Addition stéréosélective de nucléophiles sur un centre acétal : synthèse de nucléosides 1’,2’-cis

Plusieurs analogues de nucléosides thérapeutiques (Ara-C, Clofarabine), utilisés pour le traitement de leucémies, présentent un arrangement 1’,2’-cis entre la nucléobase reliée au centre anomère et le substituant (électroattracteur) en C-2’. Récemment, notre laboratoire a développé une approche synthétique pour former sélectivement des analogues de nucléosides et de thionucléosides 1’,2’-trans et 1’,2’-cis à partir de précurseurs acycliques. Ce mémoire présente une nouvelle méthodologie pour accéder efficacement aux analogues de nucléosides 1’,2’-cis à partir de furanosides. Différents groupements en position anomérique ont été examinés, sous conditions cinétiques en utilisant le bromure de diméthylbore pour générer sélectivement des produits acycliques ou cycliques. Les intermédiaires cinétiques de différents furanosides de méthyle formés en présence de Me2BBr ont été piégés in situ par un thiol pour générer des thioacétals acycliques avec de bonnes voire d’excellentes diastéréosélectivités. Les produits générés sont en accord avec une rétention globale de l’information stéréochimique du centre acétal et deux déplacements SN2 consécutifs ont été suggérés pour rationaliser ces résultats. Toutefois, l’objectif de synthétiser des analogues de nucléosides à partir de furanosides de méthyle a échoué. Tel que démontré par le Dr Michel Prévost, l’activation par Me2BBr des lactols des quatres différents furanosides suivie d’une addition in situ d’une base silylée a permis de former diastéréosélectivement les analogues de nucléosides 1’,2’-cis correspondants avec d’excellents rendements. Nous avons démontré que d’autres substrats peuvent être employés et que l’induction stéréochimique est sous contrôle du substituant électroattracteur en C-2. D’autres acides de Lewis, tel que TMSBr, peuvent également être utilisés. Cette méthodologie a également été étendue à d’autres nucléophiles tels que des Grignards ou des éthers d’énols silylés, conduisant à de bonnes sélectivités.

Study of the diffusion in polymer solutions and hydrogels by NMR spectroscopy and NMR imaging

Afin d'étudier la diffusion et la libération de molécules de tailles inférieures dans un gel polymère, les coefficients d'auto-diffusion d'une série de polymères en étoile avec un noyau d'acide cholique et quatre branches de poly(éthylène glycol) (PEG) ont été déterminés par spectroscopie RMN à gradient de champ pulsé dans des solutions aqueuses et des gels de poly(alcool vinylique). Les coefficients de diffusion obtenus ont été comparés avec ceux des PEGs linéaires et dendritiques pour étudier l'effet de l'architecture des polymères. Les polymères en étoile amphiphiles ont des profils de diffusion en fonction de la concentration similaires à leurs homologues linéaires dans le régime dilué. Ils diffusent plus lentement dans le régime semi-dilué en raison de leur noyau hydrophobe. Leurs conformations en solution ont été étudiées par des mesures de temps de relaxation spin-réseau T1 du noyau et des branches. L'imagerie RMN a été utilisée pour étudier le gonflement des comprimés polymères et la diffusion dans la matrice polymère. Les comprimés étaient constitués d'amidon à haute teneur en amylose et chargés avec de l'acétaminophène (de 10 à 40% en poids). Le gonflement des comprimés, ainsi que l'absorption et la diffusion de l'eau, augmentent avec la teneur en médicament, tandis que le pourcentage de libération du médicament est similaire pour tous les comprimés. Le gonflement in vitro des comprimés d'un complexe polyélectrolyte à base d'amidon carboxyméthylé et de chitosane a également été étudié par imagerie RMN. Ces comprimés sont sensibles au pH : ils gonflent beaucoup plus dans les milieux acides que dans les milieux neutres en raison de la dissociation des deux composants et de la protonation des chaînes du chitosane. La comparaison des résultats avec ceux d'amidon à haute teneur en amylose indique que les deux matrices ont des gonflements et des profils de libération du médicament semblables dans les milieux neutres, alors que les comprimés complexes gonflent plus dans les milieux acides en raison de la dissociation du chitosane et de l'amidon.

Contrôle de l'expression de la protéine PHEX et rôle de PHEX et FGF23 dans la minéralisation par les cellules MC3T3

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence.

