Marcadores moleculares na identificação de híbridos e introgressão genética em populações de Pseudoplatystoma corruscans e Pseudoplatystoma reticulatim

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização filogenética de percevejos terrestres das famílias Coreidae e Pentatomidae (Heteroptera: Pentatomomorpha) por meio de marcadores moleculares

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Filogeografia do tubarão martelo Sphyrna zygaena (Chondrichthyes, Sphyrnidae) do Atlântico utilizando marcadores moleculares

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Filogeografia do tubarão martelo Sphyrna zygaena (Chondrichthyes, Sphyrnidae) do Atlântico utilizando marcadores moleculares

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

La homogeneidad varietal en viveros de olivo estudiada con marcadores moleculares

La difusión de variedades tradicionales de olivo (Olea europea L.) y la obtención de nuevas variantes fenotípicas han generado confusión en la correcta identificación y denominación de algunas de las aprox. 2 000 variedades conocidas a nivel mundial. En la Argentina, en los últimos años se ha triplicado la superficie implantada con olivo principalmente a partir de plantas de viveros locales e importadas. Con el fin de evaluar la homogeneidad genotípica del material comercializado en Mendoza, se probaron 7 marcadores RAPD altamente reproducibles en muestras de 5 viveros, correspondientes a 5 variedades de olivo. Los marcadores RAPD fueron previamente desarrollados para caracterizar las variedades del INTA Junín. Arbequina y Arauco fueron los materiales más homogéneos. En ambas variedades, todos los individuos compartieron el 100 % de los marcadores utilizados. Los lotes de muestras de Empeltre, Farga y Aloreña no fueron genotípicamente homogéneos, observándose 2-3 patrones diferentes por lote. Todas las variedades ensayadas -en alguna de sus muestras- tuvieron diferencias con su respectiva variedad del INTA Junín. Arbequina y Arauco también compartieron el 100 % de marcadores entre sí, no pudiéndose separar ambos grupos.

Revelando el origen de la variedad de vid ‘Bonarda’ cultivada en Argentina a través del empleo de marcadores moleculares microsatélites

‘Bonarda’ es una variedad de vid que en Argentina se cultiva principalmente en las provincias de Mendoza y San Juan, representa el segundo cepaje tinto en superficie nacional cultivada y es considerada con gran potencial para la elaboración de vinos tintos de alta calidad. Existe incertidumbre respecto a su origen en el país. La descripción ampelográfica de la ‘Bonarda’ cultivada en Argentina remarca gran nivel de similitud con la variedad italiana ‘Bonarda Piemontesa’ y con la variedad francesa ‘Corbeau’. En un trabajo previo, basado en el uso de marcadores moleculares, se demostró que ‘Bonarda’ se diferencia de ‘Bonarda Piamontesa’ y es idéntica a ‘Corbeau’. El objetivo de este trabajo fue confirmar la identidad de esta variedad empleando un gran número de loci microsatélites de tal manera de cubrir -en lo posible- la mayor parte del genoma. Se analizaron 17 accesiones de ‘Bonardas’ procedentes de distintos puntos geográficos de las provincias de Mendoza y San Juan, y de la variedad francesa ‘Corbeau’. Para las reacciones de PCR se usaron 13 loci microsatélites. Todas las accesiones de ‘Bonarda’ fueron idénticas entre sí e idénticas a la variedad francesa Corbeau, por lo que se concluye que se trata de la misma variedad. Se propone que la variedad ‘Bonarda’ cultivada en Mendoza y San Juan sea denominada ‘Bonarda-Argentina’, para diferenciarla de las italianas, pero a sabiendas, con un alto nivel de confianza, que corresponde a la variedad noble francesa ‘Corbeau’.

