Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement des synapses GABAergiques périsomatiques et dans la plasticité corticale : rôle de l’activité neuronale et de proBDNF/p75NTR

Dans le cortex visuel des mammifères, une cellule à panier (BC) qui représente un sous-type majoritaire d’interneurones GABAergiques, innerve une centaine de neurones par une multitude de synapses localisées sur le soma et sur les dendrites proximales de chacune de ses cibles. De plus, ces cellules sont importantes pour la génération des rythmes gammas, qui régulent de nombreuses fonctions cognitives, et pour la régulation de la plasticité corticale. Bien que la fonction des BC au sein des réseaux corticaux est à l'étude, les mécanismes qui contrôlent le développement de leur arborisation complexe ainsi que de leurs nombreux contacts synaptiques n’ont pas été entièrement déterminés. En utilisant les récepteurs allatostatines couplés aux protéines G de la drosophile (AlstR), nous démontrons in vitro que la réduction de l'excitation ainsi que la réduction de la libération des neurotransmetteurs par les BCs corticales individuelles des souris, diminuent le nombre de cellules innervées sans modifier le patron d'innervation périsomatique, durant et après la phase de prolifération des synapses périsomatiques. Inversement, lors de la suppression complète de la libération des neurotransmetteurs par les BCs individuelles avec l’utilisation de la chaîne légère de la toxine tétanus, nous observons des effets contraires selon le stade de développement. Les BCs exprimant TeNT-Lc pendant la phase de prolifération sont caractérisées par des arborisations axonales plus denses et un nombre accru de petits boutons homogènes autour des somas innervés. Toutefois, les cellules transfectées avec TeNT-Lc après la phase de la prolifération forment une innervation périsomatique avec moins de branchements terminaux d’axones et un nombre réduit de boutons avec une taille irrégulière autour des somas innervés. Nos résultats révèlent le rôle spécifique des niveaux de l’activité neuronale et de la neurotransmission dans l'établissement du territoire synaptique des cellules GABAergiques corticaux. Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) est un modulateur puissant de la maturation activité-dépendante des synapses GABAergiques. Grâce à l'activation et à la signalisation de son récepteur tyrosine kinase B (TrkB), la liaison de mBDNF module fortement la prolifération des synapses périsomatiques GABAergiques formés par les BCs. Par contre, le rôle du récepteur neurotrophique de faible affinité, p75NTR, dans le développement du territoire synaptique des cellules reste encore inconnu. Dans ce projet, nous démontrons que la suppression de p75NTR au niveau des BCs individuelles in vitro provenant de souris p75NTRlox induit la formation d'une innervation périsomatique exubérante. BDNF est synthétisé sous une forme précurseur, proBDNF, qui est par la suite clivée par des enzymes, y compris la plasmine activée par tPA, pour produire une forme mature de BDNF (m)BDNF. mBDNF et proBDNF se lient avec une forte affinité à TrkB et p75NTR, respectivement. Nos résultats démontrent qu’un traitement des cultures organotypiques avec la forme résistante au clivage de proBDNF (mut-proBDNF) réduit fortement le territoire synaptique des BCs. Les cultures traitées avec le peptide PPACK, qui inactive tPA, ou avec tPA altèrent et favorisent respectivement la maturation de l’innervation synaptique des BCs. Nous démontrons aussi que l’innervation exubérante formée par les BCs p75NTR-/- n’est pas affectée par un traitement avec mut-proBDNF. L’ensemble de ces résultats suggère que l'activation de p75NTR via proBDNF régule négativement le territoire synaptique des BCs corticaux. Nous avons ensuite examiné si mut-proBDNF affecte l’innervation périsomatique formée par les BCs in vivo, chez la souris adulte. Nous avons constaté que les boutons GABAergiques périsomatiques sont significativement diminués dans le cortex infusé avec mut-proBDNF par rapport à l’hémisphère non-infusé ou traité avec de la saline. En outre, la plasticité de la dominance oculaire (OD) est rétablie par ce traitement chez la souris adulte. Enfin, en utilisant des souris qui ne possèdent pas le récepteur p75NTR dans leurs BCs spécifiquement, nous avons démontré que l'activation de p75NTR via proBDNF est nécessaire pour induire la plasticité de la OD chez les souris adultes. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle critique de l'activation de p75NTR dans la régulation et le maintien de la connectivité des circuits GABAergiques, qui commencent lors du développement postnatal précoce jusqu’à l'âge adulte. De plus, nous suggérons que l'activation contrôlée de p75NTR pourrait être un outil utile pour restaurer la plasticité dans le cortex adulte.

Aktivitätserhöhung der Alpha-Sekretasen ADAM10 und TACE bei der Proteolyse des Amyloid-Vorläuferproteins

ZUSAMMENFASSUNGIn den Gehirnen von Alzheimer-Patienten werden beta-Amyloid-Plaques gefunden, deren Hauptbestandteile die neurotoxischen beta-Amyloid-Peptide (A-beta) sind. Im Verlauf des nicht-amyloidogenen Wegs wird das Amyloid-Vorläuferproteins (APP) innerhalb der A-beta-Sequenz durch die alpha-Sekretase prozessiert, wobei das neuroprotektive APPs-alpha freigesetzt und die Entstehung der A-beta-Peptide verhindert wird. Die Aktivitätserhöhung der alpha-Sekretase ADAM10 könnte eine übermäßige Produktion der A-beta-Peptide abwenden.Zum Auffinden ADAM10-stimulierender Substanzen konnte ein Testsystem entwickelt werden, das auf der Fusion der 119 C-terminalen Aminosäurereste des Amyloid-Vorläuferproteins mit einem Reporterprotein beruht. Durch seine alkalische Phosphataseaktivität kann dieses Reporterprotein stellvertretend für das freigesetzte endogene APPs-alpha photometrisch im Zellkulturüberstand quantifiziert werden. Substanzen, die aktivierend auf die alpha-Sekretase ADAM10 wirken, können somit schnell und mit einer hohen Empfindlichkeit ermittelt werden.Die alpha-Sekretasen ADAM10 und TACE werden als inaktive Zymogene synthetisiert und besitzen eine Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz zwischen der Prodomäne und der Metalloproteinase-Domäne. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass Proprotein-Konvertasen an der Prozessierung beider Zymogene beteiligt sind. ADAM10 und TACE wurden durch die Überexpression der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin in HEK293-Zellen in größerem Umfang prozessiert. Dies resultierte in einer erhöhten katalytischen Aktivität. Mutiertes ADAM10 ohne Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle konnte nicht mehr in die katalytisch aktive Form überführt werden. Diese Ergebnisse eröffnen neue Ansätze zur Stimulierung des nicht-amyloidogenen Wegs.

