La supplémentation nutritionnelle dans la prévention et le traitement des troubles cognitifs associés à la maladie d’Alzheimer

Cette recension systématique analyse 19 essais cliniques randomisés contre placebo qui mesurent l’effet de suppléments d’oméga-3, de vitamines B (B6, B9 et B12), ou de vitamines antioxydantes (C et E), sur le fonctionnement cognitif d’aînés avec ou sans trouble cognitif. Les bases de données consultées pour la recherche des articles sont Cochrane Library, Current Contents, EBSCO, EMBASE, MEDLINE et PsycNet. Les mots clés utilisés sont «alzheimer’s disease», or «mild cognitive impairment», or «cognitive decline»; and «dietary supplements» or «vitamin C», or «vitamin E», or «alpha-tocopherol», or «vitamin B», or «cobalamin», or «folic acid», or «omega 3», or «fatty acids»; and «prevention», or «treatment». La recherche inclut les articles publiés en anglais et en français, de 1999 à juin 2014. Les différents suppléments à l’étude sont bien tolérés et sécuritaires. Des résultats significatifs sont enregistrés sur des mesures cognitives suite à la supplémentation en oméga-3, et en vitamines B, chez des participants sans trouble cognitif ou avec un diagnostic de trouble cognitif léger. Chez les participants atteints de la maladie d’Alzheimer, des résultats significatifs sont surtout enregistrés sur des mesures fonctionnelles, de symptômes psychologiques et comportementaux, ou de qualité de vie, suite à l’administration d’un supplément nutritionnel. La présence d’une hétérogénéité importante dans la méthodologie des essais cliniques limite toutefois les conclusions quant à la pertinence clinique de ces traitements. L’établissement de lignes directrices suite à un consensus d’experts s’avère nécessaire afin d’uniformiser la recherche sur cette nouvelle piste d’intervention dans la prévention et le traitement de la maladie d’Alzheimer.

Sources de variation intra-populationelle de la morphologie des otolithes: asymétrie directionnelle et régime alimentaire

Otoliths are calcified structures located in Osteichthyes’ inner ear that are involved in audition and balance. Their morphology is used as an indicator of various ecological processes or properties. This application requires identifying the endogenous and exogenous factors that act simultaneously as sources of shape variation. This thesis aims at detecting and quantifying the relative contributions of directional asymmetry and diet to otolith shape variation at the intra-population level. Directional asymmetry between left and right otoliths was found in flat-fishes, the blind-side otolith being always longer and larger, whereas it was negligible in round-fishes. However, asymmetry amplitude never exceeded 18 %, which suggests evolutionary canalization of otolith shape symmetry. A correlation between global diet and otolith was detected in 4 species studied in situ. Diet composition contributed more than food amount to morphological variation and affected otolith shape both globally and locally. An experimental study on sea bass (Dicentrarchus larbrax) showed that diet composition in terms of essential polyunsaturated fatty acids at larval stage affects otolith morphogenesis during juvenile stage without impacting on individuals’ somatic growth. This result suggests a direct effect of diet on otolith shape and not an indirect one through the somatic-otolith growth relationship. This effect disappeared at later stages, morphogenetic trajectories converging back to a similar shape, which suggests ontogenetic canalization of otolith shape.

Effet de différents ratios d’acides linoléique/α-linolénique et de l’entérolactone sur les marqueurs du métabolisme des lipides, d’inflammation et de stress oxydatif dans un modèle in vitro de culture de tissus hépatiques bovins