Uso de marcadores moleculares para la racionalización y evaluación de la calidad en las colecciones de Recursos Fitogenéticos de trigo

Esta tesis tiene dos objetivos generales: el primero, analizar el uso de proteínas del endospermo y SSRs para la racionalización de las colecciones de trigo, y el segundo, estudiar la influencia de las proteínas del endospermo, del año de cultivo y del abonado nitrogenado en la calidad en un grupo de variedades locales españolas. Dentro del primer objetivo, se estudió la diversidad genética de la colección de Triticum monococcum L. (escaña menor), y de una muestra de la colección de Triticum turgidum L. (trigo duro) del CRF-INIA, con 2 y 6 loci de gliadinas, y 6 y 24 SSRs, para la escaña menor y el trigo duro, respectivamente. Ambas colecciones presentaron una gran diversidad genética, con una gran diferenciación entre las variedades y pequeña dentro de ellas. Los loci de gliadinas mostraron una gran variabilidad, siendo los loci Gli-2 los más útiles para distinguir variedades. En la escaña menor, las gliadinas presentaron mayor poder de discriminación que los SSRs; aunque en trigo duro los SSRs identificaron más genotipos. El número de alelos encontrado fue alto; 24 y 38 en gliadinas, y 29 y 203 en SSRs, en escaña menor y trigo duro, respectivamente. En trigo duro, se identificaron 17 alelos nuevos de gliadinas lo que demuestra que el germoplasma español es muy singular. En ambas especies, se detectaron asociaciones entre la variación alélica en prolaminas y el origen geográfico y filogenético de las variedades. La utilidad de las proteínas (6 loci de gliadinas, 2 loci de gluteninas y proteína total) y de los SSRs (24 loci) para verificar duplicados, y analizar la variabilidad intraaccesión, se estudió en 23 casos de duplicados potenciales de trigo duro. Los resultados indicaron que tanto los biotipos como las accesiones duplicadas mostraban el mismo genotipo en gliadinas, pocas diferencias o ninguna en las subunidades de gluteninas HMW y proteína total, y diferencias en menos de tres loci de SSRs. El mismo resultado se obtuvo para los biotipos de la colección de T. monococcum. Sin embargo, las discrepancias observadas en algunos casos entre proteínas y SSRs demostraron la utilidad del uso conjunto de ambos tipos de marcadores. Tanto las proteínas como los SSRs mostraron gran concordancia con los caracteres agro-morfológicos, especialmente cuando las diferencias entre los genotipos eran grandes. Sin embargo, los caracteres agro-morfológicos fueron menos discriminantes que los marcadores moleculares. Para el segundo objetivo de la tesis, se analizó la variación alélica en siete loci de prolaminas relacionados con la calidad en trigo duro: Glu-A1 y Glu-B1 de gluteninas HMW, Glu-A3, Glu-B3 y Glu-B2 de gluteninas B-LMW, y Gli-A1 y Gli-B1 de gliadinas. La submuestra analizada incluía variedades locales de todas las provincias españolas donde se ha cultivado tradicionalmente el trigo duro. Todos los loci, excepto el Glu-B2, mostraron gran variabilidad genética, siendo los Glu-3 los más polimórficos. En total, se identificaron 65 alelos, de los que 29 eran nuevos, que representan una fuente importante de variabilidad genética para la mejora de la calidad. Se detectaron diferencias en la composición en prolaminas entre la convar. turgidum y la zona norte, y la convar. durum y la zona sur; el genotipo Glu-B3new-1 - Gli-B1new-1 fue muy común en la convar. turgidum, mientras que el Glu-B3a - Gli-B1c, asociado con mejor calidad, fue más frecuente en la convar. durum. En la convar. turgidum, se observó mayor variabilidad que en la convar. durum, principalmente en los loci Glu-B1 y Glu-B3, lo que indica que esta convariedad puede ser una fuente valiosa de nuevos alelos de gluteninas. Esta submuestra fue evaluada para calidad (contenido en proteína, P, y test de sedimentación, SDSS) con dos dosis de abonado nitrogenado (N), y en dos años diferentes. No se detectaron interacciones Variedad × Año, ni Variedad × N en la calidad. Para la P, los efectos ambientales (año y N) fueron mayores que el efecto de la variedad, siendo, en general, mayor la P con dosis altas de N. La variedad influyó más en el test SDSS, que no se vio afectado por el año ni el N. El aumento del contenido en proteína no influyó significativamente sobre la fuerza del gluten estimada con el SDSS. Respecto a la influencia de las prolaminas en la fuerza del gluten, se confirmó la superioridad del Glu-B3a; aunque también se detectó una influencia alta y positiva de los alelos nuevos Glu-A3new-1, y