Développement d'outils de surveillance biologique pour l'évaluation des risques à la santé des travailleurs en arboriculture et en viticulture exposés aux fongicides

De nombreux travailleurs utilisent le captan et le folpet comme fongicides en agriculture, mais leur exposition n’est pas toujours mesurée de manière spécifique et précise. La surveillance biologique est un excellent outil à cet effet puisqu’elle permet de quantifier l’exposition réelle. Toutefois, la majorité des connaissances toxicologiques pour ces fongicides proviennent d’études sur les animaux, et les données chez l’humain sont limitées. Le but du présent projet est donc de développer des outils de surveillance biologique pour évaluer l’exposition de travailleurs au captan et au folpet. Dans cette perspective, le projet a été subdivisé en trois parties complémentaires, soit i) de développer des méthodes analytiques spécifiques pour quantifier les biomarqueurs d’intérêt du captan, à savoir le tétrahydrophtalimide (THPI), et du folpet, à savoir le phtalimide (PI) et l’acide phtalique, dans le plasma et l’urine; ii) de déterminer la toxicocinétique des deux fongicides en exposant des volontaires de façon aigüe à de faibles doses de captan ou de folpet par voie orale et cutanée dans des conditions semi-contrôlées et en quantifiant les biomarqueurs dans chacune des deux matrices, excepté l’acide phtalique qui a été mesuré seulement dans l’urine; iii) de valider les biomarqueurs d’exposition sélectionnés et d’évaluer l’exposition réelle des travailleurs et les voies prédominantes d’exposition au captan et au folpet en collectant des données biologiques chez des travailleurs en arboriculture et en viticulture lors d’activités de traitement et d’effeuillage pendant sept jours consécutifs. Selon ces travaux, le THPI et le PI sont deux biomarqueurs valides et spécifiques pour quantifier l’exposition au captan et au folpet, respectivement, chez l’humain. En effet, les méthodes développées pour ces deux métabolites sont robustes avec des limites de détection plus sensibles que celles rapportées dans la littérature, un taux de recouvrement de 90% pour le THPI et de 75% pour le PI, une très bonne linéarité (R2>0,99) et une bonne stabilité avec des variations intra- et inter-journalières faibles (RSD<15%). Elles ont permis de déterminer les profils cinétiques des deux métabolites chez les volontaires et chez les travailleurs. Ces derniers indiquent d’ailleurs une élimination rapide, avec une demi-vie d’élimination dans l’urine de 11,7 h et 18,7 h pour le THPI et de 27,3 h et 28,8 h pour le PI, respectivement après une absorption par voie orale et cutanée, ainsi qu’une faible absorption cutanée lorsque les valeurs sont comparées pour les deux voies d’exposition. Des profils parallèles sont aussi observés entre le PI et l’acide phtalique pour les volontaires et les agriculteurs, mais le folpet se retrouve davantage métabolisé sous forme d’acide phtalique que de PI. Quant à l’étude des agriculteurs, elle montre que la voie principale d’exposition de ces travailleurs est la voie cutanée. Il est aussi souligné qu’il est important 1) de favoriser les collectes d’urines complètes sur 24 h au urines ponctuelles, 2) de mesurer plusieurs métabolites, et 3) d’associer les données de surveillance biologique à la toxicocinétique. Ainsi, les connaissances acquises par cette étude peuvent s’appliquer à d’autres fongicides, voire d’autres substances.

Rôle du stress oxydant en période néonatale dans l'hypertension artérielle et la dysfonction vasculaire et métabolique de l'adulte

Thèse réalisée dans le cadre d'une cotutelle entre l'Université de Montréal et l'Université d'Auvergne en France