Chez la vache laitière à haut rendement, la période de transition entourant la parturition est généralement accompagnée d’un déficit énergétique, d’un métabolisme des lipides perturbé et d’une augmentation de l’inflammation et du stress oxydatif. Afin d’améliorer la balance énergétique et de diminuer certains effets négatifs associés à la période de transition, il est fréquent que les producteurs administrent des diètes riches en lipides (ex. Mégalac®, riche en acide palmitique) aux vaches laitières à haut rendement. Par exemple, l’ajout de lipides saturés à la ration améliore la balance énergétique et diminue l’accumulation des triglycérides dans le foie. Cependant, plusieurs troubles métaboliques demeurent, tels que l’inflammation et le stress oxydatif, pouvant être observés entre autres au niveau du foie. Comme alternative aux lipides saturés, l’ajout d’acides gras polyinsaturés (AGPIs) pourrait contribuer à améliorer la balance énergétique tout en diminuant certains effets négatifs associés à la période de transition. Toutefois, les AGPIs sont sujets aux phénomènes de peroxydation ce qui pourrait augmenter le stress oxydatif chez l’animal. Pour limiter ces dommages oxydatifs, l’utilisation de la graine de lin entière, riche en acides gras oméga-3 (n-3) et en lignans (antioxydants), en supplément alimentaire apparaît comme une avenue prometteuse. Des travaux antérieurs rapportent qu’une supplémentation en différents dérivés de la graine de lin (ex. AGPIs, lignans) module l’expression de certains gènes impliqués dans la réponse au stress oxydatif et le métabolisme des lipides dans la glande mammaire de la vache laitière. Cependant, il n’existe aucune étude rapportant l’effet de divers composés de la graine de lin sur le métabolisme lipidique et certains marqueurs de stress oxydatif dans le foie de la vache laitière. Ce projet de recherche a été réalisé afin de déterminer les effets de différents ratios d’acides linoléique (LA)/acide alpha-linolénique (ALA) (n-6/n-3, AGPI) en présence ou non d’entérolactone (ENL, lignan mammalien) sur (1) l’expression hépatique de gènes liés au métabolisme des lipides, au processus inflammatoire et au stress oxydatif, (2) les dommages aux lipides et aux protéines et (3) l’activité de l’enzyme superoxyde dismutase (SOD) dans le foie de la vache laitière en début de lactation. Un modèle in vitro de culture de tissu hépatique en tranches minces a été utilisé puisqu’il permet de préserver les interactions cellules-matrice et entre les cellules. Les gènes sélectionnés ont été choisis en se référant à diverses études antérieures et incluent certains gènes différentiellement exprimés dans le foie et la glande mammaire de la vache laitière en période de transition. Des régulateurs de la transcription (ex. MLXIPL et SREBF1), de même que leurs gènes cibles ont été priorisés. Les tissus issus de biopsies hépatiques de vaches Holstein en début de lactation ont été mis en culture et soumis à huit traitements composés de différents ratios d’AGPIs n-6/n-3, d’ENL et d’une combinaison des deux. Suite à ces traitements, les niveaux d’ARNm des gènes sélectionnés ont été mesurés par PCR quantitatif (RT-qPCR). Les dommages aux lipides ont été mesurés par l’essai des « thiobarbituric acid reactive substances » (TBARS) et les dommages aux protéines par une analyse des protéines carbonyles. Finalement, un essai enzymatique a été effectué pour mesurer l’activité de la SOD, une enzyme jouant un rôle dans le système de défense contre les radicaux libres. Les résultats de cette étude démontrent que l’ajout d’AGPIs (LA et ALA) dans le milieu de culture augmente l’expression de certains gènes liés au stress oxydatif (NQO1, PRDX3, PTGS2 et SOD1) et diminue l’expression de plusieurs gènes liés à l’activité lipogénique (ACACA, FASN, SCD et SREBF1). L’addition d’ENL dans le milieu de culture augmente l’abondance de l’ARNm des gènes cibles de MLXIPL, soit FASN et SCD, deux gènes impliqués dans l’activité lipogénique. Cette régulation à la hausse suggère qu’une supplémentation en tourteau ou en farine de lin (riche an lignans) en début de lactation pourrait avoir des effets non désirés et augmenter le risque de stéatose hépatique. Les analyses de peroxydation des lipides ont révélés une augmentation des dommages aux lipides en présence des AGPIs et un retour aux valeurs du traitement contrôle lorsque l’ENL est ajouté aux AGPIs. Une augmentation similaire est observée pour l’activité de la SOD avec l’ajout des AGPIs au milieu de culture, ainsi qu’un retour aux valeurs contrôle lorsque l’ENL est ajouté aux AGPIs. Ces résultats suggèrent qu’une supplémentation en graines de lin entières serait bénéfique en début de lactation puisque les AGPIs pourraient diminuer l’activité lipogénique au niveau du foie, alors que les lignans présents naturellement dans l’écorce de la graine de lin, pourraient réduire le stress oxydatif et les dommages aux lipides provoqués par des niveaux élevés en AGPIs.