Die Prozessierung des humanen Amyloid-Vorläuferproteins im Verlauf der replikativen Seneszenz

Die Alterung stellt den größten Risikofaktor für die Entwicklung der Alzheimer Krankheit dar, wobei die biochemische Basis dieser Korrelation bisher nicht bekannt ist. Ein möglicherweise zentraler Mechanismus der Alzheimer Pathologie wird durch die Prozessierung von APP repräsentiert, die in der Synthese von Aβ resultiert. Der Einfluss zellulärer Alterung auf die Biochemie der APP-Prozessierung ist bislang weitestgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Prozessierung von endogenem APP im Verlauf der Zellalterung humaner Fibroblasten progressiv verringert wird. Die Bildung der intrazellulären APP-Spaltfragmente (C99, C83 und AICD) nahm mit zunehmender Lebensspanne ab und war gleichfalls mit einer reduzierten Synthese von extrazellulären APP-Fragmenten (sAPP, sAPPα) verbunden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die Reifung von APP in seneszenten Zellen selektiv reduziert war, und dass dies durch altersabhängig erhöhte zelluläre Cholesterolspiegel vermittelt wurde. Von den APP-prozessierenden Sekretasen waren die Proteinspiegel von Presenilin-1 und Nicastrin, beides Komponenten der γ-Sekretase, im Verlauf der Zellalterung graduell verringert. Dies hatte einen progressiven Rückgang der enzymatischen Aktivität der γ-Sekretase zur Folge, wodurch die Prozessierung von APP unmittelbar reduziert wurde. Die Proteinspiegel von ADAM10, einer α-Sekretase, sowie der β-Sekretase, BACE, wiesen keine Altersregulation auf, aber interessanterweise wurde eine erhöhte enzymatische Aktivität der β-Sekretase in seneszenten Zellen nachgewiesen. Die γ-Sekretase sowie BACE sind in Lipid Rafts lokalisiert, geordneten Membransubdomänen, die hohe Cholesterol- und Caveolin-1-Spiegel aufweisen. Obwohl das Gesamtniveau dieser strukturellen Komponenten von Lipid Rafts in seneszenten Zellen erhöht war, war die Assoziation beider Moleküle mit Lipid Rafts reduziert und sie akkumulierten in speziellen Organellen, die höchstwahrscheinlich Lipidkörper darstellen. Somit wurde gezeigt, dass Lipid Rafts im Zuge der Zellalterung disintegrieren beziehungsweise in ihrem Gesamtspiegel reduziert waren. Diese altersabhängige Membranmodifikation war mit einer veränderten Verteilung von Presenilin-1 und BACE zwischen der Lipid Raft und der Nicht Raft Fraktion der Membran verbunden, die möglicherweise das Potential dieser Enzyme zur Prozessierung von APP reduzierte. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden transgene C. elegans konstruiert, die humanes APP exprimieren, das C-terminal an GFP gekoppelt war. Diese Würmer wiesen eine reduzierte Fertilität, Eilegedefekte und eine verzögerte post-embryonale Entwicklung auf, die möglicherweise auf eine Transgen-vermittelte Neurodegeneration zurückgeführt werden können. Durch erste Untersuchungen der Prozessierung des Transgens konnten Spaltfragmente nachgewiesen werden, die potentiell auf eine spezifische Spaltung von APP durch die endogenen Sekretasen schließen lassen. Somit werden die Prozessierung sowie die Reifung von APP durch die altersabhängige Modifikationen zellulärer Biochemie nachhaltig beeinflusst. Zukünftige Studien sollen zeigen, ob sich diese zellulären Zusammenhänge in den Gesamtorganismus C. elegans übertragen lassen. Des Weiteren sollen die altersabhängigen zellulären Veränderungen, insbesondere des Cholesterol-Metabolismus und der Sekretaseaktivitäten, weitergehend analysiert werden, um zusätzliche Erkenntnisse über altersassoziierte Regulationen möglicher therapeutischer Ziele der Alzheimer Erkrankung zu gewinnen.

Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das große L-Hüllprotein (L) des Hepatitis B - Virus. L bildet eine ungewöhnliche duale Topologie in der ER-Membran aus, welche auch im reifen Viruspartikel erhalten bleibt. In einem partiellen, posttranslationalen Reifungsprozess wird die sogenannte PräS-Region von der zytosolischen Seite der Membran aus in das ER-Lumen transloziert. Aufgrund seiner dualen Topologie und der damit verbundenen Multifunktionalität übernimmt L eine Schlüsselfunktion im viralen Lebenszyklus. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb darin, neue zelluläre Interaktionspartner des L-Hüllproteins zu identifizieren. Ihre Analyse sollte helfen, das Zusammenspiel des Virus mit der Wirtszelle besser zu verstehen. Hierfür wurde das Split - Ubiquitin Hefe - Zwei - Hybrid System eingesetzt, das die Interaktionsanalyse von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen ermöglicht. Zwei der neu identifizierten Interaktionspartner, der v-SNARE Bet1 und Sec24A, die Cargo-bindende Untereinheit des CoPII-vermittelten vesikulären Transports, wurden weitergehend im humanen Zellkultursystem untersucht. Sowohl für Bet1 als auch für Sec24A konnte die Interaktion mit dem L-Hüllprotein bestätigt und der Bindungsbereich eingegrenzt werden. Die Depletion des endogenen Bet1 reduzierte die Freisetzung L-haltiger, nicht aber S-haltiger subviraler Partikel (SVP) deutlich. Im Gegensatz zu Bet1 interagierte Sec24A auch mit dem mittleren M- und kleinen S-Hüllprotein von HBV. Die Inhibition des CoPII-vermittelten vesikulären Transportweges durch kombinierte Depletion der vier Sec24 Isoformen blockierte die Freisetzung sowohl L- als auch S-haltiger SVP. Dies bedeutet, dass die HBV - Hüllproteine das ER CoPII-vermittelt verlassen, wobei sie aktiv Kontakt zur Cargo-bindenden Untereinheit Sec24A aufnehmen. Der effiziente Export der Hüllproteine aus dem ER ist für die Virusmorphogenese und somit für den HBV - Lebenszyklus essentiell. rnEin weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit basierte auf der Interaktion des L-Hüllproteins mit dem ER-luminalen Chaperon BiP. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob BiP, ähnlich wie das zytosolische Chaperon Hsc70, an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt ist. Hierfür wurde BiP durch die ektopische Expression seiner Ko-Chaperone BAP und ERdj4 in seiner Substrat-bindenen Kapazität manipuliert. ERdj4, ein Mitglied der Hsp40 - Proteinfamilie, stimuliert die ATPase-Aktivität von BiP, was die Substratbindung stabilisiert. Der Nukleotid - Austauschfaktor BAP hingegen vermittelt die Auflösung des BiP - Substrat - Komplexes. Die Auswirkung der veränderten in vivo-Aktivität von BiP auf die posttranslationale PräS-Translokation wurde mit Proteaseschutz - Versuchen untersucht. Die ektopische Expression des positiven als auch des negativen Regulators von BiP resultierte in einer drastischen Reduktion der posttranslationalen PräS-Translokation. Ein vergleichbarer Effekt wurde nach Manipulation des BiP ATPase - Zyklus durch Depletion der zellulären ATP - Konzentration beobachtet. Dies spricht dafür, dass das ER-luminale Chaperon BiP, zusammen mit Hsc70, eine zentrale Rolle in der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins spielt. rnZwei weitere Proteine, Sec62 und Sec63, die sich für die posttranslationale Translokation in der Hefe als essentiell erwiesen haben, wurden in die Analyse der dualen Topologie des L-Hüllproteins einbezogen. Interessanterweise konnte eine rein luminale Ausrichtung der PräS-Region nach kombinierter Depletion des endogenen Sec62 und Sec63 beobachtet werden. Dies deutet an, dass sowohl Sec62 als auch Sec63 an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt sind. In Analogie zur Posttranslokation der Hefe könnte Sec62 als Translokon-assoziierter Rezeptor für Substrate der Posttranslokation, und damit der PräS-Region, dienen. Sec63 könnte mit seiner J-Domäne BiP zum Translokon rekrutieren und daraufhin dessen Substrat-bindende Aktivität stimulieren. BiP würde dann, einer molekularen Ratsche gleich, die PräS-Region durch wiederholtes Binden und Freisetzen aktiv in das ER-Lumen hereinziehen, bis eine stabile duale Topologie des L-Hüllproteins ausgebildet ist. Die Bedeutung von Sec62 und Sec63 für den HBV - Lebenszyklus wird dadurch untermauert, dass sowohl die ektopische Expression als auch die Depletion des endogenen Sec63 die Freisetzung L-haltiger SVP deutlich reduziert. rn

Identifizierung einer Mutation im Exon 2 des C1q-B-Ketten-Gens als Ursache eines hereditären C1q-Defekts mit Ausbildung einer SLE-ähnlichen Symptomatik

Komplementdefizienzen gehen mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit gegenüber bestimmten Krankheitserregern in den ersten Lebensjahren (MBL-Defizienz) und darüber hinaus (C1q- und anderen Komplementdefizienten) einher. Dies unterstreicht die Rolle des Komplementsystems als effektiver Abwehrmechanismus in der Übergangsphase zwischen Verlust des „mütterlichen Nestschutzes“ und Ausreifung der eigenen „erworbenen“ Immunität. Das Auftreten von Autoimmunerkrankungen wie dem SLE-ähnlichen Syndrom bei Defizienzen des Klassischen Weges beleuchten zusätzliche Funktionen des Komplementsystems während der Ausreifung der erworbenen Immunität und als wesentlicher Effektor in der Erkennung apoptotischer Zellen und deren Eliminierung aus dem System.rnHereditäre C1q-Defizienzen gehen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit mit einem SLE-ähnlichen Syndrom einher. Sie stellen unter den Defizienzen des Komplementsystems eines Seltenheit dar, ihr klinisches „Gesicht“ ist umso eindrucksvoller. Sie sind von der funktionellen C1q-Defizienz im Rahmen eines erhöhten „turnover“ und in der Folge einer C1q-Autoantokörperbildung abzugrenzen. Ursächlich ist ihnen eine Mutation in einem der drei C1q-Gene, die auf dem Chromosom 1 lokalisiert sind. Homozygote Mutationsträger können den Defekt nicht ausgleichen und zeigen eine C1q-Defizienz mit Verlust der gesamthämolytischen Aktivität CH50. Häufungen treten bei Nachkommen von Geschwister- und Verwandtschaftsehen auf.rnrnIn dieser Arbeit wird der Fall einer Patientin mit einem schweren, frühkindlich einsetzenden, SLE-ähnlichen Syndrom aufgearbeitet. Als Ursache für eine Erkrankung konnte ein hereditärer C1q-Defekt, ohne immunologischem Nachweis eines C1q oer LMQ-C1q, identifiziert werden. Da sich keine der vorab beschriebenen Mutatonsmuster bei der Patientin detektieren ließ, erfolgte die Sequenzierung aller drei C1q-Gene. Dadurch ließ sich ein neues Mutationsmuster darstellen.rnrnDie in dieser Arbeit vorgestellte Mutation unterscheidet sich von den bislang beschriebenen Mutationen dadurch, dass es sich nicht um eine Punktmutation, sonder um eine Deletion von 29 Basen (c283_311) im Exon 2 des C1q-B-Ketten-Gens mit einhergehendem Rasterschub und vorzeitigem Stop-Codon (pMet95TrpfsX8) handelt. Durch die Analyse der Eltern und Geschwister der betroffenen Patientin konnte der Vererbungsweg dargestellt werden. Zudem gelang es die Mutation im Rahmen einer Pränataldiagnostik bei einem „ungeborenen“ Geschwisterkind auszuschließen.rn