Études des interactions détergents/lipides dans les systèmes membranaires

Les liposomes sont des structures sphériques formés par l'auto-assemblage de molécules amphiphiles sous forme d'une bicouche. Cette bicouche sépare le volume intérieur du liposome du milieu extérieur, de la même manière que les membranes cellulaires. Les liposomes sont donc des modèles de membranes cellulaires et sont formulés pour étudier les processus biologiques qui font intervenir la membrane (transport de molécules à travers la membrane, effets des charges en surface, interactions entre la matrice lipidique et d'autres molécules, etc.). Parce qu'ils peuvent encapsuler une solution aqueuse en leur volume intérieur, ils sont aussi utilisés aujourd'hui comme nanovecteurs de principes actifs. Nous avons formulé des liposomes non-phospholipidiques riches en stérol que nous avons appelés stérosomes. Ces stérosomes sont composés d'environ 30 % d'amphiphiles monoalkylés et d'environ 70 % de stérols (cholestérol, Chol, et/ou sulfate de cholestérol, Schol). Quand certaines conditions sont respectées, ces mélanges sont capables de former une phase liquide ordonnée (Lo) pour donner, par extrusion, des vésicules unilamellaires. Certaines de ces nouvelles formulations ont été fonctionnalisées de manière à libérer leur contenu en réponse à un stimulus externe. En incorporant des acides gras dérivés de l’acide palmitique possédant différents pKa, nous avons pu contrôler le pH auquel la libération débute. Un modèle mathématique a été proposé afin de cerner les paramètres régissant leur comportement de libération. En incorporant un amphiphile sensible à la lumière (un dérivé de l’azobenzène), les liposomes formés semblent répondre à une radiation lumineuse. Pour ce système, il serait probablement nécessaire de tracer le diagramme de phase du mélange afin de contrôler la photo-libération de l’agent encapsulé. Nous avons aussi formulé des liposomes contenant un amphiphile cationique (le chlorure de cétylpyridinium). En tant que nanovecteurs, ces stérosomes montrent un potentiel intéressant pour la libération passive ou contrôlée de principes actifs. Pour ces systèmes, nous avons développé un modèle pour déterminer l’orientation des différentes molécules dans la bicouche. La formation de ces nouveaux systèmes a aussi apporté de nouvelles connaissances dans le domaine des interactions détergents-lipides. Aux nombreux effets du cholestérol (Chol) sur les systèmes biologiques, il faut ajouter maintenant que les stérols sont aussi capables de forcer les amphiphiles monoalkylés à former des bicouches. Cette nouvelle propriété peut avoir des répercussions sur notre compréhension du fonctionnement des systèmes biologiques. Enfin, les amphiphiles monoalkylés peuvent interagir avec la membrane et avoir des répercussions importantes sur son fonctionnement. Par exemple, l'effet antibactérien de détergents est supposé être dû à leur insertion dans la membrane. Cette insertion est régie par l'affinité existant entre le détergent et cette dernière. Dans ce cadre, nous avons voulu développer une nouvelle méthode permettant d'étudier ces affinités. Nous avons choisi la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) pour sa sensibilité. Les hypothèses permettant de déterminer cette constante d’affinité se basent sur l’incapacité du détergent à exalter le signal SERS lorsque le détergent est inséré dans la membrane. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus par titration calorimétrique isotherme (ITC). Les résultats ont montré des différences. Ces différences ont été discutées.

Poly(ethylene-co-acrylic acid) random copolymers : amphiphilic properties and self-assembly in aqueous medium

Les travaux de recherche présentés ici avaient pour objectif principal la synthèse de copolymères statistiques à base d’éthylène et d’acide acrylique (AA). Pour cela, la déprotection des groupements esters d’un copolymère statistique précurseur, le poly(éthylène-co-(tert-butyl)acrylate), a été effectuée par hydrolyse à l’aide d’iodure de triméthylsilyle. La synthèse de ce précurseur est réalisée par polymérisation catalytique en présence d’un système à base de Palladium (Pd). Le deuxième objectif a été d’étudier et de caractériser des polymères synthétisés à l’état solide et en suspension colloïdale. Plusieurs copolymères précurseurs comprenant différents pourcentages molaires en tert-butyl acrylate (4 à 12% molaires) ont été synthétisés avec succès, puis déprotégés par hydrolyse pour obtenir des poly(éthylène-coacide acrylique) (pE-co-AA) avec différentes compositions. Seuls les copolymères comprenant 10% molaire ou plus de AA sont solubles dans le Tétrahydrofurane (THF) et uniquement dans ce solvant. De telles solutions peuvent être dialysées dans l’eau, ce qui conduit à un échange lent entre cette dernière et le THF, et l’autoassemblage du copolymère dans l’eau peut ensuite être étudié. C’est ainsi qu’ont pu être observées des nanoparticules stables dans le temps dont le comportement est sensible au pH et à la température. Les polymères synthétisés ont été caractérisés par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ainsi que par spectroscopie Infra-Rouge (IR), avant et après déprotection. Les pourcentages molaires d’AA ont été déterminés par combinaison des résultats de RMN et ii de titrages conductimètriques. A l’état solide, les échantillons ont été analysés par Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et par Diffraction des rayons X. Les solutions colloïdales des polymères pE-co-AA ont été caractérisées par Diffusion dynamique de la lumière et par la DSC-haute sensibilité. De la microscopie électronique à transmission (TEM) a permis de visualiser la forme et la taille des nanoparticules.

