Regeneração do autoimplante esplênico em ratos: avaliação morfofuncional e imuno-histoquímica

Diante da importância do baço, deve-se tentar a sua preservação sempre que possível e, nas situações em que a esplenectomia total é inevitável, a única alternativa para a preservação de sua função parece ser a realização do autoimplante esplênico. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi analisar o desenvolvimento da regeneração morfológica do tecido autoimplantado, sob microscopia de luz e por imunomarcação, e avaliar a regeneração funcional, por meio da depuração dos corpúsculos de Howell-Jolly, em ratos submetidos a esplenectomia total combinada com autoimplante esplênico. Foram utilizados 112 ratos Wistar albinos machos adultos, distribuídos aleatoriamente em 16 grupos. Semanalmente, durante 16 semanas, os sete animais de cada grupo foram submetidos a coleta sanguínea, sendo preparadas lâminas para avaliação da presença de corpúsculos de Howell-Jolly (avaliação funcional), que estiveram presentes durante as 15 primeiras semanas, sendo que, a partir da oitava semana, houve uma diminuição significativa, mas somente não foram mais identificados na 16 semana. Em seguida à coleta sanguínea, os animais correspondentes a cada semana foram mortos por sobredose anestésica e submetidos a relaparotomia para retirada do tecido esplênico autoimplantado regenerado. Posteriormente, esse tecido regenerado foi analisado sob microscopia de luz, onde, sob coloração de hematoxilina-eosina, observou-se regeneração morfológica completa do tecido autoimplantado a partir da oitava semana, sendo encontrado um tecido morfologicamente idêntico ao baço normal. Com a técnica de resorcina-fucsina de Weigert, identificaram-se fibras do sistema elástico, demonstrando elastogênese intensa no processo de regeneração do tecido esplênico autoimplantado. Na imunomarcação com antígeno de proliferação celular nuclear (PCNA), observou-se proliferação celular, evidenciando uma expressão gradativa das células a partir da 2 semana, sendo que, nas 9 e 10 semanas, observou-se aumento significativo na imunodensidade, quando comparadas às demais, o que não ocorreu com a técnica para caspase-3, onde a apoptose mais intensa ocorreu nas primeiras semanas. Nossos resultados mostram que, com oito semanas, existe regeneração morfológica do autoimplante esplênico, assemelhando-se a um baço normal, no mesmo momento em que parece iniciar-se a sua regeneração funcional.

Apoptose induzida por estreptococos do grupo B em células epiteliais respiratórias A549

Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial Δψm e co-localização com o Bax. Ensaio de espectrometria de massa identificou a proteína PI-2a, uma proteína estrutural de pili, que exibe atividade carboxipepdidase. Descobrimos que os dois sorotipos (III e V) induziram a produção ROS e NO em células A549. Em conclusão, a apoptose induzida pelo EGB em células A549 é um mecanismo importante de virulência, resultando na destruição de tecidos, escape do sistema imune do hospedeiro com espalhamento bacteriano e, em consequência, a doença invasiva ou uma infecção sistémica.

Estudo do metabolismo mitocondrial e da resposta anti-apoptótica de células endoteliais humanas durante a evolução da infecção por taquizoítos de Toxoplasma gondii

