Anatomia foliar comparativa em espécies de guanxuma

O estudo da anatomia e morfologia das plantas pode ajudar a conhecer prováveis mecanismos que promovem maior capacidade competitiva pelos recursos naturais, principalmente água, luz e nutrientes, além da maior capacidade na retenção e/ou impedimento no processo de penetração de produtos químicos pelas folhas. Diante disso, o objetivo desta pesquisa foi estudar a anatomia foliar das espécies Sida urens, Sida spinosa e Sida rhombifolia em diferentes etapas de desenvolvimento. Essas espécies foram coletadas em três estádios fenológicos, caracterizados como V1: formação de até 10 folhas completamente expandidas; V2: entre 11 folhas e antes do florescimento; e R: após florescimento. O trabalho foi conduzido em duas etapas, sendo uma relacionada às atividades de cortes anatômicos e a outra às impressões paradérmicas das folhas. A espécie Sida spinosa apresentou maior densidade estomática na fase R. As três espécies apresentaram menor densidade estomática, maior densidade tricomática e parede celular mais espessa no estádio V2. Conclui-se que as três espécies possuem maior conteúdo de cera epicuticular na fase vegetativa, porém S. spinosa apresenta relativa diminuição nessa característica na fase reprodutiva.

Grãos de pólen anômalos no clone CP76 de Anacardium occidentale L. (Anacardiaceae)

Durante a investigação do desenvolvimento das anteras e grãos de pólen no clone CP76 de Anacardium occidentale foram observadas anomalias relacionadas ao desenvolvimento do gametófito masculino. Foram observados andrósporos que interromperam seu desenvolvimento momentos antes da primeira mitose, além de grãos que apresentaram anomalias relacionadas à fase inicial da gametogênese masculina. A primeira mitose anômala produziu grãos de pólen binucleados com células idênticas, ou quase, e ainda grãos onde a parede celular, oriunda da primeira mitose, foi incompletamente formada. Fusão nuclear foi observada nos grãos onde a parede celular foi incompletamente formada. A interrupção no desenvolvimento é muito freqüente, ao contrário das anomalias relacionadas à primeira mitose, de ocorrência muito rara

Histoquímica e ultra-estrutura da ontogênese dos tetrasporângios de Hypnea musciformis (Wulfen) J. V. Lamour. (Gigartinales, Rhodophyta)

O desenvolvimento dos tetrásporos de Hypnea musciformis (Wulfen) J. V. Lamour. foi estudado com o uso dos microscópios de luz e eletrônico. Os tetrasporângios diferenciam-se a partir de células corticais. Essas células sofrem mitose dando origem à célula-mãe do tetrasporângio e à célula suporte. As técnicas histoquímicas indicam que a parede celular do tetrasporângio é composta especialmente de polissacarídeos ácidos, reagindo com azul do toluidina O, azul de alcião e amarelo de alcião. Os tetrasporângios são também corados com ácido periódico de Schiff, para carboidratos neutros, e com azul brilhante de coomassie, para proteínas. A transformação da célula cortical em célula mãe do tetrasporângio envolve uma série de mudanças estruturais, especialmente dos cloroplastos e dictiossomos. A célula-mãe do tetrasporângio alonga-se rapidamente e uma parede celular espessa é produzida antes da meiose. Durante essa fase de crescimento ocorreu aumento significativo no número de cloroplastos, grãos de amido e vesículas osmiofílicas. O tetrasporângio meiótico é caracterizado pelo desenvolvimento extensivo do retículo endoplasmático perinuclear. A citocinese tem início com a formação do sulco de divisão, formado pela invaginação da membrana plasmática. Concomitante à invaginação da membrana ocorre a deposição de mucilagem em torno dos tetrásporos.

Isolamento de oligossacarídeos de xiloglucano de dicotiledôneas através de hidrólise enzimática e cromatografia de exclusão molecular

Oligossacarídeos derivados do xiloglucano, um polissacarídeo constituinte da parede celular vegetal, vêm sendo considerados como moléculas capazes de sinalizar e/ou regular eventos relacionados ao crescimento e à expansão celular. A purificação desses oligossacarídeos é imprescindível para a realização de ensaios relativos à sua atividade biológica. Neste trabalho, xiloglucanos foram extraídos a partir de sementes de copaíba (Copaifera langsdorffii Desf.) e suspensões celulares de feijão (Phaseolus vulgaris L.) e hidrolisados com celulase (endo-glucanase) para obtenção dos oligossacarídeos de xiloglucano, os OXGs. Os resultados obtidos mostram que a técnica de cromatografia dupla em gel de exclusão molecular foi eficiente para purificação dos oligossacarídeos, apresentando OXGs dos tipos XLLG e XXXG com grau de pureza próximo a 90%, e do tipo XXFG próximo de 80%.