Caractérisation moléculaire du rôle de facteurs accessoires ArgR et PepA au niveau de la recombinaison spécifique sur le site cer

Mon projet de recherche avait pour but de caractériser le rôle de deux protéines, ArgR et PepA, qui agissent en tant que facteurs accessoires de la recombinaison au niveau de deux sites cer du plasmide ColE1 présent dans la bactérie Escherichia coli. Ces deux protéines, couplées aux deux recombinases à tyrosine XerC et XerD, permettent la catalyse de la recombinaison site spécifique au niveau de la séquence cer, convertissant les multimères instables de ColE1 en monomères stables. Cette étude a principalement porté sur la région C-terminale de la protéine ArgR. Cette région de la protéine ArgR possède une séquence en acides-aminés et une structure similaire à celle de la protéine AhrC de Bacillus subtilis. De plus, AhrC, le répresseur de l’arginine de cette bactérie, est capable de complémenter des Escherichia coli mutantes déficientes en ArgR. Les régions C-terminales de ces protéines, montrent une forte similarité. De précédents travaux dans notre laboratoire ont démontré que des mutants d’ArgR comprenant des mutations dans cette région, en particulier les mutants ArgR149, une version tronquée d’ArgR de 149 acides-aminés, et ArgR5aa, une version comprenant une insertion de cinq acides-aminés dans la partie C-terminale, perdaient la capacité de permettre la recombinaison au niveau de deux sites cer présents dans le plasmide pCS210. Malgré cette incapacité à promouvoir la réaction de recombinaison en cer, ces deux mutants étaient toujours capables de se lier spécifiquement à l’ADN et de réprimer une fusion argA :: lacZ. Dans ce travail, les versions mutantes et sauvages d’ArgR furent surexprimées en tant que protéines de fusion 6-histidine. Des analyses crosslinking ont montré que la version sauvage et ArgR5aa pouvaient former des hexamères in-vitro de manière efficace, alors qu’ArgR149 formait des multimères de plus faible poids moléculaire. Des formes tronquées d’ArgR qui comportaient 150 acides-aminés ou plus, étaient encore capables de permettre la recombinaison en cer. Les mutants par substitution ArgRL149A et ArgRL151A ont tous montré que les substitutions d’un seul acide-aminé au sein de cette région avaient peu d’effets sur la recombinaison en cer. Les expériences de crosslinking protéine-à-protéine ont montré que le type sauvage et les formes mutantes d’ArgR étaient capables d’interagir avec la protéine accessoire PepA, également impliquée dans la recombinaison en cer. Les expériences de recombinaison in-vitro utilisant la forme sauvage et les formes mutantes d’ArgR combinées avec les protéines PepA, XerC et XerD purifiées, ont montré que le mutant ArgR149 ne soutenait pas la recombinaison, mais que le mutant ArgR5aa permettait la formation d’une jonction d’Holliday. Des expériences de topologie ont montré que PepA était capable de protéger l’ADN de la topoisomérase 1, et d’empêcher ArgRWt de se lier à l’ADN. Les deux mutants ArgR149 et ArgR5aa protègent aussi l’ADN avec plus de surenroulements. Quand on ajoute PepA, les profils de migration montrent un problème de liaison des deux mutants avec PepA. D’autres expériences impliquant le triplet LEL (leucine-acide glutamique-leucine) et les acides-aminés alentour devraient être réalisés dans le but de connaitre l’existence d’un site de liaison potentiel pour PepA.