Nachweis und Charakterisierung der Ketocarotinoidakkumulation in Zygosporen des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Ketocarotinoide sind in den Dauerstadien vieler Grünalgen anzutreffen und aufgrund ihres hohen antioxidativen Potentials vermutlich von großer Bedeutung für deren Überleben unter ungünstigen Umweltbedingungen. Daneben ist die Aufnahme von Ketocarotinoiden im Zuge der Nahrungskette für verschiedene Tiere lebensnotwendig. Trotz zahlreicher Untersuchungen des Biosynthesewegs der Ketocarotinoide, vorwiegend in der Grünalge Haematococcus pluvialis, sind viele grundlegende Aspekte der Synthese nicht verstanden. Dazu zählt neben dem genauen Reaktionsmechanismus des ketolierenden Enzyms ß-Carotin-Ketolase (BKT) vor allem der noch nicht aufgeklärte Zusammenhang zwischen Lipidsynthese und Ketocarotinoidakkumulation. Nach der Entdeckung eines zur BKT aus H. pluvialis homologen Gens in einer EST-Datenbank des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii wurden im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit die als orange-rot beschrieben Zygosporen von C. reinhardtii als mögliches ketocarotinoidhaltiges Zellstadium untersucht. Dabei wurden für C. reinhardtii erstmals Ketocarotinoide in Konzentrationen bis zu einem Femtomol pro Zelle nachgewiesen und mittels HPLC-Analytik, chemischer Derivatisierung und Massenspektrometrie zweifelsfrei identifiziert. Es wurden, in aufsteigender Quantität, drei Ketocarotinoide detektiert: Canthaxanthin, Astaxanthin und 4-Ketolutein. Letzteres wurde bisher selten in anderen ketocarotinoidakkumulierenden Organismen beschrieben und stellt, im Gegensatz zu den vom ß-Carotin abgeleiteten Pigmenten Astaxanthin und Canthaxanthin, ein Pigment des α-Carotin-Zweiges dar. Astaxanthin und 4-Ketolutein wurden vor allem in Form von Pigment-Fettsäureestern nachgewiesen. Mit Hilfe von Paarungsansätzen mit der lor1-Mutante, die keine α-Carotinoide synthetisieren kann, und Vergleichen mit Ketocarotinoiden aus H. pluvialis konnte gezeigt werden, dass 4 Ketolutein nur als Monoacylester in der Alge vorliegt, während Astaxanthin sowohl als Monoacyl- wie auch als Diacylester anzutreffen ist. Ketocarotinoide wurden innerhalb der ersten 14 Tage der Zygotenreife gebildet. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der Zygoten dokumentierten, dass damit ein starker Umbau der Zelle einherging, der sich vor allem in der Reduktion des Chloroplasten und der Bildung von Lipidtröpfchen darstellte. Letztere nahmen bei reifen Zygosporen den größten Teil des Zelllumens ein und wurden mittels dünnschichtchromatografischer Analysen als Neutralfette identifiziert. Der sinkende Zellgehalt an Carotinoiden im Zuge der Zygosporenreifung und Inhibitorexperimente an reifenden Zygoten mittels Norflurazon zeigten, dass für die Ketocarotinoidakkumulation keine Neusynthese von Carotinoiden nötig ist und lassen die Hypothese zu, dass C. reinhardtii die im Zuge der Chloroplastenreduktion freigesetzten Photosynthese-Carotinoide als Substrate für die Ketocarotinoidsynthese verwendet. Physiologische Bedeutung könnte den Ketocarotinoiden vor allem beim Schutz der Speicherlipide vor Peroxidation durch reaktive Sauerstoffspezies zukommen. Diese Reservestoffe stellen die Energieversorgung während des Auskeimens der Zellen sicher. Durch den im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit dokumentierten Nachweis der Ketocarotinoidakkumulation in C. reinhardtii können die Ketocarotinoidsynthese und vor allem der Zusammenhang von Lipid- und Ketocarotinoidakkumulation zukünftig mit Hilfe der für diesen Modellorganismus vorliegenden umfangreichen molekulargenetischen Methoden detailliert untersucht werden.

PAS c als signaltransduzierende Domäne des Sensorproteins DcuS von Escherichia coli

Bakterien besitzen membranintegrierte Sensoren für die Reaktion auf verändernde Umweltbedingungen.rnViele der Sensoren sind Zweikomponenten-Systeme bestehend aus einer Sensorhistidinkinase und einem Responseregulator der die zellulare Antwort auslöst. DcuS, der C4-Dicarboxylat-Sensor von DcuS ist eine membranintegrierte Histidin-Kinase. DcuS ist ein Multidomänen-Protein mit einer sensorischen periplasmatischen PASP (Per-Arnt-Sim) Domäne, zwei Transmembranhelices, eine cytoplasmatische PASC-Domäne und eine C-terminale Kinase-Domäne. PAS-Domänen sind ubiquitäre Signalmodule die in allen Reichen des Lebens zu finden sind. PAS-Domänen detektieren eine Vielfalt von Reizen wie Licht, Sauerstoff, Redoxpotential und verschiedene kleine Moleküle so wie die Modulation von Protein-Protein Interaktionen. PAS-Domänen sind strukturell homolog und besitzen eine charakteristische α/β-Faltung. Eine große Anzahl der sensorischen PAS-Domänen wurden identifiziert, aber viele der PAS-Domänen besitzen keinen apparenten Cofaktor und die Funktion ist unbekannt.rnEine Kombination aus gerichteter und ungerichteter Mutagenese, Protein-Protein-Interaktionsstudien und Festkörper-NMR (ssNMR) Experimente mit strukturellem Modelling wurde zur Untersuchung der Struktur und Funktion der cytoplasmatischen PAS-Domäne des membranintegrierten Sensors DcuS verwendet. Die Experimente zeigen, dass PASC eine wichtige Rolle in die Signaltransduktion von PASP zur C-terminalen Histidin-Kinase von DcuS spielt.rn