A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. A toxoplasmose é amplamente investigada visto que se apresenta como uma doença grave em pessoas imunodeprimidas (portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), não tratados, indivíduos transplantados, paciente em tratamento quimioterápico ou em uso de drogas supressoras e gestantes). A toxoplasmose congênita frequentemente pode levar ao aborto espontâneo ou até mesmo resultar na formação de crianças com algum grau de atraso no desenvolvimento mental e/ou físicos, deste modo, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava, pois os parasitos encontrados na circulação sanguinea são capazes de infectar as células endoteliais dos vasos e os tecidos circunjacentes, podendo resultar no encistamento do T. gondii. Atualmente a toxoplasmose vem sendo investigada devido a sua associação a inúmeras outras doenças, assim, estudos sobre a evolução da infecção por T. gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Ao invadir a célula hospedeira o parasito possui a capacidade de recrutar as mitocôndrias promovendo mudanças na organização mitocondrial ao longo da progressão da infecção, garantindo um ambiente favorável a sua multiplicação. Diante disso, investigamos se o parasito possui a capacidade de interferir no metabolismo mitocondrial e na resposta apoptótica da célula endotelial. O presente trabalho teve como objetivo analisar o metabolismo mitocondrial através da respirometria de alta-resolução e da resposta apoptótica através do western blotting das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas por 2, 6 e 20 horas por taquizoítos de T. gondii. A respirometria de alta-resolução revelou que o parasito interfere no metabolismo energético da célula hospedeira. A análise do conteúdo de proteínas da família Bcl-2 por western blotting revelou maior estímulo apoptótico no tempo inicial de infecção, quando comparado aos demais tempos. Os resultados dos conteúdos de caspase 3, proteína efetora da apoptose, não demonstrou diferença nos tempos iniciais de infecção Entretanto, em tempos mais tardios, o conteúdo de caspase 3 mostrou-se significativamente aumentado quando comparado às HUVEC não infectadas. A dinâmica de replicação do parasito foi observada através do monitoramento pelo sistema Time-Lapse Nikon BioStation IMQ em tempo real das células infectadas por T.gondii. Portanto, nossos resultados sugerem que o protozoário ao recrutar as mitocôndrias da célula hospedeira interfere no metabolismo mitocondrial e na modulação da apoptose para garantir um ambiente favorável a sua multiplicação.

Comparação do uso de noradrenalina, nitroprussiato e levosimendan na terapia do choque hipovolêmico: efeitos sobre a microcirculação e expressão gênica renal

Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos sistêmicos, microcirculatórios assim como mudanças na expressão gênica renal, causados pela ação da noradrenalina, nitropussiato de sódio e levosimendan no tratamento do choque hemorrágico. Nesse estudo foi utilizado o modelo da câmara dorsal.Os animais foram sujeitos a choque hemorrágico e após, foram aleatoriamente divididos em quatro grupos. Os grupos foram: CTRL, recebeu apenas ringer lactato; NPS recebeu ringer lactato com nitroprussiato de sódio; NA recebeu ringer lactato com noradrenalina e LEV, recebeu ringer lactato com levosimendan. Foram avaliados parâmetros sistêmicos, assim como parâmetros microcirculatórios (comparados como percentual em relação ao momento basal). Além disso, foi avaliada a expressão gênica renal de eNOS, HIF-1α, ICAM e caspase-3. O grupo NPS apresentou uma recuperação sustentada do diâmetro arteriolar ( 89 12 %) e DCF (125 114 %) ao final do tratamento. Houve recuperação da velocidade de hemácias nos grupos CTRL e NPS. Não houve diferença em relação ao número de leucócitos aderidos e/ou rolantes ao final do tratamento. A expressão gênica renal de eNOS e caspase-3 entre os grupos não apontou diferenças, entretanto houve diferença significativa na expressão renal de HIF- 1α no grupo NA (0,65 0,08, UA) em relação ao grupo CTRL (0,44 0,06, UA) e LEV (0,45 0,06, UA). Todos os grupos tiveram uma maior expressão de ICAM (0,65 0,12; 0,7 0,12; 0,069 0,06; 0,65 0,12, UA) em relação ao grupo SHAM (0,50 0,05, UA). Ringer lactato puro ou associado com noradrenalina ou levosimendan não foram suficientes para recuperar e sustentar os parâmetros microvasculares. O tratamento com nitroprussiato de sódio foi o que apresentou os melhores resultados, com recuperação dos diâmetros arteriolar, da DCF e velocidade de hemácias.

