779 resultados para Cellule de Sertoli


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L'utilizzo di polimeri organici coniugati in dispositivi elettronici per applicazioni biologiche, grazie alle loro proprietà meccaniche ed elettriche, insieme alla loro biocompatibilità, è un campo di ricerca relativamente nuovo e in rapida espansione. In questo lavoro di tesi si utilizza la tecnica del Voltage Clamp in configurazione whole cell per caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche della linea cellulare di glioblastoma multiforme (T98G) e per registrare le correnti ioniche di cellule adese su una matrice polimerica biocompatibile di poli(etilenediossitiofene)-poli(stirenesulfonato) (PEDOT:PSS). La tecnica consiste nel bloccare il potenziale di membrana al valore desiderato, secondo un preciso protocollo di stimolazione, misurando la corrente necessaria per mantenere costante il potenziale presente tra le due superfici della membrana cellulare. Nella prima parte del lavoro le cellule sono state perfuse con farmaci inibitori dei canali potassio, prima con il bloccante non specifico tetraetilammonio (TEA), e poi selettivamente tramite bloccanti specifici come iberiotossina e dendrotossina. Il 44% circa delle cellule ha evidenziato una significativa corrente residua riconducibile all'attività dei canali ionici voltaggio-dipendenti Kv1.2. Al contrario nelle cellule restanti questi canali non sono espressi. Successivamente, sempre utilizzando le T98G, si è analizzato come lo stato di ossido-riduzione del polimero coniugato PEDOT:PSS possa influenzare le correnti dei canali ionici di membrana; è emerso che il substrato di PEDOT:PSS ridotto provoca una diminuzione significativa della corrente registrata rispetto al substrato di controllo (petri in polistirene). Questi risultati sono stati confrontati con le curve di proliferazione delle cellule T98G coltivate per 24h, 48h e 72h sui diversi substrati considerati, evidenziando interessanti correlazioni nel caso del substrato PEDOT:PSS ridotto.

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Il campo della Bioelettronica si è sviluppato a partire dal 18 secolo con l’ esperimento di Luigi Galvani che, applicando uno stimolo elettrico ai muscoli di una rana dissezionata, ne osservò il movimento. Da questo esperimento si è aperta la strada che ha portato ad oggi ad un grande sviluppo tecnologico nella realizzazione di dispositivi elettronici che permettono di offrire un miglioramento generale delle condizioni di vita. Come spesso accade con le tecnologie emergenti, i materiali sono la maggiore limitazione nello sviluppo di nuove applicazioni. Questo è certamente il caso della Bioelettronica. I materiali elettronici organici, nella forma di polimeri conduttivi, hanno mostrato di poter dotare gli strumenti elettronici di grandi vantaggi rispetto a quelli tradizionali a base di silicio, in virtù delle loro proprietà meccaniche ed elettroniche, della loro biocompatibilità e dei bassi costi di produzione. E’ da questi studi che nasce più propriamente il campo della Bioelettronica Organica, che si basa sulla applicazione di semiconduttori a base di carbonio in forma di piccole molecole coniugate e di polimeri, e del loro utilizzo nei dispositivi elettronici. Con il termine di ‘Bioelettronica organica’, quindi, si descrive l’accoppiamento tra dispositivi elettronici organici e il mondo biologico, accoppiamento che si sviluppa in due direzioni: da un lato una reazione o un processo biologico può trasferire un segnale ad un dispositivo elettronico organico, dall’altro un dispositivo elettronico organico può avviare un processo biologico.

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Le materie plastiche sono materiali polimerici che possono contenere altre sostanze finalizzate a migliorarne le proprietà o ridurre i costi (IUPAC). Accanto agli innumerevoli vantaggi apportati dall’utilizzo della plastica, negli anni sono emersi aspetti negativi relativi all’inquinamento ambientale causato dalla dispersione del materiale plastico nei rifiuti urbani e conseguentemente nelle discariche. La diffusione e l’utilizzo della bioplastica si pone come obiettivo minimizzare la dipendenza dal petrolio in previsione della diminuzione del numero di giacimenti e quindi della sua disponibilità. Lo scopo del presente lavoro di sperimentazione è lo studio del processo di dowstream di PHA prodotti in laboratorio partendo dalla verifica dei risultati riportati in letteratura e puntando poi ad un miglioramento di un processo convenzionale attraverso la ricerca di nuove alternative.

