de proteïnes de les Policètid-ceto-sintases (PKT). Tot i així, l'eina dissenyada pot ser de gran utilitat per a la discriminació d'espècies marrons de GSB respecte les verdes en poblacions mixtes com les que es troben en ambients naturals i obre la porta a futurs experiments d'ecologia microbiana utilitzant tècniques com la PCR en temps real, que permetria la monitorització selectiva de les poblacions d'espècies marrons de GSB en ecosistemes naturals.

Determinación de fungicidas bencimidazolicos en muestras líquidas medioambientales mediante el acoplamiento SPME-HPLC

El estudio que se plantea tiene como objetivo principal el establecer y desarrollar un nuevo método sensible y preciso para la determinación simultánea de fungicidas bencimidazólicos en muestras medioambientales acuosas, mediante el acoplamiento de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la microextracción en fase sólida. Para ello se evaluará la eficiencia de la extracción de los compuestos en estudio, usando distintos tipos de fibras y optimizando las variables del procedimiento SPME como son el tiempo de extracción, la fuerza iónica, la temperatura de extracción y el tiempo de desorción. El método optimizado se aplicará posteriormente a la determinación de dichos compuestos en distintas matrices líquidas ambientales: agua de mar, agua depurada y agua subterránea.

Evaluación de los niveles de disruptores endocrinos en muestras procedentes de estaciones depuradoras de aguas residuales de la isla de Gran Canaria mediante la utilización de sistemas cromatográficos acoplados

Programa de doctorado: Oceanografía

Prácticas de Química Analítica

[ES]Preparación y Normalización de Disoluciones (Determinación gravimétrica de la humedad, Preparación y normalización de disoluciones, Disolución de aleaciones); Valoraciones Volumétricas (Introducción a la Valoración Volumétrica, Reacciones ácido-base, Reacciones de oxidación-reducción, Reacciones de precipitación, Reacciones de formación de complejos); Espectroscopía (Espectroscopía de Absorción molecular, Determinación de ácido benzoico, Determinación de calcio y magnesio, Determinación de hierro, Espectroscopía de Absorción Atómica); Métodos Electroanalíticos (Potenciometría, Electrodos Selectivos, Determinación potenciométrica, Valoración conductimétrica); Métodos de Separación (Cromatografía en capa fina, Cromatografía de gases, Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)); Normas de seguridad en el laboratorio, Material de laboratorio, Análisis de error y tratamiento de datos

Síntesis y purificación de ajoeno y su cuantificación en aceites comerciales de ajo

El ajo (Allium sativum L.) es una de las principales hortalizas estudiadas por sus efectos benéficos para la salud, atribuidos en su mayoría a la riqueza que posee en compuestos organoazufrados. Entre ellos, el ajoeno, presente en preparaciones de ajo añejado en aceite, se destaca por ser uno de los principales responsables de la actividad antiagregante plaquetaria. El objetivo de este trabajo fue validar una metodología analítica para su cuantificación en aceite de ajo. Como este compuesto no se comercializa en el mercado y es necesario disponer de él para su empleo como estándar de referencia, se debió adecuar su síntesis y posterior purificación. Para la síntesis se probaron dos metodologías, obteniéndose mejores resultados con la propuesta de Block et al. Se purificó colectando fracciones a la salida del HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Performance), se logró la separación de ambos isómeros y por último se cuantificaron muestras de aceite de ajo, comercializadas en la provincia de Mendoza.

Obtención de un estándar secundario de cuantificación para la síntesis y purificación de allicina.

Desde tiempos ancestrales, el ajo (Allium sativum L.) ha sido utilizado para la prevención y el tratamiento de dolencias. Sus efectos benéficos para la salud han sido atribuidos a los tiosulfinatos, siendo la allicina el más abundante. La determinación rutinaria de la allicina es dificultosa dada su inestabilidad y la naturaleza reactiva de la misma. El objetivo del trabajo fue obtener un estándar secundario para la cuantificación de allicina mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Fueron ensayadas diferentes metodologías de síntesis y purificación de allicina. En el Laboratorio de Residuos Tóxicos de la Fac. Cs. Agrarias (UNCuyo), bajo condiciones controladas, se preparó polvo de ajo para ser utilizado como estándar secundario de cuantificación. La cuantificación de muestras problema contra ambos estándares (allicina pura y polvo de ajo estandarizado, respectivamente) no presentó diferencias significativas. El empleo de polvo de ajo estandarizado ofrece una alternativa viable simple para la cuantificación de allicina.

