Cognate peptide-receptor ligand mapping by directed phage display

Background: A rapid phage display method for the elucidation of cognate peptide specific ligand for receptors is described. The approach may be readily integrated into the interface of genomic and proteomic studies to identify biologically relevant ligands.Methods: A gene fragment library from influenza coat protein haemagglutinin (HA) gene was constructed by treating HA cDNA with DNAse I to create 50 ¿ 100 bp fragments. These fragments were cloned into plasmid pORFES IV and in-frame inserts were selected. These in-frame fragment inserts were subsequently cloned into a filamentous phage display vector JC-M13-88 for surface display as fusions to a synthetic copy of gene VIII. Two well characterized antibodies, mAb 12CA5 and pAb 07431, directed against distinct known regions of HA were used to pan the library. Results: Two linear epitopes, HA peptide 112 ¿ 126 and 162¿173, recognized by mAb 12CA5 and pAb 07431, respectively, were identified as the cognate epitopes.Conclusion: This approach is a useful alternative to conventional methods such as screening of overlapping synthetic peptide libraries or gene fragment expression libraries when searching for precise peptide protein interactions, and may be applied to functional proteomics.

Mice with chronic GSH deficit display phenotypical anomalies that resemble key aspects of schizophrenia

ABSTRACTSchizophrenia is a major psychiatric disorder occurring with a prevalence of 1% in the worldwide population. It develops progressively with psychosis onset in late adolescence or earlyadulthood. The disorder can take many different facets and has a highly diffuse anddistributed neuropathology including deficits in major neurotransmitter systems,myelination, stress regulation, and metabolism. The delayed onset and the heterogeneouspathology suggest that schizophrenia is a developmental disease that arises from interplayof genetic and environmental factors during sensitive periods. Redox dysregulation due to animbalance between pro-oxidants and antioxidant defence mechanisms is among the riskfactors for schizophrenia. Glutathione (GSH) is the major cellular redox regulator andantioxidant. Levels of GSH are decreased in cerebrospinal fluid, prefrontal cortex and postmortemstriatum of schizophrenia patients. Moreover, polymorphisms of the key GSHsynthesizingenzyme, glutamate-cysteine ligase, modifier (GCLM) subunit, are associatedwith the disease, suggesting that GSH deficit is of genetic origin. Here we used miceknockout (KO) for the GCLM gene, which display chronic GSH deficit (~70 to 80% decrease)to investigate the direct link between redox dysregulation and schizophrenia. Accordingly,we evaluated whether GCLM KO compared to normal wildtype mice display behavioralchanges that relate to schizophrenia symptoms and whether their brains showmorphological, functional or metabolic alterations that resemble those in patients.Moreover, we exposed pubertal GCLM mice to repeated mild stress and measured theirhormonal and behavioral stress reactivity. Our data show that chronic GSH deficit isassociated with altered emotion- and stress-related behaviors, deficient prepulse inhibition,pronounced amphetamine-induced hyperlocomotion but normal spatial learning andworking memory. These changes represent important schizophrenia endophenotypes.Moreover, this particular pattern of change indicates impairment of the ventralhippocampus (VH) and related circuitry as opposed to the dorsal hippocampus (DH), which isimplicated in spatial information processing. This is consistent with a selective deficit ofparvalbumin positive interneurons and gamma oscillation in the VH but not DH. Increasedlevels of circulating stress hormones in KO mice following pubertal stress corroborate VHdysfunction as it is involved in negative feedback control of the stress response. VHstructural and functional deficits are frequently found in the schizophrenic brain. Metabolicevaluation of the developing GCLM KO anterior cortex using in vivo magnetic resonancespectroscopy revealed elevated glutamine (Gln), glutamate (Glu), Gln/Glu and N-acetylaspartate(NAA) during the pre-pubertal period. Similar changes are reported in earlyschizophrenia. Overall, we observe phenotypic anomalies in GSH deficient GCLM KO micethat correspond to major schizophrenia endophenotypes. This supports an important rolefor redox dysregulation in schizophrenia and validates the GCLM KO mouse as model for thedisease. Moreover, our results indicate that puberty may be a sensitive period for redoxsensitivechanges highliting the importance of early intervention. Gln, Gln/Glu, Glu and NAAmay qualify as early metabolic biomarkers to identify young at-risk individuals. Since chronictreatment with NAC normalized most metabolic changes in GCLM KO mice, NAC may be oneadjunct treatment of choice for early intervention in patients.RESUMELa