Glu-B3new-6 y new-9. La no correlación entre el rendimiento (evaluado en un trabajo anterior) y la P, en las variedades adaptadas a bajo N, permitió seleccionar cuatro variedades locales con alto rendimiento y buena fuerza del gluten para producción con bajo N. SUMMARY There are two main objectives in this thesis: The first, to analyse the use of endosperm proteins and SSRs to rationalize the wheat collections, and the second, to study the influence on quality of endosperm proteins, year and nitrogen fertilization in a group of Spanish landraces. For the first objective, we studied the genetic diversity of the collection of Triticum monococcum L. (cultivated einkorn), and of a sample of the collection of Triticum turgidum L. (durum wheat) maintained at the CRF-INIA. Two and 6 gliadin loci, and 6 and 24 SSRs, were used for einkorn and durum wheat, respectively. Both collections possessed a high genetic diversity, being the differentiation large between varieties and small within them. Gliadin loci showed great variability, being the loci Gli-2 the most useful for distinguish among varieties. In einkorn, the gliadins showed higher discrimination power than SSRs; although SSRs identified more genotypes in durum wheat. Large number of alleles were found; 24 and 38 in gliadins, and 29 and 203 in SSRs, for einkorn and durum wheat, respectively. In durum wheat, 17 new alleles of gliadins were identified, which indicate that Spanish durum wheat germplasm is rather unique. Some associations between prolamin alleles and geographical and phylogenetic origin of varieties were found in both species. The value of endosperm proteins (6 gliadin loci, 2 glutenin loci and total protein) and SSRs (24 loci) for validation of duplicates, and monitoring the intra-accession variability, was studied in 23 potential duplicates of durum wheat. The results indicated that biotypes and duplicated accessions showed identical gliadin genotype, few or none differences in HMW glutenin subunits and total protein, and less than three different SSR loci. A similar result was obtained for biotypes of T. monococcum. However, the discrepancies in some cases support the convenience to use together both marker systems. A good concordance among endosperm proteins, agro-morphological traits and SSRs were also found, mainly when differences between genotypes were high. However, agro-morphological traits discriminated less between accessions than molecular markers. For the second objective of the thesis, we analysed the allelic variation at seven prolamin loci, involved in durum wheat quality: Glu-A1 and Glu-B1 of HMW glutenin, Glu-A3, Glu-B3 and Glu-B2 of B-LMW glutenin, and Gli-A1 and Gli-B1 of gliadin. The subsample analysed included landraces from all the Spanish provinces where the crop was traditionally cultivated. All the loci, except for Glu-B2, showed high genetic variability, being Glu-3 the most polymorphic. A total of 65 alleles were studied, 29 of them being new, which represent an important source of variability for quality improvement. Differences in prolamin composition were detected between convar. turgidum and the North zone, and the convar. durum and the South zone; the genotype Glu-B3new-1 - Gli-B1new-1 was very common in the convar. turgidum, while the Glu- B3a - Gli-B1c, associated with better quality, was more frequent in the convar. durum. Higher variability was detected in the convar. turgidum than in the convar. durum, mainly at the Glu-B1 and Glu-B3, showing that this convariety could be a valuable source of new glutenin alleles. The subsample was evaluated for quality (protein content, P, and sedimentation test, SDSS) with two doses of nitrogen fertiliser (N), and in two different years. No significant Variety x Year or Variety x Nitrogen interactions were detected. For P, environmental (year and N) effects were higher than variety effect, being P values , in general, larger with high dose of N. The variety exhibited a strong influence on SDSS test, which was not affected by year and N. Increasing values of P did not significantly influence on gluten strength, estimated with the SDSS. Respect to the prolamin effects on gluten strength, the superiority of Glu-B3a was confirmed; although a high positive effect of the new alleles Glu-A3new-1, and Glu-B3new-6 and new-9 was also detected. The no correlation between yield (evaluated in a previous research) and P, in the landraces adapted to low N, allowed to select four landraces with high yield and high gluten strength for low N production.