Modifizierungen des Enzyms Silicatein alpha zur direkten Immobilisierung auf verschiedenen Oberflächen : neuartige Herstellung von Kompositmaterialien unter physiologischen Bedingungen

Das Silicatein α ist ein 24 kDa großes Enzym, welches im Schwamm Suberites domuncula für die Synthese von Biosilikat verantwortlich ist. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass Silicatein auch die Synthese anderer Metalloxide wie Titandioxid, Galliumoxid und Zirkoniumdioxid katalysieren kann. Diese Fähigkeiten machen das Silicatein α für biomedizinische und biotechnologische Anwendungen interessant, da die Synthese unter nahezu physiologischen Bedingungen ablaufen kann, was die Herstellung neuartiger Kompositmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften erleichtern würde. Zur Immobilisierung des Silicatein α auf verschiedenen Oberflächen wurde bislang ein Nickel-NTA-Kopolymer eingesetzt. Diese Art der Immobilisierung bietet eine Reihe von Möglichkeiten in der Nanobiotechnologie, stößt aber in der Biomedizin an ihre Grenzen, da sich nicht alle Oberflächen für ein solches Coating eignen. Zudem können die zur Aktivierung des Polymers nötigen Lösungsmittel und die über die Zeit freigesetzten Monomere aus dem Polymergerüst toxische oder mutagene Wirkung auf das umliegende Gewebe haben. Deshalb wurde das Silicatein α in dieser Arbeit mit zwei Affinitäts-Tags so modifiziert, dass es an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei seine Aktivität beibehält. Zuerst wurde das Silicatein mit einem Glu-tag am N-terminalen Ende modifiziert. Dadurch gelang die direkte Immobilisierung an Hydroxyapatit und die folgende, enzymkatalysierte Synthese von Biosilikat-Beschichtungen auf diesem Träger. Die Eigenschaften eines solchen HA-Kompositmaterials können zum Beispiel zu einem verbesserten, schnelleren und stabileren Einwachsen von Knochenimplantaten führen, da Biosilikat die Reifung und Differenzierung von Osteoblasten beschleunigt. rnMit dem an Hydroxyapatit-Plättchen immobilisierten Glu-tag-Silicatein wurde ein modifizierter Pull-down Assay etabliert, wodurch bekannte, aber auch bis dahin noch unbekannte Protein-Interaktionspartner identifiziert werden konnten. rnUm zu zeigen, dass der entwickelte Glu-tag an präformierte, calciumhaltige Oberflächen binden kann, wurden die Nadeln des Kalkschwammes Paraleucilla magna als Modellorganismus verwendet. Die Nadeln konnten durch das immobilisierte Silicatein mit einer Titandioxid-Schicht überzogen werden und unter Verwendung des Interaktionspartners Silintaphin-1 konnte diese Beschichtung noch verstärkt werden. Solche CaCO3-Kompositmaterialien könnten sowohl in der Biomedizin als auch in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Neben den erwähnten calciumhaltigen Materialien finden auch andere Stoffe wie TiO2-Nanodrähte Verwendung in der Forschung. In weiterführenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass der entwickelte Glu-tag auch Affinität zu Titandioxid-Oberflächen vermittelt. Auch hier konnte durch das oberflächenimmobilisierte Enzym eine Biosilikatbeschichtung synthetisiert werden. rnMit der zweiten Modifikation - einem Cys-tag - konnte Silicatein direkt auf Goldoberflächen immobilisiert werden. Durch die Verwendung eines Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempels wurde das Cys-getaggte Silicatein in einem linienförmigen Muster auf das Gold übertragen und die Synthese von Titandioxid dort nachgewiesen.rnDie Experimente und Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass Silicatein α durch einfache Modifikationen an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei immer noch seine Aktivität behält. rnHierdurch ergibt sich die Möglichkeit, unter Normalbedingungen verschiedenste Kompositmaterialien herzustellen.rn

Einfluss subviraler Partikel des humanen Cytomegalovirus auf die Induktion der antiviralen Immunantwort