schizophrénie est une maladie psychiatrique majeure avec une prévalence de 1% dans lapopulation. Son développement est progressif, les premières psychoses apparaissant àl'adolescence ou au début de l'âge adulte. La maladie a plusieurs présentations et uneneuropathologie étendue, qui inclut des déficits neurochimiques, métaboliques, de lamyélination et de la régulation du stress. L'émergence tardive et l'hétérogénéité de lapathologie suggèrent que la schizophrénie est une maladie développementale, favorisée pardes facteurs génétiques et environnementaux durant des périodes sensibles. La dérégulationrédox, due à un déséquilibre entre facteurs pro-oxidantes et défenses anti-oxidantes,constitue un facteur de risque. Le glutathion (GSH) est le principal régulateur rédox et antioxidantdes cellules, ses taux sont diminués dans le liquide céphalorachidien, le cortexpréfrontal et le striatum de patients. De plus, des variations du gène codant la sous-unitémodulatrice (GCLM) de la glutamate-cystéine ligase, enzyme de synthèse du GSH, sontassociés la maladie, suggérant que le déficit observé chez les patients est d'originegénétique. Nous avons donc utilisé des souris ayant une délétion du gène GCLM (KO), quiont un déficit chronique en GSH (70-80%), afin d'étudier le lien entre une dérégulation rédoxet la schizophrénie. Nous avons évalué si ces souris présentent des altérationscomportementales analogues aux symptômes de la maladie, et des modificationsstructurelles, fonctionnelles et métaboliques au niveau du cerveau, ressemblant à celles despatients. De plus, nous avons soumis les souris à des stresses modérés durant la puberté,puis mesuré les réponses hormonales et comportementales. Les animaux présentent undéficit pré-attentionnel du traitement des informations moto-sensorielles, un déficit pourcertains apprentissages, une réponse accrue à l'amphétamine, mais leurs mémoires spatialeet de travail sont préservées. Ces atteintes comportementales sont analogues à certainsendophénotypes de la schizophrénie. De plus, ces changements comportementaux sontlargement expliqués par une perturbation morphologique et fonctionnelle de l'hippocampeventral (HV). Ainsi, nous avons observé un déficit sélectif des interneurones immunoréactifsà la parvalbumine et une désynchronisation neuronale dans l'HV. L'hippocampe dorsal,impliqué dans l'orientation spatiale, demeure en revanche intact. L'augmentationd'hormones de stress dans le sang des souris KO suite à un stress prépubertal soutien aussil'hypothèse d'une dysfonction de l'HV, connu pour moduler ce type de réponse. Des déficitsstructurels et fonctionnels dans l'hippocampe antérieur (ventral) ont d'ailleurs été rapportéschez des patients schizophrènes. Par de résonance magnétique, nous avons également suivile profil métabolique du le cortex antérieur au cours du développement postnatal des sourisKO. Ces mesures ont révélé des taux élevés de glutamine (Gln), glutamate (Glu), du ratioGln/Glu, et de N-acétyl-aspartate (NAA) durant la période prépubertale. Des altérationssimilaires sont décrites chez les patients durant la phase précoce. Nous avons donc révélédes anomalies phénotypiques chez les souris GCLM KO qui reflètent certainsendophénotypes de la schizophrénie. Nos résultats appuient donc le rôle d'une dérégulationrédox dans l'émergence de la maladie et le potentiel des souris KO comme modèle. De plus,cette étude met en évidence la puberté comme période particulièrement sensible à unedérégulation rédox, renforçant l'importance d'une intervention thérapeutique précoce. Dansce cadre, Gln, Gln/Glu, Glu and NAA seraient des biomarqueurs clés pour identifier de jeunesindividus à risque. De part son efficacité dans notre modèle, NAC pourrait être unesubstance de choix dans le traitement précoce des patients.

Biologia floral e polinização artificial de pinhão-manso no norte de Minas Gerais

O objetivo deste trabalho foi avaliar alguns aspectos da biologia floral e do sistema reprodutivo de Jatropha curcas, em Janaúba, MG. Foram registrados: o número de flores femininas e masculinas; o intervalo de abertura das flores femininas; e a formação de frutos por apomixia, autofecundação, geitonogamia e xenogamia. A proporção de flores masculinas para femininas foi de 20:1. O intervalo de abertura das flores femininas variou de um a sete dias, conforme o número delas na inflorescência. No teste de apomixia, houve formação de frutos em apenas 5% das flores avaliadas. A percentagem de frutificação variou de 79 a 88% na autofecundação manual, na geitonogamia e na xenogamia. Na autofecundação sem a polinização manual a frutificação foi de 20%, e os frutos formados foram significativamente menores, com número inferior de sementes por fruto e menor índice de velocidade de emergência. As sementes foram semelhantes às formadas por polinização natural. é possível a realização de cruzamentos controlados em pinhão-manso, e não há autoincompatibilidade nesta espécie.