Padronização e validação de marcadores moleculares para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar

O diagnóstico da leishmaniose tegumentar (LT) baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos podendo ser confirmado por exames laboratoriais de rotina como a pesquisa direta do parasito por microscopia e a intradermorreação de Montenegro. Atualmente, os métodos moleculares, principalmente a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido considerados para aplicação em amostras clínicas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Este trabalho teve como objetivo a padronização e validação das técnicas de PCR-RFLP com diferentes iniciadores (kDNA, its1, hsp70 e prp1), visando o diagnóstico e a identificação das espécies de Leishmania presentes em amostras de DNA provenientes de lesões de pele ou mucosa de 140 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar. Para tal, realizamos ensaios de: 1) sensibilidade das PCRs com os diferentes iniciadores, 2) especificidade dos ensaios utilizando DNAs de diferentes espécies de referência de Leishmania, de tripanossomatídeos inferiores e de fungos, 3) validação das técnicas de PCR-RFLP com os iniciadores estudados em amostras de DNA de lesões de pele ou mucosas de pacientes com LT. Os resultados dos ensaios de limiar de detecção das PCR (sensibilidade) mostraram que os quatro iniciadores do estudo foram capazes de detectar o DNA do parasito, porém em quantidades distintas: até 500 fg com os iniciadores para kDNA e its1, até 400 fg com hsp70 e até 5 ng com prp1. Quanto à especificidade dos iniciadores, não houve amplificação dos DNAs fúngicos. Por outro lado, nos ensaios com os iniciadores para kDNA e hsp70, verificamos amplificação do fragmento esperado em amostras de DNA de tripanossomatídeos. Nos ensaios com its1 e prp1, o padrão de amplificação com os DNAs de tripanossomatídeos foi diferente do apresentado pelas espécies de Leishmania. Verificou-se nos ensaios de validação que o PCR-kDNA detectou o parasito em todas as 140 amostras de DNA de pacientes e, assim, foi utilizado como critério de inclusão das amostras. A PCR-its1 apresentou menor sensibilidade, mesmo após a reamplificação com o mesmo iniciador (85,7% ou 120/140 amostras). Para os ensaios da PCR-hsp70, as amostras de DNA foram amplificadas com Repli G, para obter uma sensibilidade de 68,4% (89/140 amostras). A PCR-prp1 não detectou o parasito em amostras de DNA dos pacientes. Quanto aos ensaios para a identificação da espécie presente na lesão, a PCR-kDNA-RFLP-HaeIII e a PCR-its1- RFLP-HaeIII permitem a distinção de L. (L.) amazonensis das outras espécies pertencentes ao subgênero Viannia. A PCR-hsp70-RFLP-HaeIII-BstUI, apesar de potencialmente ser capaz de identificar as seis espécies de Leishmania analisadas, quando utilizada na avaliação das amostras humanas permitiu apenas a identificação de L. (V.) braziliensis. No entanto, é uma técnica com várias etapas e de difícil execução, o que pode inviabilizar o seu uso rotineiro em centros de referência em diagnósticos. Assim, recomendamos o uso dessa metodologia apenas em locais onde várias espécies de Leishmania sejam endêmicas. Finalmente, os resultados indicam que o kDNA-PCR devido à alta sensibilidade apresentada e facilidade de execução pode ser empregada como exame de rotina nos centros de referência, permitindo a confirmação ou exclusão da LT.