Phenotypic correlations of fatty acid composition among intramuscular, subcutaneous and intermuscular fat tissues in concentrate-fed beef cattle of differing genotypes

[EN]In an attempt to predict intramuscular fatty acid composition using easily accessible fat depots, between-tissue correlations were studied in 75 Asturiana de los Valles bulls with different levels of muscular hypertrophy, and 25 Asturiana de la Montan˜ a bulls. Trans-18:1 in intramuscular fat was highly and positively correlated with levels in subcutaneous and intermuscular fats, while levels of total n-3 were not correlated. Predicting intramuscular fatty acid composition using easily accessible depots is thus possible for some fatty acids exhibiting high between-tissue correlations (e.g., trans-18:1) but breed and tissue specific deposition may limit this for others (e.g., n-3 fatty acids).

Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.

Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN.

Modulation de l’expression du gène CFTR par le produit du gène FIC1 responsable de la cholestase familiale intra-hépatique progressive de type 1 : Identification des mécanismes moléculaires impliqués

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise

Caractérisation structurale de la molécule HLA-DO

Les molécules classiques du CMH de classe II présentent des peptides antigéniques aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation est régulée par deux molécules non classiques : HLA-DM catalyse la relâche de CLIP et le chargement de peptides et HLA-DO module l’activité de DM. Une expression insuffisante en cellules d’insectes empêche les expériences de cristallisation de DO, probablement en raison de sa conformation, rendant DO instable et inapte à sortir du réticulum endoplasmique (RE). DM corrige la conformation de DO et permet sa sortie du RE. Aussi, par ses ponts disulfures uniques, DM adopte une conformation stable et peut sortir du RE sans lier d’autre molécule. Nous avons tenté de corriger la conformation de DO en introduisant des cystéines pour établir des ponts homologues à ceux de DM. La conformation de DO ne fut pas corrigée. Par ailleurs, nous avons augmenté l’expression de DO en introduisant une séquence partielle de Kozak. Nous avons aussi étudié l’effet de DM sur l’expression de DO. DM a favorisé l’expression de DO, probablement en diminuant sa dégradation. Chaque chaîne du dimère DMαβ est impliquée dans l’oxydation de sa chaîne partenaire. La conformation non-optimale de DO pourrait traduire une incapacité des chaînes α ou β à favoriser l’oxydation de sa partenaire; DM corrigerait ce problème. Notre analyse d’immunobuvardage de type Western a toutefois démontré que DM ne modifie pas l’état d’oxydation de DOα et DOβ. Finalement, nous avons étudié l’interaction DO-DM. L’acide aminé DOαE41 est impliqué dans cette liaison. Certains des acides aminés entre α80 et α84 pourraient être impliqués. Nous avons muté des acides aminés de cette région de DOα. Les résidus testés ne semblent pas impliqués dans la liaison DO-DM. L’obtention de la structure tridimensionnelle de DO et la caractérisation de son état oxydatif et de sa liaison à DM permettront de mieux comprendre son rôle.