Effect of fatty acids on hyphal growth in the pathogenic yeast Candida albicans

Candida albicans est une levure pathogène qui, à l’état commensal, colonise les muqueuses de la cavité orale et du tractus gastro-intestinal. De nature opportuniste, C. albicans cause de nombreuses infections, allant des candidoses superficielles (muguet buccal, vulvo-vaginite) aux candidoses systémiques sévères. C. albicans a la capacité de se développer sous diverses morphologies, telles que les formes levures, pseudohyphes et hyphes. Des stimuli environnementaux mimant les conditions retrouvées chez l’hôte (température de 37°C, pH neutre, présence de sérum) induisent la transition levure-à-hyphe (i.e. morphogenèse ou filamentation). Cette transition morphologique contribue à la pathogénicité de C. albicans, du fait que des souches présentant un défaut de filamentation sont avirulentes. Non seulement la morphogenèse est un facteur de virulence, mais elle constituerait aussi une cible pour le développement d’antifongiques. En effet, il a déjà été démontré que l’inhibition de la transition levure-à-hyphe atténuait la virulence de C. albicans lors d’infections systémiques. Par ailleurs, des études ont démontré que de nombreuses molécules pouvaient moduler la morphogenèse. Parmi ces molécules, certains acides gras, dont l’acide linoléique conjugué (CLA), inhibent la formation d’hyphes. Ainsi, le CLA posséderait des propriétés thérapeutiques, du fait qu’il interfère avec un déterminant de pathogénicité de C. albicans. Par contre, avant d’évaluer son potentiel thérapeutique dans un contexte clinique, il est essentiel d’étudier son mode d’action. Ce projet vise à caractériser l’activité anti-filamentation des acides gras et du CLA et à déterminer le mécanisme par lequel ces molécules inhibent la morphogenèse chez C. albicans. Des analyses transcriptomiques globales ont été effectuées afin d’obtenir le profil transcriptionnel de la réponse de C. albicans au CLA. L’acide gras a entraîné une baisse des niveaux d’expression de gènes encodant des protéines hyphes-spécifiques et des régulateurs de morphogenèse, dont RAS1. Ce gène code pour la GTPase Ras1p, une protéine membranaire de signalisation qui joue un rôle important dans la transition levure-à-hyphe. Des analyses de PCR quantitatif ont confirmé que le CLA inhibait l’induction de RAS1. De plus, le CLA a non seulement causé une baisse des niveaux cellulaires de Ras1p, mais a aussi entraîné sa délocalisation de la membrane plasmique. En affectant les niveaux et la localisation cellulaire de Ras1p, le CLA nuit à l’activation de la voie de signalisation Ras1p-dépendante, inhibant ainsi la morphogenèse. Il est possible que le CLA altère la structure de la membrane plasmique et affecte indirectement la localisation membranaire de Ras1p. Ces travaux ont permis de mettre en évidence le mode d’action du CLA. Le potentiel thérapeutique du CLA pourrait maintenant être évalué dans un contexte d’infection, permettant ainsi de vérifier qu’une telle approche constitue véritablement une stratégie pour le traitement des candidoses.

Stabilité de l’acide ribonucléique pour la datation des fluides corporels en biologie judiciaire

Projet de recherche réalisé en collaboration avec la section Biologie/ADN du Laboratoire de sciences judiciaires et de médecine légale (LSJML) de Montréal.

Optimisation de la concentration en électrolytes au sein des matrices à base de HASCA pour la libération prolongée

Le sel sodique du carboxyméthylamidon à haute teneur en amylose, HASCA (Amylose 60%-amylopectine 40%), est un polymère hydrophile ionique utilisé pour obtenir des comprimés matriciels à libération prolongée. Il est caractérisé par la formation d'un hydrogel lors de la mise en contact avec le milieu de dissolution. La libération du principe actif (PA) à travers ce polymère est principalement contrôlée par la diffusion fickienne et la relaxation du réseau polymérique. De plus, la solubilité du PA est un facteur qui permet de moduler la libération, cependant, la solubilité d’un médicament dépend de la forme utilisée et du pH. Les bases ou les acides libres présentent une solubilité moins élevée que leurs sels. Nous proposons d’étudier l’effet d’une combinaison entre le sel et la forme acide ou le sel et la forme alcaline dans le même comprimé matriciel d’HASCA. Comme objectif de ce travail, nous étudions l’influence de la nature du polymère sur le profil de libération de PA dans un milieu aqueux en gradient de pH à cause de la nature des matrices à base d’HASCA caractérisées par la présence de groupement carboxyliques, ionisés ou non selon l’acidité du milieu de dissolution. Nous étudions également l’influence de la nature du PA (base libre ou son sel vs acide libre ou son sel) sur le profil de libération, ceci en sélectionnant des PAs modèles représentatifs de chaque catégorie. L’influence de changement de proportions entre la forme libre (acide ou base) et son sel sur le profil de libération est aussi investiguée. Pour ce, des comprimés à base de HASCA avec des proportions différentes de, soit le naproxène acide et le naproxène de sodium (PA acide et son sel), soit la tétracycline et le chlorhydrate de tétracycline (PA alcalin et son sel) ont été utilisés. Ceux-ci sont évalués lors des tests de dissolution dans un milieu simulant le milieu gastro-intestinal, selon les normes de l’USP (spectrophotométrie UV). Nous avons également menés des études de vitesse de dissolution intrinsèque sur les PAs purs, afin de déterminer leur solubilité et vitesse de libération dans les même pH de dissolution étudiés. Nous avons réussit d’obtenir des comprimés matriciels à base de HASCA convenables à être administrés une fois par jour en utilisant une combinaison du naproxène acide et son sel comme PA. Tandis que les résultats ont montré qu’en utilisant la tétracycline et son sel, les temps de libération étaient trop élevés pour permettre la réalisation d’une formulation convenable pour une administration quotidienne unique