Herança genética e marcadores moleculares associados à resistência de Euphorbia heterophylla L. aos herbicidas inibidores da ALS e PROTOX

This study aimed to assess the genetic inheritance, determine the better DNA isolation protocol for this species and to identify molecular markers associated with the Wild Poinsettia (Euphorbia heterophylla L.) resistance ALS- and PROTOX- inhibiting herbicides and. The genetic inheritance of resistance was determined from crosses between E. heterophylla biotypes susceptible (S) and resistant (R), backcrosses and F2 generation. The complete dominance of resistance was confirmed with dose response curves. Ten adjusted methods for DNA isolation described in the literature were tested. The specific primers for ALS and PROTOX genes were designed from the consensus DNA sequence of these genes, obtained by aligning the gene sequences of the species Manihot esculenta and Ricinus communis L. Additionally, it was assessed the transferability of twenty SSR (simple sequence repeat) markers designed for Manihot esculenta, because among the species of Euphorbiaceae with more developed SSRs markers, because it is the closest relative phylogenetic species of E. heterophylla. Regarding genetic inheritance, the frequencies observed in the F1, F2, RCs and RCr did not differ significantly from the expected frequencies for a trait controlled by two dominant genes for multiple resistance and a single dominant gene for simple resistance to ALS- and PROTOX-inhibiting herbicides. The similar levels of resistance to dosage up to 2000 g i.a. ha-1 of fomesafen and dosage up to 800 g i.a. ha-1 of imazethapyr observed in F1 (heterozygous) and homozygous R biotype confirm the complete dominance of resistance to PROTOX- and ALS-inhibiting herbicides, respectively. The 0.2%BME protocol allowed the isolation of 7,083 ng μL-1 DNA, significantly (P=0.05) higher than other methods. Co-isolation of phenolic compounds was observed in FENOL and 3%BME+TB methods, but the addition of polyvinylpyrrolidone (PVP40) in the protocol extraction buffer 3%BME+TA solved this problem. The primers designed for ALS and PROTOX genes amplified but not showed no visible polymorphism in agarose gel between the S and R biotypes of E. heterophylla. Regarding the SSR transferability, ten markers were transferred to E. heterophylla, however, these six primers showed polymorphism among S and R biotypes.

Empleo de marcadores moleculares para el análisis de la prevalencia y diseminación de cepas de beauveria bassiana

El hongo entomopatógeno Beauveria bassiana se emplea en todo el mundo gracias a su comprobada virulencia y su amplio rango de hospederos. El objetivo de este estudio fue comparar diferentes técnicas clásicas y de biología molecular, con el fin de comparar las diferencias de metabolismo y su adaptación en cepas y aislados de suelos agrícolas de B. bassiana, y por otra parte analizar una cepa confirmada como su uso como bioinsecticida (BB38) y la comparación con 42 aislamientos. Con el fin de detectar su prevalencia y diseminación en suelo de campos agrícolas de Guanajuato previamente tratados con bioinsecticidas para control de plagas se desarrolló esta estrategia para asociar dichos marcadores con las cepas de liberación. El ADN extraído de cada aislamiento se amplificó mediante la técnica RAPD-PCR. Al realizar el análisis de las secuencias purificadas de regiones de los transcritos de espaciadores internos (ITS), en conjunto con el ADN amplificado, no se observaron diferencias que pudieran determinar un patrón distintivo. Los resultados de diferenciación usando oligonucleótidos partidores de las series OPA-A, OPA-B y OPA-AB, seleccionados para B. bassiana, mostraron que las cepas nativas BBPTG1, BBPTG2, BBPTG4 y BBPTG6 tuvieron polimorfismos distintivos entre ellas, pero al compararlas contra los 42 aislamientos de suelo, tanto el aislamiento de estudio BB38 como la cepa de referencia GHA (Mycotech) mostraron el mismo patrón que el observado por el aislamiento BBPTG2. Al estudiar la producción de proteasas y de las toxinas beauvericina y basianólido por RT-PCR con oligonucleótidos seleccionados, las 4 cepas nativas amplificaron los transcritos, aunque con la cepa BBPTG6 se observó en general una reducción en la expresión. Por otra parte, se analizaron los intrones presentes en la subunidad grande del ADN ribosomal (LSU) de los 42 aislamientos de campo frente a los del aislamiento BB38, cuyo patrón permitiera distinguir entre los aislamientos y así determinar prevalencia y diseminación en suelos agrícolas. Mientras que en otro análisis en base a las secuencias de las ITSs se realizó la construcción de un árbol filogenético y se determinó el porcentaje de identidad para evaluar la diferencia genética entre cepas, lo que ayudó a validar los resultados obtenidos previamente y así poder seleccionar marcadores que apoyen a la identidad de la cepas y aislados.