Développement d’une méthode d’estimation du contenu en glutamine des aliments

Cette étude vise à estimer l’apport en glutamine (Gln) alimentaire chez des athlètes soumis à un protocole de supplémentation en glutamine ainsi qu’à clarifier les informations diffusées au grand public en ce qui concerne les sources alimentaires de glutamine. Des études cliniques ont démontré que la supplémentation en glutamine pouvait réduire la morbidité et la mortalité chez des sujets en phase critique (grands brulés, chirurgie…). Le mécanisme en cause semble impliquer le système immunitaire. Cependant, les études chez les sportifs, dont le système immunitaire a de fortes chances d’être affaibli lors de périodes d’entraînement prolongées impliquant des efforts longs et intenses, n’ont pas été concluantes. Or, ces études négligent systématiquement l’apport alimentaire en glutamine, si bien qu’il est probable que les résultats contradictoires observés puissent en partie être expliqués par les choix alimentaires des sujets. Puisque la méthode conventionnelle de dosage des acides aminés dans les protéines alimentaires transforme la glutamine en glutamate, les tables de composition des aliments présentent la glutamine et le glutamate ensemble sous la dénomination « glutamate » ou « Glu », ce qui a comme conséquence de créer de l’ambiguïté. La dénomination « Glx » devrait être utilisée. Partant de la probabilité qu’un apport en Glx élevé soit un bon indicateur de l’apport en glutamine, nous avons créé un calculateur de Glx et avons évalué l’alimentation de 12 athlètes faisant partie d’une étude de supplémentation en glutamine. Nous avons alors constaté que l’apport en Glx était directement proportionnel à l’apport en protéines, avec 20,64 % ± 1,13 % de l’apport protéique sous forme de Glx. Grâce à quelques données sur la séquence primaire des acides aminés, nous avons pu constater que le rapport Gln/Glx pouvait être très variable d’un type de protéine à l’autre. Alors que le ratio molaire Gln/Glx est de ~95 % pour les α et β-gliadines, il n’est que de ~43 % pour la caséine, de ~36 % pour la β-lactoglobuline, de ~31 % pour l’ovalbumine et de ~28 % pour l’actine. Il est donc possible que certaines protéines puissent présenter des avantages par rapport à d’autres, à quantité égale de Glx.

Regulation of the memory T cell development and islet beta-cell survival by DAPK-related apoptosis-inducing protein kinase 2 (Drak2)

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète.

Étude du polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline chez des espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules en vue de développer des marqueurs moléculaires

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA), classés dans le phylum Glomeromycota, ne peuvent pas être facilement identifiés par la morphologie de leurs spores et leurs mycélia à l'intérieur ou à l'extérieur des racines de leurs hôtes. Ce problème fondamental d'identification rend l'étude de leur diversité, en particulier dans leur habitat naturel (sol et racine) extrêmement difficile. Les gènes ribosomaux ont été largement utilisés pour développer des amorces spécifiques et en inférer des arbres phylogénétiques. Cependant, ces gènes sont très polymorphes et existent en plusieurs copies dans le génome des CMA, ce qui complique l’interprétation des résultats. Dans notre étude, nous avons étudié le polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline, présent en faible nombre de copies dans le génome des CMA, afin d’obtenir de nouvelles séquences nucléotidiques pour développer des marqueurs moléculaires. Les gènes β-tubuline amplifiés à partir de l'ADN génomique de cinq espèces du genre Glomus ont été clonés et séquencés. L’analyse des séquences indique un polymorphisme intraspécifique chez trois espèces de CMA. Deux séquences paralogues très variables ont été nouvellement identifiées chez les G. aggregatum, G. fasciculatum et G. cerebriforme. Aucun polymorphisme n’a été détecté chez les G. clarum et G. etunicatum. Toutes les séquences montrent la présence de deux introns hautement variables. La majorité des substitutions ont été localisées dans les exons et sont synonymes à 90%. La conservation des acides aminés suggère un niveau élevé de sélection négative sur le gène β-tubuline et nous permet de confirmer que les CMA représentent un ancien groupe fongique (400 million d’années). L’analyse phylogénétique, réalisée avec vingt et une séquences nucléotidiques du gène β-tubuline, a révélé que les séquences des Glomaceae forment un groupe monophylétique bien supporté, avec les Acaulosporaceae et Gigasporaceae comme groupe frère. Les séquences paralogues nouvellement identifiées chez les G. aggregatum et G. fasciculatum n'ont pas été monophylétiques au sein de chaque espèce. Les oligonucléotides ont été choisis sur la base des régions variables et conservées du gène β-tubuline. Le test PCR des amorces β-Tub.cerb.F/ β-Tub.cerb.R a révélé des bandes spécifiques de 401 pb pour les séquences paralogues du G. cerebriforme. Deux paires d’amorces ont été développées afin d’identifier les séquences du groupe nommé Tub.1. Les tests PCR nous ont permis d’identifier certaines séquences du groupe Tub.1. Une paire d’amorce β-Tub.2.F/ β-Tub.2.R nous a permis d’identifier certaines séquences paralogues du groupe nommé Tub.2. L’analyse d’autres gènes combinée à celle du gène β-tubuline permettra le développement de marqueurs moléculaires plus spécifiques pour l’identification de CMA.