Modulação das vias de sinalização intracelulares pelo sistema NAD(P)H oxidase em melanoma humano

Evidências têm mostrado que as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela NAD(P)H oxidase são importantes moduladores de diversas funções celulares como migração, crescimento, proliferação e sobrevivência. Estudos recentes demonstraram o envolvimento da atividade da NAD(P)H oxidase no crescimento e sobrevivência de células de melanoma. Neste trabalho, investigamos o efeito da inibição da NAD(P)H oxidase por difenileneiodônio (DPI) sobre o crescimento das células de melanoma humano MV3 e observamos que este composto reduziu o crescimento destas células em aproximadamente 50%. A inibição da NAD(P)H oxidase induziu mudanças no formato celular, com arredondamento, diminuição do espraiamento e descolamento celular. Esta redução foi acompanhada por um rearranjo do citoesqueleto de actina, diminuição da fosforilação no resíduo Tyr397 da quinase de adesão focal (FAK) e redução na associação de FAK com actina e com a tirosina quinase c-Src. Isto indica que a inibição da geração de ROS está modulando negativamente vias de sinalização ativadas por integrinas, o que freqüentemente conduz a um tipo particular de morte celular conhecida por anoikis. Comprovando a ocorrência deste fenômeno, observamos que a inibição da atividade da NAD(P)H oxidase aumentou a apoptose das células de melanoma e induziu a ativação da caspase-3. Nossos resultados mostram ainda que a inibição da viabilidade celular por DPI foi revertida com o pré-tratamento das células MV3 com um inibidor de tirosina fosfatases (ortovanadato de sódio). Em resumo, este estudo mostra que a geração de ROS por NAD(P)H oxidase está envolvida nos mecanismos de sobrevivência em células de melanoma, uma vez que afetam as vias de sinalização dependentes de FAK-Src, através da inibição da atividade de proteína tirosina fosfatases.

爪哇伪枝藻胞外多糖诱导皮肤癌细胞(A431)凋亡的研究

为探讨爪哇伪枝藻胞外多糖(Extracellular polymeric substances ofScytonema javanicum,EPS)诱导人表皮癌A431细胞凋亡及其对凋亡相关基因caspase-3、bcl-2和bax表达的影响,本实验利用MTT法检测细胞生长抑制情况;HE染色法及透射电镜进行形态学观察;单细胞凝胶电泳法(SCGE/彗星电泳)分析DNA受损情况;免疫组织化学法检测细胞内caspase-3、bcl-2和bax表达水平。结果显示EPS能显著抑制A431细胞增殖,并呈时间和剂量依赖

Hexabromocyclododecane-induced developmental toxicity and apoptosis in zebrafish embryos

Hexabromocyclododecane (HBCD) is widely used as a brominated flame retardant, and has been detected in the aquatic environment, wild animals, and humans. However, details of the environmental health risk of HBCD are not well known. In this study, zebrafish embryos were used to assess the developmental toxicity of the chemical. Four-hour post-fertilization (hpf) zebrafish embryos were exposed to various concentrations of HBCD (0, 0.05, 0.1, 0.5, and 1.0 mg L-1) until 96 h. Exposure to 0.1, 0.5, and 1.0 mg L-1 HBCD significantly increased the malformation rate and reduced survival in the 0.5 and 1.0 mg L-1 HBCD exposure groups. Acridine orange (AO) staining showed that HBCD exposure resulted in cell apoptosis. Reactive oxygen species (ROS) was significantly induced at exposures of 0.1, 0.5, and 1.0 mg L-1 HBCD. To test the apoptotic pathway, several genes related to cell apoptosis, such as p53, Puma, Apaf-1, caspase-9, and caspase-3, were examined using real-time PCR. The expression patterns of these genes were up-regulated to some extent. Two anti-apoptotic genes, Mdm2 (antagonist of p53) and Bcl-2 (inhibitor of Bax), were down-regulated, and the activity of capspase-9 and caspase-3 was significantly increased. The overall results demonstrate that waterborne HBCD is able to produce oxidative stress and induce apoptosis through the involvement of caspases in zebrafish embryos. The results also indicate that zebrafish embryos can serve as a reliable model for the developmental toxicity of HBCD. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