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Nelle matrici ambientali sono spesso presenti xenoestrogeni, molecole sintetiche o di origine naturale ad attività estrogenica in grado di alterare il normale equilibrio ormonale di organismi esposti, incidendo negativamente su alcune funzioni vitali come la riproduzione ed il metabolismo. Diverse sostanze chimiche presenti in ambiente, tra cui alcune molecole ad attività estrogenica, sono anche potenziali composti genotossici, in grado, cioè, di interagire con il DNA ed esercitare effetti anche a lungo termine come l’insorgenza di tumori nei vertebrati, uomo compreso. L’obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di mettere a punto ed utilizzare due saggi biologici, il saggio E-screen ed il test dei micronuclei, per valutare la presenza di xenoestrogeni e composti genotossici in campioni di acque prelevate prima e dopo i trattamenti di potabilizzazione, utilizzando cellule MCF-7 di adenocarcinoma mammario come modello sperimentale in vitro. Le indagini biologiche sono state condotte sulla base di una convenzione di ricerca con la Società acquedottistica Romagna Acque- Società delle fonti e hanno previsto tre campagne di monitoraggio. I campioni di acqua sperimentale, raccolti prima e dopo i trattamenti presso diversi impianti di potabilizzazione, sono stati preventivamente filtrati, estratti in fase solida, fatti evaporare sotto leggero flusso di azoto, ed infine, saggiati sulle cellule. Il test E-screen, di cui abbiamo dimostrato un elevato livello di sensibilità, ha permesso di escludere la presenza di composti ad attività estrogenica nei campioni esaminati. Allo stesso modo, i risultati del test dei micronuclei hanno dimostrato l’assenza di effetti genotossici, confermando la buona qualità delle acque analizzate. Nell’ambito delle attività di monitoraggio, le indagini biologiche risultano essenziali per la valutazione di una potenziale contaminazione ambientale, in quanto forniscono informazioni anche quando non sono state condotte analisi chimiche. Inoltre, anche quando le analisi chimiche siano state condotte, i test biologici informano della potenzialità tossica di una matrice causata eventualmente da sostanze non oggetto del saggio chimico. Infine, i test biologici permettono di identificare eventuali sinergie tra più contaminanti presenti nelle acque, affermandosi come test da condurre in maniera complementare ai saggi chimici. I test biologici come quelli impiegati nel lavoro di tesi sono molto sensibili ed informativi, ma necessitano della definizione di protocolli standardizzati per garantirne un’uniforme applicazione alle acque ad uso potabile, almeno a livello nazionale.

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I cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC-CMs) costituiscono un nuovo approccio per lo studio delle proprietà delle cellule cardiache sia degli individui sani che di quelli affetti da malattie ereditarie e possono rappresentare inoltre una piattaforma in vitro per la scoperta di nuovi farmaci e terapie rigenerative. Il grande impatto delle hiPSC-CMs nell’ambito della ricerca si deve soprattutto alle loro proprietà elettrofisiologiche: queste cellule non solo esprimono fenotipi genici e proprietà delle correnti ioniche tipiche delle cellule cardiache, ma sono anche in grado di riprodurre fenomeni aritmici, come le EAD, a seguito della somministrazione di farmaci. Grazie anche alla grande potenza di calcolo oggi disponibile è possibile supportare la pratica in vitro con modelli in silico, abbattendo sia i costi che i tempi richiesti dagli esperimenti in laboratorio. Lo scopo di questo lavoro è quello di simulare il comportamento delle hiPSC-CMs di tipo ventricolare in risposta alla somministrazione di farmaci che interagiscono con la corrente di potassio IKr, principale responsabile della ripolarizzazione cardiaca. L’assunzione di certi farmaci può comportare infatti una riduzione della IKr, con conseguente prolungamento della fase di ripolarizzazione del potenziale d’azione cardiaco. Questo meccanismo è causa dell’insorgenza della sindrome del QT lungo di tipo 2, che in casi estremi può degenerare in aritmie gravi. Ciò suggerisce che queste cellule rappresentano un importante strumento per la valutazione del rischio pro-aritmico che può essere facilitata da simulazioni in silico effettuate utilizzando modelli computazionali basati su dati fisiologici.