Antiproliferative effects of retinoic acid in breast cancer

Les rétinoïdes sont utilisés dans le traitement d’une variété de tumeurs malignes et lésions précancéreuses. Leurs effets dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs solides tel que le cancer du sein ont été étudiés extensivement. Cependant, les bénéfices dans le cancer du sein restent à date peu clairs. Ceci est probablement du à l’hétérogénéité des tumeurs mammaires et la réponse très variable aux effets antiprolifératifs de l’acide rétinoïque. Dans les lignées cellulaires cancéreuses mammaires, la réponse l’AR est fortement corrélée au niveau d’expression du récepteur aux estrogènes alpha (ERα), qui régule l’expression du gène qui encode le récepteur à l’acide rétinoïque alpha, RARA. Malgré cela, certaines lignées cellulaires ER-négatives, comme la lignée HER2-positive SK-BR-3, ont été décrites comme étant sensibles à l’AR. Dans le Chapter 2: de cette thèse, nous avons étudié les mécanismes de la signalisation ER-dépendante et ER-indépendante dans les cellules cancéreuses mammaires. Nous avons utilisé des lignées ER-négatives et ER-positives pour démontrer qu’une partie de la réponse à l’AR est indépendante de la signalisation par ER. Nous avons identifié plusieurs gènes cibles primaires de l’AR qui ont des effets similaires à l’AR quand ils sont surexprimés dans des cellules mammaires cancéreuses. Cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes complexes qui mènent à l’arrêt de croissance induit par l’AR dans les cellules cancéreuses mammaires. Dans le Chapitre 3, nous avons regardé plus en détails la signalisation ER-indépendante par l’AR dans des cellules ayant une amplification des gènes HER2 et RARA et nous avons identifié une synergie entre l’AR et le Herceptin dans ces cellules. Nous proposons que les gènes FOXO jouent une rôle dans cette synergie. Les cellules SK BR 3, ayant une coamplification HER2/RARA, pourraient représenter une classe de tumeurs qui pourraient bénéficier d’un traitement avec des rétinoïdes, en augmentent la réponse au Herceptin et potentiellement en réduisant la résistance au Herceptin. En conclusion, les données présentées dans cette thèse aident à mieux comprendre les mécanismes menant à l’arrêt de croissance induit par l’AR dans les cellules cancéreuses mammaires et fournissent une application potentielle pour l’utilisation de l’AR dans le traitement du cancer du sein.

Monocouches peptidiques auto-assemblées et applications dans le domaine des biocapteurs de résonance de plasmon de surfaces