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der insbesondere bei Patienten mit unreifem oder geschwächtem Immunsystem schwere, teilweise lebensbedrohliche Erkrankungen verursacht. Aufgrund der klinischen Relevanz wird die Entwicklung einer Impfung gegen HCMV mit großem Nachdruck verfolgt. Subvirale Partikel des HCMV, sogenannte Dense Bodies (DB), stellen eine vielversprechende Impfstoff-Grundlage dar. Die innere Struktur der Partikel besteht aus viralen Proteinen, die als dominante Antigene der zellulären Immunantwort gegen HCMV identifiziert wurden. Die äußere Hülle der Partikel entspricht der Virushülle, sie enthält die viralen Oberflächenproteine als Zielantigene der neutralisierenden Antikörper (NTAk)-Antwort in ihrer natürlichen Konformation. Die für ein Totantigen außergewöhnlich hohe Immunogenität der Partikel wurde bereits in Vorarbeiten dokumentiert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den molekularen Hintergrund für die herausragenden, immunogenen Eigenschaften von DB aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher die Hypothese geprüft, dass DB geeignet sind, die Ausreifung und Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) zu vermitteln und damit deren Fähigkeit zur Antigenpräsentation zu stimulieren. Derart aktivierten DC kommt eine wichtige Rolle beim Priming der T-lymphozytären Immunantwort zu. In der Tat konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von unreifen dendritischen Zellen (iDC) mit DB zu verstärkter Expression von solchen Molekülen auf der DC-Oberfläche führt, die mit Ausreifung der Zellen verknüpft sind. Der Nachweis der verstärkten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine belegte die Aktivierung der Zellen im Sinne einer entzündlichen Reaktion. Die erfolgreiche Stimulation von CD4 und CD8 T-Lymphozyten durch DB-behandelte DC belegte schließlich die funktionelle Relevanz der Ergebnisse. Zusammengefasst konnten in diesem Abschnitt der Arbeit die molekularen Grundlagen der adjuvanten Wirkung von DB aufgeklärt werden. rnIn einem zweiten Abschnitt wurde die NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung näher untersucht. Der humoralen Immunantwort kommt eine entscheidende Bedeutung bei der Prävention der HCMV-Übertragung zu. Hier galt es zu prüfen, welchen Einfluss stammspezifische Unterschiede in der Expression viraler Oberflächenproteine auf die Induktion der NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung nehmen. Im Fokus stand dabei die variable Expression des pentameren Proteinkomplexes aus den viralen Proteinen gH/gL/pUL128-UL131A. Dieser Komplex wird nur von kliniknahen HCMV-Stämmen (HCMVKlin) exprimiert und ist für deren breiten Zelltropismus verantwortlich. Der pentamere Komplex fehlte in allen bisherigen Analysen der DB-Immunogenität, die auf der Grundlage von Laborstämmen des HCMV (HCMVLab) durchgeführt worden waren. Ein erster Versuchsansatz zeigte, dass die NTAk-Antwort, die durch DB von HCMVLab (DBLab) induziert wird, auch gegen die Infektion mit HCMVKlin einen gewissen Schutz vermittelt. Dies war ein überraschender Befund, da Antikörpern gegen den pentameren Komplex eine entscheidende Rolle bei der Neutralisation von HCMVKlin zugeschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass Antikörper gegen andere Zielstrukturen zur Neutralisation von HCMVKlin beitragen. Hieraus resultierte unmittelbar die Frage, inwieweit eine Aufnahme des pentameren Komplexes in einen DB-basierten Impfstoff überhaupt notwendig war. Um dies zu beantworten war es notwendig, DB herzustellen, die den pentameren Komplex enthielten. Hierzu wurde ein HCMVLab durch Mutagenese des 235 kpb Genoms so modifiziert, dass von dem resultierenden Stamm der pentamere Komplex exprimiert wurde. In gereinigten DB dieses Stammes konnten die Komponenten des pentameren Komplexes nachgewiesen werden. Die Seren von Tieren, die mit DB dieses neuen Stammes immunisiert wurden, zeigten in der Tat eine deutlich gesteigerte Kapazität zur Neutralisation von HCMVKlin auf verschiedenen Zielzellen. Diese Ergebnisse unterstreichen schlussendlich, dass die Expression des pentameren Komplexes einen Vorteil bei der Induktion der antiviralen NTAk-Antwort erbringt. Zusammengefasst liefern die Erkenntnisse aus dieser Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der immunogenen Wirkung von DB. Auf dieser Grundlage war es nunmehr möglich, ein Projekt zur Austestung der DB-Vakzine in einer ersten klinischen Studie zu initiieren.

Der Einfluss von Chemotherapeutika mit Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF)-modulierendem Potential sowie eines Verlustes des HIF-Regulators von Hippel-Lindau (VHL) auf den Phänotyp und die Funktion dendritischer Zellen

Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF) gibt dem Organismus die Möglichkeit, sich auf zellulärer Ebene an unterschiedliche Sauerstoffverhältnisse anzupassen. Vor allem Tumorzellen weisen aufgrund ihres ungeregelten Wachstums und der daraus resultierenden unzureichenden Durchblutung (hypoxisches Milieu) eine erhöhte HIF-Expression auf. Die erhöhte HIF-Expression stellt somit ein interessantes Ziel in der Tumortherapie dar. Dendritische Zellen (DCs) besitzen eine bedeutende Rolle in der Generierung und Modulierung von Antitumor-Immunantworten. Aus diesem Grund ist es überaus wichtig zu wissen, welche Effekte Antitumor-Agenzien, im Besonderen HIF-Inhibitoren, auf DCs und somit auch auf die Generierung von adäquaten Immunantworten besitzen.rnIm ersten Teil dieser Arbeit wurde aus diesem Grund der Einfluss der Antitumor-Agenzien Geldanamycin (GA) und Topotecan (TPT) auf den Phänotyp und die Funktion von DCs untersucht. Hierfür wurden Monozyten aus humanen, mononukleären, peripheren Blutzellen isoliert und unter DC-differenzierenden Konditionen kultiviert. Diese immaturen monozytenabgeleiteten DCs (Mo-DCs) wurden mithilfe eines Reifungscocktails ausgereift. Die Applikation der Antitumor-Agenzien erfolgte während der Differenzierungs- bzw. Ausreifungsphase. Abhängig vom Reifungsgrad der Mo-DCs konnte ein differentieller Einfluss von GA bzw. TPT auf die DC-Aktivierung beobachtet werden. Eine Behandlung von unstimulierten Mo-DCs mit GA resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung basierend auf einem noch unbekannten Mechanismus. Ebenso führte eine Behandlung von unstimulierten Mo-DCs mit TPT zu einer funktionellen Aktivierung der DCs, die mit einer vermehrten AKT-Expression korrelierte. Die jeweilige Koapplikation der Antitumor-Agenzien mit dem DC-Reifungscocktail führte zu einer reduzierten DC-Aktivierung, die sich in einer verminderten NF-κB-Aktivierung, einer verringerten Oberflächenexpression der getesteten kostimulatorischen Moleküle, einer verringerten Migrationsfähigkeit und einem reduzierten Zellstimulierungspotential widerspiegelte.rnDie autosomal dominant vererbte Tumorerkrankung von Hippel-Lindau (VHL) wird häufig durch genetische Mutationen des als HIF-Negativregulator fungierenden VHL-Gens hervorgerufen. Patienten, die an dem VHL-Syndrom erkrankt sind, weisen oft benigne oder maligne Tumore und Zysten in den verschiedensten Organsystemen auf. Wie schon zuvor erwähnt, besitzen DCs eine essentielle Rolle in der Initiierung und Aufrechterhaltung von Antitumor-Immunantworten. Deshalb wurde im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ein partieller Verlust von VHL Auswirkungen auf die Ausprägung desrnPhänotyps und der Funktion von DCs hat. Mittels Cre/lox-Technologie wurden transgene Mäuse mit einem heterozygoten Verlust von Exon 1 bzw. Exon 2 des VHL-Gens generiert. Aus diesen Mäusen wurden Knochenmarkszellen isoliert und unter DC-differenzierenden Konditionen kultiviert. Die immaturen knochenmarkabgeleiteten DCs (BM-DCs) wurden mit LPS ausgereift. Weder der heterozygote Verlust von Exon 1 noch von Exon 2 des VHL-Gens bewirkte eine Veränderung der Oberflächenmarkerexpression, der in vitro-Migrations- undrnEndozytosekapazität, sowie der allogenen T-Zellstimulierungskapazität. Allerdings zeigten Mäuse mit einem partiellen Verlust von Exon 2 im Vergleich zu Kontrollmäusen nach Immunisierung und Provokation mit dem Modellallergen OVA eine verminderte Atemwegshyperreaktion, die möglicherweise auf die beobachtete Abnahme der Migrationsfähigkeit in vivo und die verminderte OVA-spezifische T-Zellstimulierungskapazität der DCs zurückzuführen ist.