Substâncias antifúngicas constitutivas e induzidas em folhas e suspensões celulares de Rudgea jasminoides (Cham.) Müll. Arg. (Rubiaceae)

Rudgea jasminoides (Cham.) Müll. Arg. é uma rubiácea arbórea nativa da floresta tropical que sintetiza metabólitos secundários antifúngicos, quando em contato com fungos. Membros da família Rubiaceae estão entre as poucas plantas facilmente mantidas em cultura de tecidos e que produzem quantidades substanciais de metabólitos secundários que ultrapassam os níveis normalmente encontrados na planta intacta. Neste trabalho foi analisada a presença de compostos antifúngicos constitutivos e induzidos produzidos por folhas e suspensões celulares dessa espécie. Oligogalacturonídeos (OGAs), ácido salicílico(AS), óxido nítrico(NO) e fragmentos de β-glucano de leveduras foram usados como eliciadores. Substâncias constitutivas com atividade antifúngica foram detectadas nas suspensões celulares de R. jasminoides, principalmente na fase estacionária do crescimento das culturas. Essas substâncias foram encontradas em maior diversidade e quantidade quando comparadas às das folhas. O tratamento com fragmentos de β-glucano de leveduras aumentou a produção de substâncias antifúngicas constitutivas e induziu a síntese de compostos antifúngicos ausentes nas culturas não eliciadas (fitoalexinas), principalmente na fase de crescimento exponencial. OGAs derivados da parede celular de folhas dessa espécie também promoveram efeito similar. Nas condições experimentais utilizadas, os sinalizadores endógenos ácido salicílico e óxido nítrico foram tóxicos e ineficazes na ativação da síntese de metabólitos de defesa nas culturas celulares de R. jasminoides. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que suspensões celulares de R. jasminoides sintetizam substâncias com atividade antifúngica, cuja produção pode ser aumentada pelo uso de eliciadores de fungos e plantas.

ISOTERMAS DE ADSORÇÃO DE CÁDMIO POR Saccharomyces cerevisiae

Com o objetivo de determinar as isotermas de adsorção de cádmio por Saccharomyces cerevisiae, foram utilizados os sais cloreto e nitrato de cádmio nas concentrações de 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100mg L-1. A biomassa foi produzida a partir de uma cultura "starter"de Saccharomyces cerevisiae IZ 1904. Após o contato de 16h entre o microrganismo e as soluções em estudo, a biomassa foi separada por centrifugação e o teor de cádmio residual foi determinado no sobrenadante por espectrofotometria de absorção atômica. Para os dois sais empregados foi observado um acúmulo crescente de cádmio nas concentrações de 5, 10, 20 e 40mg L-1. Nas concentrações de 60, 80 e 100mg L-1 foi observado que a levedura acumulou teores menores do metal, evidenciando danos na parede celular, nem sempre acompanhados de iguais danos da membrana citoplasmática, tais alterações da parede visualizadas por microscopia eletrônica de varredura.

Influência do ácido giberélico na degradação do amido durante o amadurecimento da banana

O ácido giberélico (GA3) tem sido estudado com particular interesse na pós-colheita, pois melhora a qualidade e retarda a senescência dos frutos através de um complexo mecanismo de sinalização, interligado à atividade de enzimas responsáveis pelo processo do amadurecimento. Este hormônio vegetal, quando aplicado exogenamente, desempenha um papel importante no atraso da atividade de enzimas de parede celular, na síntese de carotenóides, degradação da clorofila e, em mangas, o GA3 diminuiu a atividade de amilases e peroxidases. A banana, fruto climatérico, tem como principal fonte de energia o amido. Este polissacarídeo é reduzido durante o climatério de teores que variam de 12 a 20%, dependendo da cultivar de banana, a menos de 1%, e o teor de sacarose pode aumentar até 12 vezes quando a fruta está amadurecida. No metabolismo de hidrólise do amido, as amilases parecem desempenhar um papel fundamental no início desta degradação, pois acredita-se que só endoamilases são capazes de atacar grânulos inteiros, fornecendo substrato para atuação de outras enzimas até a formação de açúcares. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da infiltração de giberelina A3 em fatias de banana no amadurecimento e degradação do amido. Observou-se que o fitohormônio não interferiu no climatério respiratório, porém atrasou a degradação do amido e o acúmulo de açúcares solúveis em pelo menos dois dias e o pico de atividade amilásica também foi atrasado.