Efecto de la interacción genotipo-ambiente sobre la expresión del contenido de allicina y ácido pirúvico en ajo (Allium sativum L.)

La expresión de la intensidad del flavor en los bulbos de ajo (Allium sativum L.), depende tanto de factores genéticos como ambientales. Las características organolépticas se manifiestan por la presencia de compuestos organoazufrados, específicamente tiosulfinatos, siendo el representante mayoritario la allicina (diallil tiosulfinato). El ácido pirúvico constituye un producto secundario de la reacción enzimática generadora del flavor, por lo que su medición se asocia a la intensidad de pungencia en ajo. El objetivo del presente trabajo fue estudiar si la variabilidad en el contenido de allicina y pirúvico está más asociada a las características genéticas o a la influencia de las regiones de cultivo. Se seleccionaron cuatro cultivares (Castaño INTA, Sureño INTA, Lican INTA y Unión) pertenecientes al banco de germoplasma del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) La Consulta, Mendoza, Argentina, cultivados en diferentes zonas geográficas: La Consulta (Dpto. San Carlos, Mendoza), Esquel (Chubut) y Ushuaia (Tierra del Fuego). Se cuantificó la allicina mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) y pungencia mediante espectrofotometría. A partir del análisis estadístico de los valores obtenidos se puede inferir que existen diferencias significativas en el contenido de allicina y pirúvico entre distintas cultivares de una misma zona y en el contenido de allicina y pirúvico para la misma cultivar en distintas zonas.

Estudios de especiación de arsénico y acumulación de metales en muestras de interés medioambiental : Arsenic speciation and metal accumulation studies in environmental samples