Studies toward the total synthesis of natural and unnatural aeruginosins

Nous avons démontré l’utilité du groupement protecteur tert-butylsulfonyle (N-Bus) pour la chimie des acides aminés et des peptides. Celui-ci est préparé en deux étapes, impliquant la réaction d’une amine avec le chlorure de tert-butylsulfinyle, suivie par l’oxydation par du m-CPBA, pour obtenir les tert-butylsulfonamides correspondants avec d’excellents rendements. Le groupement N-Bus peut être clivé par traitement avec 0.1 N TfOH/DCM/anisole à 0oC en 10h pour régénérer le sel d’ammonium. Une variété d’acides aminés N-Bus protégés ainsi que d’autres aminoacides peuvent alors être utilisés pour préparer divers dipeptides et tripeptides. A l’exception du groupe N-Fmoc, les conditions de déprotection du groupe N-Bus clivent également les groupements N-Boc, N-Cbz et O-Bn. Une déprotection sélective et orthogonale des groupes N-Boc, N-Cbz, N-Fmoc et O-Bn est également possible en présence du groupe protecteur N-Bus. Le nouvel acide aminé non-naturel (3R, 2R) 3–méthyl-D-leucine (β-Me-Leu) et son régioisomère 2-méthyle ont été synthétisés par ouverture d’une N-Ts aziridine en présence d’un excès de LiMe2Cu. Chacun des régioisomères du mélange (1:1,2) a été converti en la méthylleucine correspondante, puis couplé à l’acide D-phényllactique puis au motif 2-carboxyperhydroindole 4-amidinobenzamide en présence de DEPBT. Des élaborations ultérieures ont conduit à des analogues peptidiques non-naturels d’aeruginosines telles que la chlorodysinosine A. Les deux analogues ont ensuite été évalués pour leur activité inhibitrice de la thrombine et la trypsine. La présumée aeruginosine 3-sulfate 205B et son anomère β ont été synthétisés avec succès à partir de 5 sous-unités : la 3-chloroleucine, l’acide D-phényllactique, le D-xylose, le 2-carboxy-6-hydroxyoctahydroindole et l’agmatine. La comparaison des données RMN 1H et 13C reportées avec celles obtenues avec l’aeruginosine synthétique 205B révèle une différence majeure pour la position du groupe présumé 3'-sulfate sur l’unité D-xylopyranosyle. Nous avons alors synthétisés les dérivés méthyl-α-D-xylopyranosides avec un groupement sulfate à chacune des positions hydroxyles, afin de démontrer sans ambiguïté la présence du sulfate en position C-4' par comparaison des données spectroscopiques RMN 1H et 13C. La structure de l’aeruginosine 205B a alors été révisée. Une des étapes-clés de cette synthèse consiste en la formation du glycoside avec le groupe hydroxyle en C-6 orienté en axial sur la sous-unité Choi. Le 2-thiopyridylcarbonate s’est avéré une méthode efficace pour l’activation anomérique. Le traitement par AgOTf et la tétraméthylurée en solution dans un mélange éther-DCM permet d’obtenir l’anomère α désiré, qui peut alors être aisément séparé de l’anomère β par chromatographie