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Steroid hormones regulate target cell function via quantitative and qualitative changes in RNA and protein synthesis. In the testis, androgens are known to play an important role in the regulation of spermatogenesis. The Sertoli cell (SC), whose function is thought to be supportive to the developing germ cell, has been implicated as an androgen target cell. Although cytoplasmic androgen receptors and chromatin acceptor sites for androgen-receptor complexes have been found in SC, effects on RNA synthesis have not previously been demonstrated. In this study, SC RNA synthetic activity was characterized and the effect of testosterone on SC nuclear transcriptional activity in vitro assessed. SC exhibited two fold increases in RNA and ribonucleotide pool concentrations during sexual maturation. These changes appeared to correlate with a previously observed increase in protein concentration per cell over an age span of 15-60 days. Following incubation with ('3)H-uridine, SC from older animals incorporated more label into RNA than SC from younger animals. Since the relative concentration of cytidine nucleotides was higher in SC from older rats, the age-related increase in tritium incorporation may reflect an associated increase in incorporation of ('3)H-CMP into RNA. Alternatively, the enhanced labeling may be the result of either a change in the base composition of the RNA resulting in a higher proportion of CMP and UMP in the RNA, or compartmentalization of the nucleotide pools. The physiologic consequences of these maturational alterations of nucleotide pools remains to be elucidated. RNA polymerase activities were characterized in intact nuclei obtained from cultured rat SC. (alpha)-Amanitin resistant RNA polymerase I+III activity was identical when measured in low or high ionic strength (0.05 M or 0.25 M ammonium sulfate (AS)) in the presence of MnCl(,2) or MgCl(,2), with a divalent cation optimum of 1.6 mM. RNA polymerase II was most active in 0.25 M AS and 1.6 mM MnCl(,2). The apparent Km of RNA polymerase II for UTP was 0.016 mM in 0.05 M AS and 0.037 mM in 0.25 M AS. The apparent Km values for total polymerase activity was 0.008 mM and 0.036 mM at low and high ionic strenghts, respectively. These data indicate that Sertoli cell RNA polymerase activities have catalytic properties characteristic of eukaryotic polymerase activities in general. In the presence of 21 (mu)M testosterone, RNA polymerase II activity increased two fold at 15 minutes, then declined but was still elevated over control values six hours after androgen addition. Polymerase I+III activity was not greatly affected by testosterone. The stimulation of polymerase II measured at 15 minutes was dose-dependent, with a maximum at 0.53 nM and no further stimulation up to 10('-5) M (ED(,50) = 0.25 nM testosterone), and was androgen specific. The results of preliminary RNA isolation and characterization experiments suggested that the synthesis of several species of RNA was enhanced by testosterone administration. These findings have great potential importance since they represent the first demonstration of a direct effect of androgens on the transcriptional process in the Sertoli cell. Furthermore, the results of these studies constitute further evidence that the Sertoli cell is a target for androgen action in the testis. ^

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The espins are actin-binding and -bundling proteins localized to parallel actin bundles. The 837-amino-acid “espin” of Sertoli cell–spermatid junctions (ectoplasmic specializations) and the 253-amino-acid “small espin” of brush border microvilli are splice isoforms that share a C-terminal 116-amino-acid actin-bundling module but contain different N termini. To investigate the roles of espin and its extended N terminus, we examined the actin-binding and -bundling properties of espin constructs and the stoichiometry and developmental accumulation of espin within the ectoplasmic specialization. An espin construct bound to F-actin with an approximately threefold higher affinity (Kd = ∼70 nM) than small espin and was ∼2.5 times more efficient at forming bundles. The increased affinity appeared to be due to an additional actin-binding site in the N terminus of espin. This additional actin-binding site bound to F-actin with a Kd of ∼1 μM, decorated actin stress fiber-like structures in transfected cells, and was mapped to a peptide between the two proline-rich peptides in the N terminus of espin. Espin was detected at ∼4–5 × 106 copies per ectoplasmic specialization, or ∼1 espin per 20 actin monomers and accumulated there coincident with the formation of parallel actin bundles during spermiogenesis. These results suggest that espin is a major actin-bundling protein of the Sertoli cell–spermatid ectoplasmic specialization.