Marcadores moleculares específicos de candida parapsilosis

A través de estudios genómicos comparamos locus que por sintenia parecen ser regiones prometedoras para el desarrollo de marcadores moleculares específicos de Candida parapsilosis, una levadura oportunista cuya incidencia va aumentando y que ha registrado altas tasas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. C. parapsilosis junto a C. orthopsilosis y C. metapsilosis comprenden un grupo de estrecha filogenia pero diferente virulencia denominado complejo parapsilosis. A pesar de su importancia como patógenos emergentes las técnicas de identificación microbiológicas y moleculares se han visto limitadas no sólo entre el complejo, sino además entre otras especies de importancia médica como lo son C. guillermondi, C. lusitaniae y C. glabrata. Gracias a la disponibilidad de secuencias genómicas y mediante programas bioinformáticos de alta capacidad como Geneious, Symap y prfectBLAST, comparamos los genomas completos de C. albicans, C. parapsilosis y C. orthopsilosis; ubicando bloques colineales sinténicos y analizando una de las familias génicas de proteasas, encontramos eventos de expansión de genes en C. parapsilosis y C. orthopsilosis Para cada una de estas duplicaciones se diseñaron sondas específicas, obteniendo así 9 diferentes marcadores moleculares; dos de estos han sido utilizados para la identificación de dos de las tres especies que conforman el complejo parapsilosis: C. parapsilosis y C. orthopsilosis. Los oligonucleótidos fueron denominados 420 y 830 con amplicones de 1000 y 900pb respectivamente. Además de ser validados en cepas ATCC, ha sido probados en 35 aislados clínicos que fueron identificados de la siguiente manera; 19 cepas como C. parapsilosis, 1 cepa como C. orthopsilosis, mientras que las 15 cepas restantes mostraron alta similitud con C. glabrata, C. guillermondi y C. lusitaniae al ser identificadas mediante secuenciación del fragmento ITS1 e ITS2 de la secuencia de DNA ribosomal 18S.

Discriminação de raças primitivas de pupunha (Bactris gasipaes) na Amazônia brasileira por meio de marcadores moleculares (RAPDs).

O objetivo deste trabalho é avaliar a hipótese de três raças de pupunha (Pará, Solimões e Putumayo) com base na caracterização molecular por RAPDs.

Marcador microssatélite associado ao alelo Ty-1 de resistência a Begomovirus em tomateiro

O objetivo deste trabalho foi associar um marcador microssatélite ao alelo Ty-1 de resistência a Begomovirus em tomateiro, e avaliar a eficiência desta associação na seleção de linhagens resistentes ao vírus. Os marcadores SSR-47 e SSR-48 foram testados em linhagens isogênicas contrastantes quanto à presença do alelo Ty-1 (LA-3473, LA-3474, LA-3475). O marcador SSR-47, por ter detectado polimorfismo nas linhagens, foi o único utilizado nas etapas subsequentes da pesquisa. Detectada a associação entre o SSR-47 e o alelo Ty-1, testou-se sua eficiência na seleção de genótipos avançados de tomateiro. Para confirmar a eficiência da seleção, foi realizada a avaliação fenotípica das plantas com padrões contrastantes de bandas para SSR-47, quanto à resistência a Begomovirus. Plantas que apresentaram banda única de 191 pb foram resistentes ao Begomovirus, pelo teste de inoculação por enxertia; aquelas com banda única de 180 pb foram suscetíveis; e as plantas com bandas de 191 e 180 pb foram resistentes. A distância máxima entre o Ty-1 e o marcador SSR-47 foi de 2,7 cM. Este marcador foi efetivo em caracterizar genótipos portadores do alelo Ty-1. As respostas das plantas à infecção pelo Begomovirus, induzida via enxertia, são consistentes com as reações previstas com o uso do marcador molecular SSR-47.