Sélection des substrats lors de l’exercice prolongé avec ingestion de glucides : études par traçage au 13C

Les principaux substrats oxydés à l’exercice, soit les glucides, les lipides et les pro- téines ne contribuent pas tous au même niveau à la fourniture d’énergie lors de l’effort prolongé. De plus, le glucose peut provenir de différentes sources endogènes (muscle, foie) et exogènes. Plusieurs facteurs peuvent influencer leur contribution respective incluant : la masse musculaire impliquée et l’entraînement préalable, le sexe, l’état nutritionnel et les conditions environnementales. L’utilisation d’isotopes stables, tels que le carbone 13 (13C), combinée à la calorimétrie indirecte respiratoire corrigée pour l’excrétion d’urée dans l’urine et la sueur, permet de différencier les substrats endogènes et exogènes et d’évaluer la contribution de leur oxydation à la fourniture d’énergie. Ces méthodes d’investigation permettant d’apprécier la sélection des substrats lors de l’exercice prolongé avec ingestion de glucose ont permis d’effectuer les comparaisons qui ont fait l’objet des trois études de cette thèse. Dans la première étude, la sélection des substrats au cours d’un effort prolongé effectué avec les membres inférieurs ou les membres supérieurs a été comparée avec et sans ingestion de glucose. Une différence modeste fut observée entre la sélection des substrats selon le mode d’exercice avec l’ingestion d’eau, celle-ci favorisant légèrement l’oxydation des glucides lors de l’effort avec les membres supérieurs. La quantité de glucose exogène oxydée était plus faible lors de l’exercice avec les membres supérieurs qu’avec les membres supérieurs, mais sa contribution plus importante, conséquence d’une dépense énergétique plus faible. Dans la deuxième étude, on a comparé la sélection des substrats chez des sujets mas- culins et féminins et les effets d’une alimentation enrichie en glucides ou de l’ingestion de glucose, au cours d’un exercice prolongé d’une durée de deux heures. On reconnaît généralement que, pour une même puissance relative, les femmes utilisent moins de glucides et davantage de lipides que les hommes. Les effets séparés d’une alimentation riche en glucides ou de l’ingestion de glucose pendant l’exercice sur la sélection des substrats furent pourtant similaires chez les deux sexes. L’effet combiné des deux procédures de supplémentation est toutefois plus important chez la femme que chez l’homme, soutenant l’hypothèse qu’un léger déficit en glucides soit présent chez les femmes. Dans la troisième étude, l’oxydation des substrats et particulièrement celle d’amidon exogène au cours d’une marche prolongée à une faible puissance de travail a été décrite. Les individus qui pratiquent des activités physiques prolongées à des intensités faibles (< 40 %VO2max) sont encouragés à ingérer des glucides et de l’eau pendant l’effort, mais la contribution de leur oxydation à la fourniture d’énergie est relativement peu connue. Nous avons montré que, contrairement aux observations précédemment effectuées à jeun sans ingestion de glucides pendant l’effort, les glucides (incluant de source exogène) peuvent fournir une très grande partie de l’énergie lorsqu’ils sont ingérés à des intervalles réguliers au cours de l’exercice prolongé. Dans l’ensemble, les résultats des études expérimentales présentées dans cette thèse montrent que les glucides ingérés peuvent fournir une grande proportion de l’énergie pendant l’exercice prolongé. Toutefois, le mode d’exercice, le sexe et la puissance de travail mènent à des variations qui sont en grande partie liées à une dépense énergétique variable selon les conditions et les groupes d’individus ayant des caractéristiques différentes.