Ces travaux visent à étendre les applications de la résonance de plasmons de surface (SPR) L’objectif est d’offrir des outils diagnostics plus rapides, efficaces et simple d’utilisation pour diagnostiquer ou effectuer le suivi de conditions cliniques. Pour se faire, un nouveau type d’instrumentation SPR basé sur l’utilisation d’un prisme d’inversion (dove) a permis d’atteindre une limite de détection (LOD) de 10-6 unité d’indice de réfraction (RIU), une valeur comparable aux instruments commerciaux complexes tout en demeurant peu dispendieux, robuste et simple d’utilisation. Les travaux présentés dans cet ouvrage visent, dans un second temps, à réduire les interactions nonspécifiques (NSB) entre la surface des biocapteurs SPR et les composants de la matrice biologique complexe telles que: l’urine, le lysat cellulaire, le sérum et le sang. Ces dernières induisent des réponses empêchant l’utilisation de biocapteurs SPR en milieux complexes. Les acides aminés (AA) offrent une grande variété de propriétés physico-chimiques permettant la mise au point de monocouches auto-assemblées (SAM) aux propriétés diverses. Initialement, 19 des 20 acides aminés naturels ont été attachés à l’acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) formant des SAMs peptidomimétiques. La quantité d’interactions nonspécifiques engendrées par ces différentes surfaces a été mesurée en exposant ces surfaces au sérum sanguin bovin complet variant de 400 ng/cm² jusqu’à 800 ng/cm². La détection à l’aide de ces surfaces de la β-lactamase (une enzyme responsable de la résistance aux antibiotiques au niveau μM) a démontré la possibilité d’employer ces surfaces pour bâtir des biocapteurs SPR. Des peptides de longueur allant de 2 à 5 résidus attachés à 3-MPA ont été synthétisés sur support solide. Cette étude a démontré que l’augmentation de la longueur des peptides formés d’AA résistants aux NBS accroit leur résistance jusqu’à 5 résidus. Le composé le plus performant de ce type (3-MPA-(Ser)5-OH) a permis d’atteindre 180 ng/cm². Cette valeur est similaire à celle des meilleures surfaces disponibles commercialement, notamment les surfaces de polyethylène glycol (PEG) à 100 ng/cm². Des surfaces de 3-MPA-(Ser)5-OH ont permis l’étalonnage de la β-lactamase et sa quantification directe dans un lysat cellulaire. La LOD pour ces biocapteurs est de 10 nM. Une troisième génération de surfaces peptidiques binaires a permis la réduction de la NSB jusqu’à un niveau de 23±10 ng/cm² une valeur comparable aux meilleures surfaces disponibles. Ces surfaces ont permis l’étalonnage d’un indicateur potentiel du cancer la metalloprotéinase-3 de matrice (MMP-3). Les surfaces formées de peptides binaires (3-MPA-H3D2-OH) ont permis la quantification directe de la MMP-3 dans le sérum sanguin complet. Une quatrième génération de surfaces peptidiques a permis de réduire davantage le niveau de NSB jusqu’à une valeur de 12 ± 11 ng/cm². Ces surfaces ont été modifiées en y attachant une terminaison de type acide nitriloacétique (NTA) afin d’y attacher des biomolécules marquées par six résidus histidines terminaux. Ces surfaces ont permis le développement d’une méthode rapide de balayage des ligands ciblant le « cluster of differenciation-36 » (CD36). L’étude d’électroformation des monocouches de peptide a permis de déterminer les conditions de formation optimales d’une couche de 3-MPA-HHHDD-OH permettant ainsi la formation de monocouches résistantes au NSB en moins de 6 minutes en appliquant un potentiel de formation de 200mV vs Ag/AgCl.