Involvement of Fas/FasL system in apoptotic signaling in testicular germ cells of male Wistar rats injected i.v. with microcystins

Previous studies have shown that gonads were the second target organ of microcystins (MCs), and that MCs exposure exerted obvious toxic effects on male reproductive system of mammals. However, relevant molecular evidences are still lacking. Fas-signaling pathway plays a key role in toxicant-induced germ cell apoptosis. This study was to evaluate the responses of Fas/FasL system related genes and proteins in testes of rats injected intravenously with MCs. Enhanced apoptosis of germ cells in the testes of MCs-treated rats was detected by the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxy-UTP nick end labeling (TUNEL) associated with up-regulation of the Fas/FasL system. Both Fas and FasL protein expression were induced evidently from I h post-injection, and this high expression level maintained throughout the experiment. In addition, the activation of caspase-8 and caspase-3 protein was also observed, which were indicators of apoptosis. These results suggested the likely involvement of Fas/FasL system in the MCs-induced germ cell apoptosis. It is also suggested that MCs can cause damage to Sertoli cells directly. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

C1q-like inhibits p53-mediated apoptosis and controls normal hernatopoiesis during zebrafish embryogenesis

Except for the complement C1q, the immunological functions of other C1q family members have remained unclear. Here we describe zebrafish C1q-like, whose transcription and translation display a uniform distribution in early embryos, and are restricted to mid-hind brain and eye in later embryos. In vitro studies showed that C1q-like could inhibit the apoptosis induced by ActD and CHX in EPC cells, through repressing caspase 3/9 activities. Moreover, its physiological roles were studied by morpholino-mediated knockdown in zebrafish embryogenesis. In comparison with control embryos, the C1q-like knockdown embryos display obvious defects in the head and cramofacial development mediated through p53-induced apoptosis, which was confirmed by the in vitro transcribed C1q-like mRNA or p53 MO co-injection. TUNEL assays revealed extensive cell death, and caspase 3/9 activity measurement also revealed about two folds increase in C1q-like morphant embryos, which was inhibited by p53 MO co-injection. Real-time quantitative PCR showed the up-regulation expression of several apoptosis regulators such as p53, mdm2, p21, Box and caspase 3, and down-regulation expression of hbae1 in the C1q-like morphant embryos. Knockdown of C1q-like in zebrafish embryos decreased hemoglobin production and impaired the organization of mesencephalic vein and other brain blood vessels. Interestingly, exposure of zebrafish embryos to UV resulted in an increase in mRNA expression of C1q-like, whereas over-expression of C1q-like was not enough resist to the damage. Furthermore, C1q-like transcription was up-regulated in response to pathogen Aeromonas hydrophila, and embryo survival significantly decreased in the C1q-like morphants after exposure to the bacteria. The data suggested that C1q-like might play an antiapoptotic and protective role in inhibiting p53-dependent and caspase 3/9-mediated apoptosis during embryogenesis, especially in the brain development, and C1q-like should be a novel regulator of cell survival during zebrafish embryogenesis. (c) 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.

Mitochondrion-mediated apoptosis induced by Rana grylio virus infection in fish cells

A fish cell line, fathead minnow (FHM) cell, was used to investigate the alteration of mitochondrial dynamics and the mechanism of apoptosis under Rana grylio virus (RGV) infection. Microscopy observations, flow-cytometry analysis and molecular marker detection revealed the apoptotic fate of the RGV-infected cells. Some typical apoptotic characteristics, such as chromatin condensation, DNA fragmentation and mitochondrial fragmentation, were observed, and significantly morphological changes of mitochondria, including size, shape, internal structure and distribution, were revealed. The mitochondria in RGV-infected cells were aggregated around the viromatrix, and the aggregation could be blocked by colchicine. Moreover, the Delta psi m collapse was induced, and caspase-9 and caspase-3 were activated in the RGV-infected cells. In addition, NF-kappa B activation and intracellular Ca2+ increase were also detected at different times after infection. The data revealed the detailed dynamics of mitochondrion-mediated apoptosis induced by an iridovirus, and provided the first report on mitochondrial fragmentation during virus-induced apoptosis in fish cells.