Avaliação do método de liquefação enzimática na extração de suco de maçã

O conceito da tecnologia limpa visa otimizar o processo de extração para obter o máximo de suco da fruta, diminuir perdas e gerenciar a aplicação do resíduo gerado. A utilização de complexos enzimáticos, constituídos por celulases e pectinases, na extração de suco permite, além de modificar características químicas e físico-químicas dos produtos, minimizar a geração de resíduos. O objetivo deste trabalho foi avaliar as condições de extração de suco de maçã por liquefação enzimática e comparar as características de qualidade dos produtos obtidos a partir desse método com os do tradicional processo de prensagem. Para o processo de liquefação, as melhores condições para obtenção de suco de maçã foram: enzimas 0,1 mL.Kg-1, temperatura 50 °C e tempo 75 min. O rendimento foi de 83,5% com a geração de 16,5% de bagaço, com uma diferença de 19%, quando comparado ao processamento de suco por prensagem. O suco obtido por liquefação foi mais ácido, apresentou maiores teores de cinzas e de nitrogênio do que o suco obtido por prensagem. No bagaço obtido por liquefação, os valores de acidez e cinzas, de extrato etéreo e de nitrogênio foram maiores do que no obtido por prensagem mas não houve diferença significativa nos teores de fibras alimentares embora os teores de pectina tenham sido mais baixos. Não foram detectadas diferenças significativas nas proporções de açúcares neutros relacionados à parede celular. O processamento por liquefação apresentou melhores resultados no rendimento do suco e na diminuição de bagaço, com uma vantagem de 18,5% sobre o processamento tradicional por prensagem.

Determinação de isotermas de adsorção de Saccharomyces cerevisiae empregando acetato e sulfato de cádmio

Para determinar as isotermas de adsorção de cádmio por Saccharomyces cerevisiae, foram utilizados os sais acetato e sulfato de cádmio, nas concentrações de 5; 10; 20; 40; 60; 80 e 100 mg.L-1. A biomassa foi produzida a partir de uma cultura "starter" de Saccharomyces cerevisiae IZ 1904. Após o contato de 16 horas entre o microrganismo em estudo e as soluções teste, a biomassa foi separada por centrifugação e o teor de cádmio residual foi determinado por espectrofotometria de absorção atômica diretamente no sobrenadante. Os dois sais testados demonstraram acúmulo crescente do metal nas concentrações de 5; 10; 20 e 40 mg.L-1. Porém, nas concentrações de 60; 80 e 100 mg.L-1, foi observado um acúmulo decrescente do metal, mostrando assim danos da parede celular, nem sempre evidenciados em nível de membrana citoplasmática, visualizados por microscopia eletrônica de varredura.

Avaliação nutricional da adição de uréia ao feno suplementado com milho moído

Foi realizado um experimento de digestibilidade e consumo para verificar o efeito da suplementação com uréia na dieta composta por feno de Coast Cross (Cynodon dactylon L.) à vontade e 1 % do peso corporal (PC) em milho moído. Foram utilizados 15 bezerros Hereford, inteiros, com 8 a 9 meses de idade e 171,6 kg. Os tratamentos foram: T1 - feno + mistura mineral; T2 - feno + 1 % PC de milho moído + mistura mineral; T3 - T2 + 12,4 g de uréia/100 kg PC; T4 - T2 + 25,4 g de uréia/100 kg PC e T5 - T2 + 38,5 g de uréia/kg PC. O feno tinha 9,55 % de proteína bruta e 81,32 % FDN. Houveram efeitos dos tratamentos sobre a digestibilidade da matéria orgânica da dieta total (DMO) e do feno (DMOf), da FDN da dieta total (DFDN) e do feno (DFDNf), da celulose (DCEL) e da hemicelulose (DHCEL). Os tratamentos com uréia diminuíram os efeitos negativos da suplementação com o milho sobre os coeficientes de digestibilidade estudados. Houveram respostas lineares e significativas da adição de uréia sobre os coeficientes de digestibilidade avaliados quando os tratamentos suplementados com milho foram analisados separadamente A hemicelulose foi a fração da parede celular que mais respondeu a suplementação de uréia. A suplementação aumentou o consumo de matéria orgânica (CMO) total, entretanto houve uma diminuição do CMO de feno em relação ao consumo de T1, independentemente da adição de uréia. A adição de uréia aumentou linearmente o CMO digestível (CMOD) dos tratamentos suplementados com milho. A relação entre o consumo de proteína degradável e o CMOD das dietas aumentou linearmente com a suplementação com uréia, aumentando, provavelmente, o suprimento de amônia para os microorganismos ruminais. Um correto balanceamento dos suplementos, visando atender as exigências dos microorganismos ruminais por proteína degradável, pode evitar os efeitos associativos negativos da suplementação energética. 1 Dissertação de Mest