Dinâmica floral e abortamento de flores em híbridos de canola e mostarda castanha

O objetivo deste trabalho foi avaliar a dinâmica floral e determinar o índice de abortamento de flores de híbridos de canola (Brassica napus) e de mostarda castanha (Brassica juncea), bem como determinar suas relações com as condições meteorológicas do Sul do Brasil. Durante a floração, dez híbridos de canola e dois de mostarda foram avaliados a cada três dias quanto ao número de flores abertas, de síliquas e de flores abortadas. O número acumulado e relativo de flores foi usado para avaliação da dinâmica floral. A relação desses números com a soma térmica acumulada durante a floração foi determinada por meio de modelo logístico. A partir dos coeficientes desse modelo, identificaram-se grupos de genótipos com diferentes taxas de emissão de flores. O abortamento de flores entre híbridos variou de 10,53 a 45,96% e correlacionou-se com a temperatura e a demanda evaporativa da atmosfera. Genótipos com maiores tempos térmicos entre o período de máxima emissão de flores e o final da floração geralmente apresentam maiores percentagens de abortamento de flores. O ajuste dos dados de emissão de flores aos de soma térmica do período da floração, por meio de modelo logístico, permite simular a dinâmica floral de híbridos de canola e mostarda castanha.

Investigating the relationship between pollination strategies and the size-advantage model in zoophilous plants using the reproductive biology of Arum cylindraceum and other European Arum species as case studies

The size-advantage model (SAM) explains the temporal variation of energetic investment on reproductive structures (i.e. male and female gametes and reproductive organs) in long-lived hermaphroditic plants and animals. It proposes that an increase in the resources available to an organism induces a higher relative investment on the most energetically costly sexual structures. In plants, pollination interactions are known to play an important role in the evolution of floral features. Because the SAM directly concerns flower characters, pollinators are expected to have a strong influence on the application of the model. This hypothesis, however, has never been tested. Here, we investigate whether the identity and diversity of pollinators can be used as a proxy to predict the application of the SAM in exclusive zoophilous plants. We present a new approach to unravel the dynamics of the model and test it on several widespread Arum (Araceae) species. By identifying the species composition, abundance and spatial variation of arthropods trapped in inflorescences, we show that some species (i.e. A. cylindraceum and A. italicum) display a generalist reproductive strategy, relying on the exploitation of a low number of dipterans, in contrast to the pattern seen in the specialist A. maculatum (pollinated specifically by two fly species only). Based on the model presented here, the application of the SAM is predicted for the first two and not expected in the latter species, those predictions being further confirmed by allometric measures. We here demonstrate that while an increase in the female zone occurs in larger inflorescences of generalist species, this does not happen in species demonstrating specific pollinators. This is the first time that this theory is both proposed and empirically tested in zoophilous plants. Its overall biological importance is discussed through its application in other non-Arum systems.

Streptabody, a high avidity molecule made by tetramerization of in vivo biotinylated, phage display-selected scFv fragments on streptavidin.

Phage display is a powerful method of isolating of antibody fragments from highly diverse naive human antibody repertoires. However, the affinity of the selected antibodies is usually low and current methods of affinity maturation are complex and time-consuming. In this paper, we describe an easy way to increase the functional affinity (avidity) of single chain variable fragments (scFvs) by tetramerization on streptavidin, following their site-specific biotinylation by the enzyme BirA. Expression vectors have been constructed that enable addition of the 15 amino acid biotin acceptor domain (BAD) on selected scFvs. Different domains were cloned at the C-terminus of scFv in the following order: a semi-rigid hinge region (of 16 residues), the BAD, and a histidine tail. Two such recombinant scFvs directed against the carcinoembryonic antigen (CEA) were previously selected from human non-immune and murine immune phage display libraries. The scFvs were first synthesized in Escherichia coli carrying the plasmid encoding the BirA enzyme, and then purified from the cytoplasmic extracts by Ni-NTA affinity chromatography. Purified biotinylated scFvs were tetramerized on the streptavidin molecule to create a streptabody (StAb). The avidity of various forms of anti-CEA StAbs, tested on purified CEA by competitive assays and surface plasmon resonance showed an increase of more than one log, as compared with the scFv monomer counterparts. Furthermore, the percentage of direct binding of 125I-labeled StAb or monomeric scFv on CEA-Sepharose beads and on CEA-expressing cells showed a dramatic increase for the tetramerized scFv (>80%), as compared with the monomeric scFv (<20%). Interestingly, the percentage binding of 125I-labeled anti-CEA StAbs to CEA-expressing colon carcinoma cells was definitely higher (>80%) than that obtained with a reference high affinity murine anti-CEA mAb (30%). Another advantage of using scFvs in a StAb format was demonstrated by Western blot analysis, where tetramerized anti-CEA scFv could detect a small quantity of CEA at a concentration 100-fold lower than the monomeric scFv.