Réaction d’amination intramoléculaire de liens C-H à partir de N-mésyloxycarbamates catalysée par des complexes de rhodium et d’autres métaux de transition : s ynthèse verte d’oxazolidinones

La réaction d’amination de liens C-H, impliquant la transformation directe d’un lien C-H en lien C-N constitue une approche synthétique d’avenir pour la préparation de composés azotés. L’application de cette stratégie de manière intramoléculaire apparaît comme une approche puissante pour la synthèse de composés hétérocycliques. En particulier, les oxazolidinones, carbamates cycliques à cinq chaînons, constituant une nouvelle classe d’antibiotiques très prometteuse, pourraient être synthétisées par cette méthode. Il y a moins d’une dizaine d’années, notre groupe de recherche a travaillé sur le développement de méthodologies utilisant des espèces nitrènes métalliques pour l’amination intra et intermoléculaire. Les N-tosyloxycarbamates, en présence d’une base et d’un catalyseur dimère de rhodium (II) tétracarboxylate sont les précurseurs de ces espèces nitrènes métalliques, capables de faire l’insertion de liens C(sp3)-H. Dans ces travaux de thèse, nous avons travaillé sur le développement d’une méthode plus « verte » d’amination intramoléculaire. Les N-mésyloxycarbamates, plus légers que leurs homologues N-tosyloxycarbamates, ont été identifiés comme d’excellents précurseurs de nitrènes. La méthodologie développée ne nécessite que 3 mol % de dimère de rhodium Rh2(tpa)4 et de 1,5 équivalents de solution aqueuse saturée de K2CO3, le tout dans l’acétate d’éthyle et donne de bons rendements de cyclisation. Une étude de l’étendue réactionnelle a été effectuée, montrant la tolérance et les limitations de notre système catalytique : les hétéroatomes ne posent pas de problèmes hormis l’atome d’azote, qui doit être protégé afin de garantir la transformation. En outre, nous avons constaté que les liens C-H aliphatiques secondaires sont moins réactifs que les liens tertiaires. Après avoir tenté de développer des conditions réactionnelles spécifiques aux liens C-H non activés, nous avons montré la possibilité d’aminer des liens C-H propargyliques de manière chimiosélective ; la triple liaison C-C peut ensuite être dérivatisée efficacement, donnant accès à la formule saturée correspondante ainsi qu’à d’autres motifs. Dans un désir de substituer les complexes de rhodium par d’autres complexes de métaux plus abondants et moins dispendieux, nous nous sommes tournés, dans un premier temps, vers les complexes de fer et par la suite, vers les pinceurs de nickel. Les phtalocyanines de fer ont été identifiées comme étant de bons catalyseurs de l’amination intramoléculaire de N-mésyloxycarbamates. Le chlorure de phtalocyanine de fer (III), en présence d’un sel de AgBF4 et de K2CO3, dans le 1,1,2,2-tétrachloroéthane anhydre, permet l’obtention de la 4-phenyloxazolidin-2-one avec 63% de rendement. En outre, il est possible d’atteindre un rendement de 49% à partir du même substrat N-mésyloxycarbamate, par catalyse avec un pinceur de nickel de type POCN, en présence d’un sel de mésylate. Des indices sur le mécanisme des ces deux transformations ont pu être recueillis lors de la courte étude de ces systèmes.

Réaction d’amination intramoléculaire de liens C-H à partir de N-mésyloxycarbamates catalysée par des complexes de rhodium et d’autres métaux de transition : s ynthèse verte d’oxazolidinones

La réaction d’amination de liens C-H, impliquant la transformation directe d’un lien C-H en lien C-N constitue une approche synthétique d’avenir pour la préparation de composés azotés. L’application de cette stratégie de manière intramoléculaire apparaît comme une approche puissante pour la synthèse de composés hétérocycliques. En particulier, les oxazolidinones, carbamates cycliques à cinq chaînons, constituant une nouvelle classe d’antibiotiques très prometteuse, pourraient être synthétisées par cette méthode. Il y a moins d’une dizaine d’années, notre groupe de recherche a travaillé sur le développement de méthodologies utilisant des espèces nitrènes métalliques pour l’amination intra et intermoléculaire. Les N-tosyloxycarbamates, en présence d’une base et d’un catalyseur dimère de rhodium (II) tétracarboxylate sont les précurseurs de ces espèces nitrènes métalliques, capables de faire l’insertion de liens C(sp3)-H. Dans ces travaux de thèse, nous avons travaillé sur le développement d’une méthode plus « verte » d’amination intramoléculaire. Les N-mésyloxycarbamates, plus légers que leurs homologues N-tosyloxycarbamates, ont été identifiés comme d’excellents précurseurs de nitrènes. La méthodologie développée ne nécessite que 3 mol % de dimère de rhodium Rh2(tpa)4 et de 1,5 équivalents de solution aqueuse saturée de K2CO3, le tout dans l’acétate d’éthyle et donne de bons rendements de cyclisation. Une étude de l’étendue réactionnelle a été effectuée, montrant la tolérance et les limitations de notre système catalytique : les hétéroatomes ne posent pas de problèmes hormis l’atome d’azote, qui doit être protégé afin de garantir la transformation. En outre, nous avons constaté que les liens C-H aliphatiques secondaires sont moins réactifs que les liens tertiaires. Après avoir tenté de développer des conditions réactionnelles spécifiques aux liens C-H non activés, nous avons montré la possibilité d’aminer des liens C-H propargyliques de manière chimiosélective ; la triple liaison C-C peut ensuite être dérivatisée efficacement, donnant accès à la formule saturée correspondante ainsi qu’à d’autres motifs. Dans un désir de substituer les complexes de rhodium par d’autres complexes de métaux plus abondants et moins dispendieux, nous nous sommes tournés, dans un premier temps, vers les complexes de fer et par la suite, vers les pinceurs de nickel. Les phtalocyanines de fer ont été identifiées comme étant de bons catalyseurs de l’amination intramoléculaire de N-mésyloxycarbamates. Le chlorure de phtalocyanine de fer (III), en présence d’un sel de AgBF4 et de K2CO3, dans le 1,1,2,2-tétrachloroéthane anhydre, permet l’obtention de la 4-phenyloxazolidin-2-one avec 63% de rendement. En outre, il est possible d’atteindre un rendement de 49% à partir du même substrat N-mésyloxycarbamate, par catalyse avec un pinceur de nickel de type POCN, en présence d’un sel de mésylate. Des indices sur le mécanisme des ces deux transformations ont pu être recueillis lors de la courte étude de ces systèmes.