Testemunha da tuberculose : antígeno liparabinomannan

O estudo pretendeu abordar a imunidade humoral na Tuberculose. Foi um estudo de teste diagnóstico que avaliou um antígeno específico, constituinte da parede celular da micobactéria, denominado LIPOARABINOMANNAN (LAM), proveniente de Cambridge, MA, USA da Companhia Dyna-Gen. O objetivo principal do estudo foi a detecção de anticorpos IgG anti-LAM em casos de tuberculose pulmonar, extrapulmonar e formas combinadas da doença. A casuística total compreendeu 173 pacientes portadores de tuberculose, sendo a mesma confirmada por métodos bacteriológicos e/ou anatomopatológicos de biópsias de diversos órgãos em 114 casos (65,8%). Em 46 casos (26,5%) a doença se confirmou por rigorosos critérios clínicos, radiológicos e de seguimento após tratamento adequado. Cento e quinze pacientes eram do sexo masculino (66,5%) e 58 do sexo feminino (33,5%). Cento e trinta e um eram brancos (75,7%), 24 negros (13,9%) e 18 mistos (10,4%). O total de formas pulmonares foi de 88 casos (51%), sendo 81 (46,8%) formas bacilíferas e 7 casos (4,0%) não-bacilíferas. Dos casos com baciloscopia direta negativa, 3 apresentaram culturas positivas, 2 culturas negativas e em 2 casos a mesma não foi realizada. Formas extrapulmonares compreenderam 71 casos (41%) com predomínio de forma miliar, ganglionar, pleural e do SNC. A combinação de ambas as formas ocorreu em 14 casos (8,1%). Radiologicamente, houve predomínio de lesões escavadas (30,1%), consolidação (13,9%), padrão miliar (11%) e exame radiológico normal (11%), além de outros achados. Da série, 118 pacientes eram HIV negativos (68,2%) e 55 eram HIV positivos (31,8%). As principais comorbidades associadas foram Diabetes Melittus (DM), Alcoolismo, Cardiopatia e Neoplasia, entre outras. Exames culturais foram realizados em 145 pacientes, sendo que em 72 casos a cultura foi positiva (41,6%) e foi negativa em 10 casos (5,8%). Dos 72 exames culturais positivos, o teste do MycoDot foi positivo em 47 casos (65,2%) e negativo em 25 (34,7%). Em 10 exames culturais negativos, o mesmo foi positivo em 6 casos (60%) e negativo em 4 casos (40%). Em 63 exames culturais não realizados, o teste do MycoDot foi positivo em 46 casos e negativos em 17. Os resultados do teste MycoDot na série total foram: positivos em 120 pacientes (69,4%) e negativos em 53 pacientes (30,6%). As formas pulmonares bacilíferas, não bacilíferas, extrapulmonares e combinadas apresentaram sensibilidade de 74,1%, 85,7%, 63,4% e 64,3% respectivamente. O grupo controle foi de 77 indivíduos assim distribuídos: 41 sadios, 16 portadores de lesões residuais de tuberculose, 6 sadios com BCG prévia, 6 sadios sem BCG prévia e 8 com outras comorbidades. O resultado do teste MycoDot foi negativo em 73 casos (94,8%) e positivo em 4 casos (5,2%). A sensibilidade da casuística total foi de 69,4%, a especificidade foi de 94,8%, o valor preditivo positivo (VPP) foi de 96,8% e o valor preditivo negativo (VPN) foi de 57,9%. Dos pacientes HIV positivos a sensibilidade foi de 61,8% e a especificidade foi de 100%. Nos pacientes HIV negativos a sensibilidade foi de 72,9% e a especificidade foi de 94,7%. Concluiu-se que o Teste MycoDot é de fácil realização, baixo custo, podendo ser útil como uma ferramenta adicional para o diagnóstico da tuberculose.