Induction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromis niloticus)

Perfluorinated organic compounds (PFOCs) are emerging persistent organic pollutants (POPs) widely present in the environment, wildlife and human. We studied the cellular toxicology of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoic acid (PFOA) on oxidative stress and induction of apoptosis in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromis niloticus). Cultured hepatocytes were exposed to PFOS or PFOA (0, 1, 5, 15 and 30 mg L-1) for 24 h, and a dose-dependent decrease in cell viability was determined using trypan blue exclusion method. Significant induction of reactive oxygen species (ROS) accompanied by increases in activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione reductase (GR) were found, while activities of glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) were decreased. Glutathione (GSH) content was reduced following treatment of PFOA and PFOS. A dose-dependent increase in the lipid peroxidation (LPO) level (measured as maleic dialdehyde, MDA) was observed only in the PFOA exposure groups, whereas LPO remained unchanged in the PFOS exposure groups. Furthermore, a significant activation of caspase-3, -8, -9 activities was evident in both PFOS and PFOA exposure groups. Typical DNA fragmentation (DNA laddering) was further characterized by agarose gel electrophoresis. The overall results demonstrated that PFOS and PFOA are able to produce oxidative stress and induce apoptosis with involvement of caspases in primary cultured tilapia hepatocytes. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

The recombinant beta subunit of C-phycocyanin inhibits cell proliferation and induces apoptosis

C-Phycocyanin (C-PC) from blue-green algae has been reported to have various pharmacological characteristics, including antiinflammatory and anti-tumor activities. In this study, we expressed the beta-subunit of C-PC (ref to as C-POP) in Escherichia coli. We found that the recombinant C-PC/beta has anti-cancer properties. Under the treatment of 5 mu M of the recombinant C-PC/beta, four different cancer cell lines accrued high proliferation inhibition and apoptotic induction. Substantially, a lower response occurred in non-cancer cells. We investigated the mechanism by which C-PC/beta inhibits cancer cell proliferation and induces apoptosis. We found that the C-PC/beta interacts with membrane-associated beta-tubulin and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Under the treatment of the C-PC/beta, depolymerization of microtubules and actin-filaments were observed. The cells underwent apoptosis with an increase in caspase-3, and caspase-8 activities. The cell cycle was arrested at the G0/G1 phase under the treatment of C-PC/beta. In addition, the nuclear level of GAPDH decreased significantly. Decrease in the nuclear level of GAPDH prevents the cell cycle from entering into the S phase. Inhibition of cancer cell proliferation and induction of apoptosis may potentate the C-POP as a promising cancer prevention or therapy agent. (c) 2006 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

Survivin表达在高LET射线诱导细胞凋亡中作用机理的初步研究；A Preliminary Study on Action Mechanisms of Survivin Expression in Cell Apoptosis Induced by High-LET Radiation

先前的研究表明,肿瘤细胞中survivin的高表达与细胞对高传能线密度(LET)射线的辐射抗性相关。研究了survivin表达在高LET射线诱导的细胞凋亡中的作用,发现抑制survivin表达对高LETC离子辐射诱导的Bcl-2和Bax表达没有明显的影响。在高LET射线辐照中,survivin可能通过抑制caspase-3和-9活性的途径,抑制了细胞凋亡。