Évaluation aux potentiels évoqués visuels des voies magnocellulaire et parvocellulaire au cours du développement

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Évaluation aux potentiels évoqués visuels des voies magnocellulaire et parvocellulaire au cours du développement

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de l'expression des microARNs et des enzymes de synthèse des corticostéroïdes dans le développement pulmonaire

Le syndrome de détresse respiratoire du nouveau-né (SDR) est l’une des pathologies les plus fréquentes dont souffrent les bébés prématurés. Le SDR est causé par un déficit dans la synthèse du surfactant pulmonaire en raison de l’immaturité du poumon lors d’une naissance prématurée. Plusieurs éléments régulent le développement pulmonaire notamment les stéroïdes sexuels et les corticostéroïdes. Le sexe est aussi un élément régulateur du développement pulmonaire. En effet, les garçons sont plus atteints que les filles par le SDR. Ce dimorphisme sexuel est attribué aux androgènes. Le traitement anténatal aux glucocorticoïdes est prescrit aux femmes qui sont à risque d’accoucher prématurément. En effet, les corticostéroïdes favorisent la maturation pulmonaire anténatale. Également, il a été démontré que les microARNs sont primordiaux pour le développement pulmonaire. Ceci nous a conduit à étudier l’impact des androgènes sur le profil d’expression des microARNs lors de la transition du stade canaliculaire au stade sacculaire (jour gestationnel (JG)17.0 au JG18.0), période qui coïncide avec la montée de la synthèse et de la sécrétion du surfactant chez la souris. Tout d’abord, nous avons étudié la stabilité des gènes de normalisation (snoRNAs) afin de quantifier les microARNs par qPCR. Cette analyse a été effectuée avec 3 logiciels différents et sur plusieurs stades du développement notamment de la période pseudoglandulaire jusqu’au stade alvéolaire chez les deux sexes. On a identifié les meilleures combinaisons de gènes de normalisation les plus stables pour chaque stade du développement étudié ainsi que pour la période couvrant tous les stades étudiés. Ensuite nous avons analysé à GD17.0 et GD18.0 le profil d’expression des microARNs chez des fœtus mâles dont les mères ont été traitées au flutamide (anti-androgènes pure). Les résultats ont montré que 43 microARNs matures sont modulés par les androgènes à GD17.0 et 35 microARNs à GD18.0. Pour certains microARNs, nous avons identifié des cibles potentielles qui sont inversement modulées par les androgènes par rapport aux microARNs. Ces cibles sont impliquées dans plusieurs processus biologiques tels que le métabolisme des lipides et la prolifération cellulaire ainsi que dans des fonctions moléculaires tels que la liaison des facteurs de transcription. Des expériences de validation ont été effectuées par qPCR. Nos résultats ont montré que les androgènes régulent des processus qui peuvent être impliqués dans la maturation pulmonaire via la régulation des microARNs. En plus de l’intérêt porté aux androgènes dans la maturation pulmonaire, nous avons analysé l’expression d’enzymes de synthèse des corticostéroïdes dans le poumon fœtal humain. L’expression de l’enzyme 21-hydroxylase a été étudiée par qPCR et par immunobuvardage. Également la localisation de l’ARNm de cette enzyme clé de la synthèse des glucocorticoïdes, a été effectuée par hybridation in situ. L’ARNm de CYP21A2 a été détecté par qPCR dans les 34 échantillons analysés et dont les âges variaient entre 17 et 40 semaines de grossesse. Aucune corrélation, avec l’âge gestationnel ou le sexe, n’a été observée. Des niveaux significatifs de la protéine 21-hydroxylase ont été détectés dans nos échantillons. Nous avons investigué l’expression d’autres enzymes impliquées dans la voie de synthèse des glucocorticoïdes notamment CYP11B1, CYP11B2 et CYP17A1. Les ARNm des gènes CYP11B1, CYP11B2 n’ont pas été détectés dans nos échantillons, contrairement à CYP17A1 dont l’ARNm a été détecté dans tous nos tissus fœtaux analysés. La protéine de la 17α-hydroxylase a été détectée à de faibles niveaux. Nos résultats d’hybridation in situ ont montré que l’expression de CYP21A2 est localisée presqu’exclusivement dans l’épithélium pulmonaire distal. Nos résultats suggèrent que les produits de la 21-hydroxylase agiront via une action intracrine sur l’épithélium distal en activant le récepteur des glucocorticoïdes (GR). L’activation du récepteur des minéralocorticoïdes (MR) ne semble pas dépendre de produits de la 21-hydroxylase en raison des quantités importantes d’aldostérone circulante.