Se ha estudiado la determinación de especies de arsénico y de contenidos totales de arsénico y metales pesados, específicamente cadmio, cromo, cobre, níquel, plomo y cinc, en muestras de interés medioambiental por su elevada capacidad acumuladora de metales, concretamente algas marinas comestibles y plantas terrestres procedentes de suelos contaminados por la actividad minera. La determinación de contenidos totales se ha llevado a cabo mediante espectrometría de emisión atómica con plasma de acoplamiento inductivo (ICP‐AES), así como por espectrometría de fluorescencia atómica con generación de hidruros (HG‐AFS), para bajos contenidos de arsénico. Las muestras fueron mineralizadas en medio ácido y calentamiento en horno de microondas. Los métodos fueron validados a través de su aplicación a materiales de referencia de matriz similar a la de las muestras, certificados en contenidos totales de los elementos seleccionados. Los resultados obtenidos mostraron su elevada capacidad de bioabsorción, especialmente en relación a los elevados contenidos de arsénico encontrados en algunas especies de algas pardas (Phaeophytas). En las plantas, se calcularon los factores de translocación, acumulación y biodisponibilidad de los elementos estudiados, permitiendo identificar a la especie Corrigiola telephiifolia como posible acumuladora de plomo e hiperacumuladora de arsénico. La determinación de especies de arsénico hidrosolubles en las muestras objeto de estudio, se llevó a cabo por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) acoplado a ICP‐AES, HG‐ICP‐AES y HG‐AFS, incluyendo una etapa previa de foto‐oxidación. Los métodos desarrollados, mediante intercambio aniónico y catiónico, permitieron la diferenciación de hasta once especies de arsénico. Para el análisis de las muestras, fue necesaria la optimización de métodos de extracción, seleccionándose la extracción asistida por microondas (MAE) con agua desionizada. Asimismo, se realizaron estudios de estabilidad de arsénico total y de las especies hidrosolubles presentes en las algas, tanto sobre la muestra sólida como en sus extractos acuosos, evaluando las condiciones de almacenamiento adecuadas. En el caso de las plantas, la aplicación del diseño factorial de experimentos permitió optimizar el método de extracción y diferenciar entre las especies de arsénico presentes en forma de iones sencillos de mayor movilidad y el arsénico más fuertemente enlazado a componentes estructurales. Los resultados obtenidos permitieron identificar la presencia de arseniato (As(V)) y arsenito (As(III)) en las plantas, así como de ácido monometilarsónico (MMA) y óxido de trimetilarsina (TMAO) en algunas especies. En la mayoría de las algas se encontraron especies tóxicas, tanto mayoritarias (arseniato) como minoritarias (ácido dimetilarsínico (DMA)), así como hasta cuatro arsenoazúcares. Los resultados obtenidos y su estudio a través de la legislación vigente, mostraron la necesidad de desarrollar una reglamentación específica para el control de este tipo de alimentos. La determinación de especies de arsénico liposolubles en las muestras de algas se llevó a cabo mediante HPLC, en modo fase inversa, acoplado a espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP‐MS) y con ionización por electrospray (ESI‐MS), permitiendo la elucidación estructural de estos compuestos a través de la determinación de sus masas moleculares. Para ello, fue necesaria la puesta a punto de métodos extracción y purificación de los extractos. La metodología desarrollada permitió identificar hasta catorce especies de arsénico liposolubles en las algas, tres de ellas correspondientes a hidrocarburos que contienen arsénico, y once a arsenofosfolípidos, además de dos especies desconocidas. Las masas moleculares de las especies identificadas fueron confirmadas mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC‐MS) y espectrometría de masas de alta resolución (HR‐MS). ABSTRACT The determination of arsenic species and total arsenic and heavy metal contents (cadmium, chromium, cooper, nickel, lead and zinc) in environmental samples, with high metal accumulator capacity, has been studied. The samples studied were edible marine algae and terrestrial plants from soils polluted by mining activities. The determination of total element contents was performed by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP‐AES), as well as by hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HG‐AFS) for low arsenic contents. The samples studied were digested in an acidic medium by heating in a microwave oven. The digestion methods were validated against reference materials, with matrix similar to sample matrix and certified in total contents of the elements studied. The results showed the high biosorption capacity of the samples studied, especially regarding the high arsenic contents in some species of brown algae (Phaeophyta division). In terrestrial plants, the translocation, accumulation and bioavailability factors of the elements studied were calculated. Thus, the plant species Corrigiola telephiifolia was identified as possible lead accumulator and arsenic hyperaccumulator. The determination of water‐soluble arsenic species in the samples studied was carried out by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to ICP‐AES, HG‐ICP‐AES and HG‐AFS, including a prior photo‐oxidation step. The chromatographic methods developed, by anion and cation exchange, allowed us to differentiate up to eleven arsenic species. The sample analysis required the optimization of extraction methods, choosing the microwave assisted extraction (MAE) with deionized water. On the other hand, the stability of total arsenic and water‐soluble arsenic species in algae, both in the solid samples and in the water extracts, was studied, assessing the suitable storage conditions. In the case of plant samples, the application of a multivariate experimental design allowed us to optimize the extraction method and differentiate between the arsenic species present as simple ions of higher mobility and the arsenic more strongly bound to structural components. The presence of arsenite (As(III)) and arsenate (As(V)) was identified in plant samples, as well as monomethylarsonic acid (MMA) and trimethylarsine oxide (TMAO) in some cases. Regarding algae, toxic arsenic species were found in most of them, both As(V) and dimethylarsinic acid (DMA), as well as up to four arsenosugars. These results were discussed according to the current legislation, showing the need to develop specific regulations to control this kind of food products. The determination of lipid‐soluble arsenic species in alga samples was performed by reversed‐phase HPLC coupled to inductively coupled plasma and electrospray mass spectrometry (ICP‐MS and ESI‐MS), in order to establish the structure of these compounds by determining the corresponding molecular masses. For this purpose, it was necessary to develop an extraction method, as well as a clean‐up method of the extracts. The method developed permitted the identification of fourteen lipid‐soluble arsenic compounds in algae, corresponding to three arsenic‐hydrocarbons and eleven arsenosugarphospholipids, as well as two unknown compounds. Accurate mass measurements of the identified compounds were performed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC‐MS) and high resolution mass spectrometry (HR‐MS).

Procedimiento para la purificación de Triglicéridos que contienen ácido Gamma-Linolenico en posición SN-2

Procedimiento para la purificación de triglicéridos que contienen ácido gamma-linolénico en posición sn-2. Con la finalidad de purificar triglicéridos que contienen ácido gamma-linolénico a partir de fuentes naturales, se utiliza una columna cromatográfica gravimétrica en fase normal, trabajando en gradiente de polaridad con solventes biocompatibles. Así se consigue la purificación de triglicéridos que cuentan en su estructura con una o más moléculas de ácido gamma-linolénico, pudiendo ser utilizados con diversos fines. Con esta metodología es posible trabajar a escala industrial, pues es fácilmente escalable, a diferencia de otras técnicas que son aplicables a escala analítica pero presentan serios inconvenientes en cuanto a coste y adiestramiento del personal a la hora de utilizarlas con fines industriales, como por ejemplo la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Biodegradación de Carbufuran y Carbaril por Sphingomonas sp., S8-M3-13

p.45-52

Identificación de metabolitos bioactivos de Neem (Azadirachta indica Adr. Juss.)