survivin表达对重离子诱导人肝癌HepG2细胞生物学效应的影响

放射治疗是肿瘤三大治疗手段之一（手术治疗、放疗、化疗），如何提高肿瘤细胞的放射敏感性一直是科研人员关注的研究方向。电离辐射导致细胞死亡的主要方式是细胞凋亡，然而肿瘤细胞内往往细胞凋亡信号通路异常，降低了治疗效果。其中细胞内高水平表达的细胞凋亡抑制蛋白（Inhibitor of Apoptosis Protein，IAP）抑制了caspase分子的活性，而caspase分子正是细胞凋亡的执行分子。因此科学家们通过各种手段尤其是RNA干涉的方法以抑制肿瘤细胞内细胞凋亡抑制蛋白的表达及蛋白活性来达到提高肿瘤治疗效果的目的。 Survivin是凋亡抑制蛋白家族的一员，该蛋白在大多数恶性肿瘤中高表达，而在正常组织中检测不到，因此具有组织特异性。Survivin参与肿瘤细胞分化并抑制肿瘤细胞凋亡，它的高表达被证明与很多恶性肿瘤对放射治疗中产生的辐射抗性相关。本文主要研究了不同LET射线辐照下人肝癌HepG2细胞 survivin的表达及其表达对重离子诱导的生物学效应的影响。首先，我们使用不同LET的碳离子束和X射线辐照HepG2细胞，采用标准克隆形成法确定其辐射敏感性，利用流式细胞技术（FCM）检测辐射后细胞周期分布，RT-PCR和western blotting检测survivin的表达。结果显示，人肝HepG2癌细胞经不同LET射线照射，survivin表达是不同的。与低LET的X射线相比，高LET碳离子诱导的细胞损伤和周期阻滞更明显，从而诱导了更强烈的survivin表达。 接着，根据Genbank提供的survivin序列，合成特异性survivin-siRNA寡核苷酸，转染HepG2细胞，抑制survivin的表达。我们发现siRNA转染后诱导了细胞G2/M期阻滞，增加了自发性和辐射诱导的细胞凋亡。在碳离子辐照后，siRNA细胞克隆存活率明显下降。这些结果显示survivin表达是细胞产生高LET辐射抗性的关键因素。最后，我们初步探讨了在细胞凋亡过程中，survivin基因的作用机制。发现抑制survivin表达，对离子束辐射诱导的Bcl-2和Bax表达没有明显的影响。Survivin表达直接抑制了caspase-3和-9的活性，从而抑制了细胞凋亡。以上的实验结果表明：不同LET射线辐照细胞后survivin出现差异表达，与X射线相比，高LET重离子诱导的HepG2细胞中survivin表达更明显，以survivin为靶基因的siRNA技术应用于HepG2细胞，可以极大提高该细胞对重离子辐射的敏感性。本论文研究为临床应用重离子束治疗癌症提供了非常有用的基础数据，同时也为重离子束放射治疗联合基因治疗提供了新的思路

Programmed cell death in Laminaria japonica (Phaeophyta) tissues infected with alginic acid decomposing bacterium

TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) is a sensitive and valid method for detecting DNA cleavage in programmed cell death (PCD). Using this method, DNA cleavage was observed in Laminaria japonica sporophytic tissues, which were infected with alginic acid decomposing bacterium. It was found that DNA cleavage occurred 5 min after the infection, the fragments with 3'-OH groups of cleaved nuclear DNA increased with time of infection and spread from the infection site. Although no typical DNA ladder (200 bp/ 180 bp) was detected by routine agarose gel electrophoresis, the cleavage of nuclear DNA fragments of 97 similar to 48.5 kb could be detected by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). By using CaspGLOW(TM) fluorescein active caspase-3 staining method, caspase-3 activity has been detected in response to the infection of alginic acid decomposing bacterium. Our results are similar to the observations in hypersensitive response (HR) of higher plant, suggesting that the rapid cell death of L. japonica infected by alginic acid decomposing bacterium might be involved in PCD, and indicating that the occurrence of PCD is an active defense process against the pathogen's infection.