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Müllerian inhibiting substance (MIS) is a key element required to complete mammalian male sex differentiation. The expression pattern of MIS is tightly regulated in fetal, neonatal, and prepubertal testes and adult ovaries and is well conserved among mammalian species. Although several factors have been shown to be essential to MIS expression, its regulatory mechanisms are not fully understood. We have examined MIS promoter activity in 2-day postnatal primary cultures of rat Sertoli cells that continue to express endogenous MIS mRNA. Using this system, we found that the region between human MIS−269 and −192 is necessary for full MIS promoter activity. We identified by DNase I footprint and electrophoretic mobility-shift analyses a distal steroidogenic factor-1 (SF-1)-binding site that is essential for full promoter activity. Mutational analysis of this new distal SF-1 site and the previously identified proximal SF-1 site showed that both are necessary for transcriptional activation. Moreover, the proximal promoter also contains multiple GATA-4-binding sites that are essential for functional promoter activity. Thus multiple SF-1- and GATA-4-binding sites in the MIS promoter are required for normal tissue-specific and developmental expression of MIS.

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Transcription factor CREM (cAMP-responsive element modulator) plays a pivotal role in the nuclear response to cAMP in neuroendocrine cells. We have previously shown that follicle-stimulating hormone (FSH) directs CREM expression in male germ cells. The physiological importance of FSH in Sertoli cell function prompted us to analyze its effect on CREM expression in these cells. We observed a dramatic and specific increase in the CREM isoform ICER (inducible cAMP early repressor) expression, with a peak 4 h after FSH treatment of primary Sertoli cells. Interestingly, induced levels of ICER protein persist for a considerably longer time. Induction of the repressor ICER accompanies early down-regulation of the FSH receptor transcript, which leads to long-term desensitization. Here we show that ICER represses FSH receptor expression by binding to a CRE-like sequence in the regulatory region of the gene. Our results confirm the crucial role played by CREM in hormonal control and suggest its role in the long-term desensitization phenomenon of peptide membrane receptors.

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The expression of the cell adhesion molecules ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 and the secretion of the cytokine interleukin 6 have been measured in mouse Sertoli cells cultured in vitro. Cytometric analysis revealed that, in basal conditions, low levels of ICAM-1 and VCAM-1 were present on the surface of the cells, whereas treatment with interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, lipopolysaccharide, or interferon gamma induced, with different kinetics, increases in their expression. ICAM-2 was not detectable in basal conditions, nor was it inducible. Electron microscopic analysis and binding experiments using 51Cr-labeled lymphocytes demonstrated that increased expression of ICAM-1 and VCAM-1 on the surface of Sertoli cells, induced by inflammatory mediators, determines an augmented adhesion between the two cell types. The same stimuli, with the exception of interferon gamma, produced a rapid and remarkable increment of interleukin 6 production by Sertoli cells. These results suggest the presence of both direct and paracrine mechanisms of interaction between Sertoli and immune-competent cells, possibly involved in the control of immune reactions in the testis. Such mechanisms are of interest for the understanding of autoimmune pathologies of the testis and, if confirmed in humans, they could be involved in the sexual transmission of human immunodeficiency virus infection.

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Primary sex determination in placental mammals is a very well studied developmental process. Here, we aim to investigate the currently established scenario and to assess its adequacy to fully recover the observed phenotypes, in the wild type and perturbed situations. Computational modelling allows clarifying network dynamics, elucidating crucial temporal constrains as well as interplay between core regulatory modules.

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Bibliography of agriculture

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"Bibliographie": v. 1, p. [461]-468; v. 2, p. [702]-717.

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Includes bibliography.