Los productos del metabolismo secundario de plantas suelen ser de interés biotecnológico como plaguicidas naturales útiles para mejorar estrategias agroecológicas o en el manejo de ecosistemas más amigables con el ambiente. Con el propósito de iniciar estudios en esta temática se procedió a: a) establecimiento, en medios sólidos y en suspensión, de cultivos celulares de Azadirachta indica ; b) extracción secuencial fraccionada, aislamiento y detección de Azadiractina mediante cromatografía de capa fina; c) identificación, cuantificación del compuesto por cromatografía de líquidos, y comprobación de su actividad biológica. Todas las actividades se realizaron en el laboratorio de biotecnología de células vegetales del centro de investigaciones y estudios avanzados (CINVESTAV), México, a finales del año 2009. Los resultados indican la presencia de terpenoides en los extractos obtenidos, la Azadiractina fue aislada y detectada mediante cromatografía de capa fina (Rf 0,2). Este compuesto fue identificado también por la coincidencia de su tiempo de retención (20 min) con el del estándar en la cromatografía líquida de alta resolución de la muestra semipurificada. Fue cuantificado interpolando su absorbancia en la curva de calibración obtenida con diferentes concentraciones del estándar. Se encontraron 1.67 mg g -1 peso seco de este compuesto en las semillas estudiadas, y mediante bioensayos fue comprobado el efecto fungicida del extracto. Adicionalmente, fueron establecidos cultivos in vitro.

Antibacterial activity of the marine sponge Ircinia Campana collected at Punta Uva Limón against Staphylococcus Aureus

The sponges are simple multicellularorganisms; they inhabit in marine environments from the polar seas to the tropical waterswhere they are more abundant. These species are exposed to large populations of microbes, reason that explains their complex morphological and cellular defense mechanism, which are used by these organisms to fight against pathogens. The purpose of this study was to evaluate the antibacterial activity of the marine sponge Ircinia campana, whichinhabits in the south of the Caribbean coast of Costa Rica against  Sthapylococcus aureus gram-positive bacteria. Sampleswere collected in Punta Uva in Limónduring July of 2007. The active compounds were obtainedby extraction with acetone (crude extract); and subsequently, chromatographic extracts were obtained using fractions 1:4 hexane: ethyl acetate. The antibacterial activities of the different fractions, including the  crude extract were tested.Our results suggest a zone of inhibition of 14.60 ±0.25 mm for the crude extract and18.70±0.25mm for the most active fraction separated by chromatography. The metabolite responsible for the antibacterial activity was isolated by High Performance Liquid Chromatography (HPLC)and preliminarily characterized through ultraviolet (UV) and infrared (IR) spectroscopy.

Evaluación in vitro de agentes secuestrantes de aflatoxinas

Resumen La presencia de micotoxinas en alimentos es un problema de gran importancia a nivel mundial que provoca serios perjuicios sanitarios y económicos. Para limitar los efectos de las micotoxinas a los animales uno de los métodos más utilizados es la aplicación de secuestrantes. Estos son polímeros inorgánicos u orgánicos que al añadirse a los alimentos forman complejos con las micotoxinas en la luz intestinal disminuyendo así su absorción. Por este motivo se evaluó la eficacia de cuatro secuestrantes, dos alumino silicatos hidratados de calcio y sodio, uno de glucomananos esterificados y otro del tipo multi modular para aflatoxina B1 (AFB1). La capacidad de adsorción fue evaluada in vitro y bajo condiciones de pH similares a las del tracto gastrointestinal de los animales. La concentración de AFB1 fue determinada mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Con la excepción del producto de glucomananos esterificados, el porcentaje de unión de aflatoxina B1 obtenido para los secuestrantes estudiados fue alto (> 76%). Estos resultados sugieren que la mayoría de los secuestrantes utilizados en este estudio son potenciales agentes químicos-biológicos que podrían ser utilizados para disminuir los efectos de las aflatoxinas en animales