Synthèse et caractérisation physicochimique de peptides de polyglutamines

Neuf maladies neurodégénératives sont le produit de l’expression de gènes mutés, dans lesquels le codon CAG est répété au-delà d’un seuil pathologique. Ceci produit des protéines mutantes dans lesquelles sont insérés des segments de polyglutamines (polyGln), qui perdent leur activité et acquièrent une nouvelle fonction, ce qui est toxique pour le neurone. Ces altérations sont attribuables aux propriétés particulières de la polyGln. En effet, ces dernières possèdent la capacité de s’assembler pour former des corps d’inclusion intracellulaires. Cette propension à l’agrégation de la polyGln rend difficile l’étude de ces pathologies. C’est ainsi que l’utilisation de peptides peut s’avérer une approche avantageuse. Toutefois, la synthèse de polyGln est associée à de nombreuses délétions et nécessite l’ajout de groupements chargés afin de permettre leur purification. Cependant, ce prérequis donne lieu à des interactions électrostatiques qui biaisent la structure et la cinétique d’agrégation de ces peptides, en plus d’interférer avec l’évaluation d’éventuels agents thérapeutiques. L’objectif du projet est de développer un système permettant l’étude de la polyGln en s’affranchissant des effets de charges. Pour ce faire, deux approches ont été explorées, la première utilise la polyGln non chargée et la seconde utilise une structure polyGln-morpholine ayant des charges labiles en fonction du pH. Ces peptides ont été produits en utilisant une approche linéaire de synthèse peptidique sur support solide avec protection maximale des chaînes latérales. La purification a été effectuée par chromatographie de haute performance en phase inverse en milieu acide. Ces stratégies ont permis de produire des peptides de polyGln de grande pureté avec des rendements acceptables. Une procédure de solubilisation des peptides alliant sonication et lyophilisation a été développée afin d’étudier chacun de ces peptides à l’aide de diverses techniques physicochimiques, telles que la diffusion de la lumière, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, Raman et UV-visible, le dichroïsme circulaire et la microscopie optique polarisée. La polyGln non chargée solubilisée dans le trifluoroéthanol-eau a montré que la taille des particules et la vitesse d’agrégation sont proportionnelles à la fraction volumique en eau. De plus, la structure secondaire en solution est à prédominance alpha et semble être peu sensible à la fraction d’eau jusqu’à un certain seuil (25%) après lequel la structure aléatoire prédomine. L’analyse des agrégats à l’état solide montre des structures hélicoïdales > aléatoires et ont les caractéristiques des fibrilles amyloïdes. Le peptide de polyGln-morpholines a un pKa de 7,3 en milieu aqueux. Il demeure en solution lorsque le pH < pKa et à faible force ionique, alors qu’il s’autoassemble lorsque ces conditions ne sont pas respectées. Ceci suggère que la répulsion électrostatique est responsable de la stabilisation du peptide en solution. La dimension fractale nous indique que le peptide forme des agrégats compacts dont les constituants ont une taille de 2,5 nm, compatibles avec une conformation aléatoire compacte, en coude bêta ou hélicoïdale. Ceci est en accord avec l’étude structurale des peptides en solution qui a montré des espèces aléatoires > bêta > alpha. De plus, en RMN, l’élargissement des signaux du 1Hγ en cours d’agrégation suggère une interaction via les chaînes latérales. Les analyses en phase solide ont plutôt montré une prédominance de structures bêta et alpha. L’inhibition de l’agrégation à pH 8 varie selon rouge de Congo > tréhalose, alors que le peptide liant la polyGln 1 et la thioflavine T ne semble pas avoir d’effet. Ces approches ont donc permis pour la première fois de s’affranchir des effets de charges auparavant inhérents à l’étude de la polyGln en solution et par conséquent d’obtenir des informations inédites quant à la solubilité, la structure et la cinétique d’agrégation. Enfin, le dispositif à charges labiles permet d’évaluer l’efficacité d’éventuels agents thérapeutiques à pH quasi physiologique.

Étude de prévalence et associations des gènes de virulence et résistance aux antimicrobiens d’Escherichia coli de la flore intestinale du poulet sain

Les Escherichia coli pathogènes de la volaille (APEC) font partie des E. coli extra-intestinaux pathogènes (ExPEC) et seraient un réservoir possible de gènes de virulence et de résistance aux antimicrobiens (RAM) des ExPEC chez l’humain. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’effet d’un prébiotique et d’un mélange d’acide organique et d’huiles essentielles encapsulés sur la prévalence des gènes de virulence des ExPEC et de RAM, ainsi que les associations entre ces gènes chez E. coli de l’intestin du poulet sain. Des échantillons de contenus caecaux de poulets de 29 jours d’âge ayant reçu un de ces ingrédients alimentaires comparativement à des témoins ont été analysés pour la présence des gènes de virulence iucD, tsh, papC et des gènes de RAM blaTEM, blaSHV, tetA, tetC, blaCMY-2, aadA1, aac3 par PCR. La prévalence d’iucD était supérieure dans le groupe témoin comparativement aux groupes «prébiotique» et «acide organique» et la prévalence de papC était affectée dans le groupe «acide organique». La prévalence d’isolats d’E.coli positifs pour blaCMY-2 était supérieure dans le groupe témoin comparée aux groupes «prébiotique» et «acide organique», tel que démontré par la technique d’hybridation de l’ADN sur HGMF (Hydrophobic Grid Membrane Filter). De plus, la prévalence des isolats d’E. coli positifs pour tetA, blaTEM, aadA1 ou tsh était affectée par les ingrédients alimentaires. Dans l’ensemble, des associations entre la présence de tsh et iucD, blaTEM et aadA1, et iucD et blaCMY-2 ont été observées. .Cette étude démontre l’utilité de certains ingrédients alimentaires pour dimunier le risque d’exposition en santé publique.