Calendário floral de plantas melíferas nativas da Borda Oeste do Pantanal no Estado do Mato Grosso do Sul

Resumo:O objetivo deste trabalho foi avaliar o padrão de floração, ao longo do ano, de plantas melíferas na Borda Oeste do Pantanal, no Maciço do Urucum, MS, bem como o tipo de recurso oferecido pela flora melífera, para elaborar um calendário floral para a região. A floração das plantas melíferas visitadas pelas abelhas nativas e africanizadas foi acompanhada quinzenalmente, por 3 anos consecutivos, tendo-se anotado a data de florescimento, o hábito de crescimento e os recursos coletados pelos insetos. Foram identificadas 160 espécies florescendo e sendo visitadas pelas abelhas, mas somente 73 espécies foram consideradas como plantas melíferas e incluídas no calendário floral, das quais 34 eram ervas, 17 árvores, 15 arbustos e 7 lianas. Foram observadas plantas melíferas em flor ao longo de todo o ano, com maior número no verão e menor no inverno. As ervas florescem mais intensamente no verão e no outono (janeiro-junho), enquanto as árvores e os arbustos, na primavera (final de setembro-dezembro). As lianas florescem, principalmente, no final do verão (março-abril). Néctar e pólen são oferecidos às abelhas ao longo de todo o ano, com diminuição da oferta nos meses de inverno (julho-setembro).

EFEITO DO ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO DAS FLORES E DA APLICAÇÃO DE FUNGICIDAS NO CONTROLE DA PODRIDÃO FLORAL DOS CITROS

O presente trabalho teve por objetivo determinar os melhores estágios do desenvolvimento das flores de laranja-doce para o controle da Podridão Floral dos Citros (PFC), avaliando-se diversas épocas de aplicação e doses de fungicidas. Os estudos foram realizados em pomares de laranjas-'Natal' e 'Pêra' (Citrus sinensis [L.] Osbeck), onde foram marcados aleatoriamente ramos florais pertencentes à florada temporã (janeiro de 1994), caracterizando as fases de desenvolvimento de cada botão floral. Em um primeiro ensaio, avaliou-se o controle da doença através de pulverizações manuais, onde foram aplicados os seguintes tratamentos (doses por 1 L): a) testemunha; b) benomyl 0,5 g, no dia de marcação dos ramos (aplicação normal); c) benomyl 0,5 g, 3 a 4 dias depois da marcação (aplicação tardia); e d) benomyl 0,5 g em 2 aplicações, uma na marcação dos botões e outra uma semana depois. As aplicações foram feitas com pulverizadores manuais, molhando-se apenas os ramos com flores marcados. Em um segundo ensaio, avaliou-se o controle da doença através de pulverizações tratorizadas. Na laranja-'Natal', estudaram-se os seguintes tratamentos (doses por 2.000 L): a) testemunha; b) benomyl 1 kg em 4/jan; c) benomyl 1 kg em 4 e 11/jan; e d) benomyl 1 kg em 8/jan. Na laranja-'Pêra', os seguintes tratamentos foram aplicados (doses por 2.000 L): a) testemunha; b) benomyl 1 kg, 4/jan; c) benomyl 1 kg, 4 e 10/jan; d) benomyl 1 kg + captan 3,5 kg, 4/jan; e) benomyl 0,75 kg + captan 2,5 kg, 4/jan; f) benomyl 1 kg + captan 2,5 kg, 4/jan; g) benomyl 1 kg + captan 2,5 kg, 4/jan + benomyl 1 kg, 10/jan; h) benomyl 1,5 kg, 4/jan; e i) benomyl 1,5 kg, 4 e 10/jan. Avaliaram-se, em intervalos de dois dias, a freqüência e a época de ocorrência das lesões nas pétalas dos botões florais, a porcentagem de pegamento e o índice de cálices retidos de cada parcela. Pelos resultados, pôde-se concluir que o benomyl é eficiente no controle da PFC em doses de 0,5-0,75 g.L-1, e sua resposta podem ser obtida em floradas temporãs tratadas nos estágios de predominância de botões redondos brancos até o período anterior à antese.