Morfologia e citologia das células compartimentadas em Araucaria angustifolia (BERT.)O.KTZE.(ARAUCARIACEAE)

As células compartimentadas do gênero Araucaria Juss. foram primeiramente descritas como células incomuns, caracterizadas pela ocorrência de partições pécticas no lume celular, formando um sistema de compartimentos. Entretanto, várias questões sobre essas células ainda não haviam sido esclarecidas, por isso, o presente trabalho envolveu a observação e descrição dos estádios de desenvolvimento das células compartimentadas nas plantas jovens e adultas da espécie Araucaria angustifolia, sob microscopia óptica e eletrônica, além de elucidar as funções e a dinâmica celular desempenhada pelas mesmas. A diferenciação das células compartimentadas ocorria ainda no ápice caulinar, iniciando quando a célula aumentava de volume (estádio 1). A mucilagem era continuamente secretada, através do Golgi e retículo endoplasmático rugoso, preenchendo o citoplasma e reduzindo o vacúolo (estádio 2). A quantidade citoplasmática se reduzia, praticamente, em torno do núcleo (estádio 3). Finalmente, a célula era totalmente preenchida de mucilagem, constituída por uma rede lamelar, perdendo sua forma poligonal (estádio 4). Núcleo e citoplasma degeneravam. Com base nesses resultados, constatou-se que as células compartimentadas de Araucaria angustifolia eram semelhantes às células de mucilagem de algumas famílias de dicotiledôneas. A função de controle hídrico foi comprovada, baseado, principalmente, nos resultados obtidos pelo traçador apoplástico HPTS (hidroxi-ácido pirenetrissulfônico), que demonstrou a rota de translocação e regulação hídrica na folha. A morte celular programada também mostrou-se evidente com a degeneração do vacúolo, condensação e descromatização do núcleo e degeneração geral do sistema de membranas A utilização de anticorpos monoclonais para determinados epitopos pécticos, são importantes ferramentas nos estudos da dinâmica da parede celular. Ao longo do desenvolvimento das células compartimentadas (células mucilaginosas), havia um gradiente de distribuição com relação a rápida de-esterificação, ao aumento da concentração de galactanos e ligações de cálcio e diminuição nas concentrações de arabinanos e de proteínas arabinogalactanos (AGPs). Alguns resultados mostraram-se diferentes nas células parenquimáticas, justificando as diferenças na elasticidade da parede celular nas células mucilaginosas de Araucaria angustifolia. Observou-se que proteínas arabinogalactanos e pectinas com alto grau de metil-esterificação estavam presentes na mucilagem. A degeneração das AGPs na maturidade das células mucilaginosas, tanto na parede celular, como na mucilagem, poderia estar envolvida no processo de morte celular programada.

Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Efeito do nível e fonte de fibra sobre a concentração e a utilização da energia metabolizável de dietas para frangos de corte em crescimento

A utilização de ingredientes fibrosos pode resultar efeitos deletérios sobre a energia metabolizável (EM) e líquida (EL) da dieta para frangos que dependem do nível, fonte e estrutura macromolecular da fibra. No presente trabalho foram desenvolvidos dois experimentos com frangos em crescimento, com os objetivos de avaliar os efeitos do nível e fonte de fibra sobre a disponibilidade e partição da EM, testar diversas medidas da fibra em equações de predição da concentração dietética de EM e EL e avaliar e aperfeiçoar metodologias de estudo da partição metabólica da energia. No experimento I, utilizando abate comparativo e regressão múltipla com frangos ISA em gaiolas individuais, foram observados efeitos significativos do nível e fonte de fibra sobre a disponibilidade e eficiência de retenção da EM (K0). As melhores medidas isoladas do efeito da fibra foram a parede celular insolúvel em água e a fibra total da dieta, e as melhores equações de predição obtidas para a EM e a EL contiveram combinações de uma medida da quantidade de fibra, como as fibra bruta, detergente ácido ou uma das citadas anteriormente, com as medidas de viscosidade e/ou de retenção de água. No experimento II, utilizando calorimetria indireta e modelagem com frangos Ross alojados em grupo, foi demonstrado que o efeito do nível de fibra sobre o K0 em dietas com baixa viscosidade pode estar relacionado com o aumento no efeito térmico do alimento (ETA) de curto prazo. A perda de calor total (61% dos 360 kcal EM/kg0,75 consumidos) e partida em metabolismo basal (52%), atividade física (19%) e ETA total (29%) e de longo prazo (16%), não foram alterados pelo nível de fibra. O peso do trato gastrintestinal das aves aumentou com o aumento no nível de fibra nos dois experimentos Foram obtidos coeficientes médios para a EL de mantença de 97,5 e 115,2 kcal/kg0,75/dia, respectivamente para os experimentos I e II, e o K0 variou de 0,638 (alta fibra de trigo e far. soja) a 0,708 (controle milho e far. soja) no experimento I, e foi de 0,706 (dieta normal) e 0,714 (alta fibra) no experimento II.

Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.