MORFOLOGIA FLORAL DA GOIABEIRA SERRANA (Feijoa sellowiana) E SUAS IMPLICAÇÕES NA POLINIZAÇÃO

Esse estudo teve por objetivo caracterizar variações na arquitetura floral da Feijoa sellowiana e determinar sua influência sobre a polinização. Foram avaliados o comprimento do pistilo, a distância entre estigma e estames, o diâmetro de abertura e a distribuição dos estames na flor, com base em 7 flores de 15 acessos do Banco de Germoplasma da espécie. Distinguiram-se 3 classes de distâncias médias entre estigma e estames: 0,2 (C1), 0,7 (C2) e 1,2 cm (C3), e duas classes de distribuição de estames na flor (radial e aleatória). Sorteou-se uma planta por classe de distância entre estigma e estames, a qual teve 50 flores marcadas para cada um dos seguintes tratamentos: T1-polinização aberta; T2-tela contra pássaros e T3-tela contra pássaros e insetos. A frutificação foi de 47% em T1 para C2 e de 22% para C3, diferença que pode ser devida ao genótipo e/ou alternância de produção. No T2, a frutificação foi 31% em C2, 15,4% em C1 e 3% em C3. A superioridade de T1 sobre T2 pode ser devida à polinização por pássaros. Essa superioridade foi mais expressiva em C3 do que em C2, o que sugere que C3 é mais dependente de pássaros. A frutificação em T2 pode ainda evidenciar a polinização por insetos e foi menor para C3, o que pode estar sendo causado pelo maior afastamento do estigma. A frutificação em T3 para C1 (7%) e C2 (15%) sugere que o vento ou a autopolinização também possam efetuar a polinização.

Targeting Cytokines: Production and Characterization of Anti-TNF-α scFvs by Phage Display Technology.

The antibody display technology (ADT) such as phage display (PD) has substantially improved the production of monoclonal antibodies (mAbs) and Ab fragments through bypassing several limitations associated with the traditional approach of hybridoma technology. In the current study, we capitalized on the PD technology to produce high affinity single chain variable fragment (scFv) against tumor necrosis factor-alpha (TNF- α), which is a potent pro-inflammatory cytokine and plays important role in various inflammatory diseases and malignancies. To pursue production of scFv antibody fragments against human TNF- α, we performed five rounds of biopanning using stepwise decreased amount of TNF-α (1 to 0.1 μ g), a semi-synthetic phage antibody library (Tomlinson I + J) and TG1 cells. Antibody clones were isolated and selected through enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) screening. The selected scFv antibody fragments were further characterized by means of ELISA, PCR, restriction fragment length polymorphism (RFLP) and Western blot analyses as well as fluorescence microscopy and flow cytometry. Based upon binding affinity to TNF-α , 15 clones were selected out of 50 positive clones enriched from PD in vitro selection. The selected scFvs displayed high specificity and binding affinity with Kd values at nm range to human TNF-α . The immunofluorescence analysis revealed significant binding of the selected scFv antibody fragments to the Raji B lymphoblasts. The effectiveness of the selected scFv fragments was further validated by flow cytometry analysis in the lipopolysaccharide (LPS) treated mouse fibroblast L929 cells. Based upon these findings, we propose the selected fully human anti-TNF-α scFv antibody fragments as potential immunotherapy agents that may be translated into preclinical/clinical applications.

Diferenciação floral do abacaxizeiro cv. SNG-3 em função da idade da planta e da aplicação do carbureto de cálcio

Objetivando determinar a influência de carbureto de cálcio na diferenciação floral do abacaxizeiro, cv. SNG-3, nas condições de Rio Branco-AC, foi realizado um experimento, no período de 05/1999 a 12/2000, utilizando-se de mudas tipo filhote selecionadas por peso (250-300 gramas), plantadas em 12 de maio de 1999. O delineamento experimental foi o de blocos casualizados em esquema fatorial, sendo combinados os fatores idades de indução (8; 10 e 12 meses após o plantio) e horários de aplicação manhã (7h 30 ± 20') e tarde (15h 30 ± 20'), além da testemunha (indução natural). A indução foi feita com carbureto de cálcio, em pedras com peso médio de 0,8 g/planta em única aplicação. O carbureto de cálcio estimulou a floração do abacaxizeiro, com melhor resposta, quando aplicado a partir dos 10 meses do plantio, antecipando a colheita em 100 dias. A indução floral mais tardia, aos 10 e 12 meses de idade, favorece a produção de frutos mais pesados, menos ácidos e com maior teor de sólidos solúveis, com ciclos de 475 dias a 558 dias, respectivamente. O horário de aplicação do carbureto de cálcio, pela manhã, influenciou a altura e a floração das plantas, sem alterar a qualidade (peso, acidez e SST) dos frutos de abacaxi cv. SNG-3.