Évaluation gastro-intestinale chez des chiens présentant un comportement de léchage excessif de surface

L’objectif de cette étude était de démontrer que le léchage excessif de surface (LES) chez le chien représente un signe clinique d’un trouble digestif sous-jacent plutôt qu’un trouble obsessionnel compulsif. Vingt chiens présentés pour LES (groupe L) ont été divisés en 2 sous-groupes de 10 chiens chacun : L0, sans, et LD, avec des signes cliniques digestifs concomitants. Dix chiens en santé ont été assignés à un groupe contrôle (groupe C). Une évaluation comportementale complète, un examen physique et neurologique ont été réalisés avant un bilan diagnostic gastro-intestinal (GI) complet (hématologie, biochimie, analyse urinaire, mesure des acides biliaires pré et post-prandiaux et de l’immunoréactivité spécifique de la lipase pancréatique canine, flottaison fécale au sulfate de zinc, culture de selles, échographie abdominale et endoscopie GI haute avec prise de biopsies). En fonction des résultats, un interniste recommandait un traitement approprié. Les chiens étaient suivis pendant 90 jours durant lesquels le comportement de léchage était enregistré. Des troubles GI ont été identifiés chez 14/20 chiens du groupe L. Ces troubles GI sous-jacents incluaient une infiltration éosinophilique du tractus GI, une infiltration lymphoplasmocytaire du tractus GI, un retard de vidange gastrique, un syndrome du côlon irritable, une pancréatite chronique, un corps étranger gastrique et une giardiose. Une amélioration >50% en fréquence ou en durée par rapport au comportement de léchage initial a été observée chez une majorité de chiens (56%). La moitié des chiens ont complètement cessé le LES. En dehors du LES, il n’y avait pas de différence significative de comportement (p.ex. anxiété), entre les chiens L et les chiens C. Les troubles GI doivent être considérés dans le diagnostic différentiel du LES chez le chien.

Régulation de protéine C-réactive vasculaire dans le diabète de type 2

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans les pays occidentaux et représentent une complication majeure du syndrome métabolique. Il est maintenant largement admis que l’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique et que l’inflammation joue un rôle pathogénique majeur dans l’initiation et la progression de la maladie athéromateuse. Il a été démontré qu’une augmentation des niveaux sériques de la protéine c-réactive (CRP), une protéine de la phase aigüe et un important constituant de la réponse immunitaire de type inné, est associée à un risque cardiovasculaire accru. Ainsi, il a été documenté qu’une augmentation de CRP, tant chez les sujets sains que chez les sujets diabétiques, était associée à une augmentation du risque de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. De multiples évidences suggèrent que la CRP puisse non seulement constituer un marqueur de risque des maladies cardiovasculaires mais aussi représenter un facteur pro-athérogénique direct. La dysfonction endothéliale représente un des stades les plus précoces du processus athérosclérotique et un rôle de la CRP dans la pathogenèse de la dysfonction endothéliale est postulé. Outre son origine systémique, la CRP est produite dans la lésion athérosclérotique et par diverses cellules vasculaires, dont les cellules endothéliales. Afin d’élucider le rôle de la CRP vasculaire dans l’altération de la fonction endothéliale associée au syndrome métabolique, nous avons étudié la régulation de l’expression endothéliale de la CRP par les acides gras libres (AGL) et le rôle de la CRP endothéliale dans l’inhibition de la synthèse d’oxyde nitrique (NO) par les AGL. Nos résultats démontrent que :1) l’acide palmitique (PA) induit l’expression génique de CRP au niveau de cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs) en culture et, augmente, de manière dose-dépendante, l’expression protéique de la CRP; 2) La pré-incubation des HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la i) protéine kinase C (PKC), ii) du facteur nucléaire-kappa B, iii) des Janus kinases et des protéines de transduction et de régulation de la transcription et iv) des protéines kinases activées par les mitogènes prévient l’effet stimulant du PA sur l’expression protéique et génique de la CRP; 3) Le traitement des HAECs par le PA induit une augmentation de la production des espèces réactives oxygénées, un effet prévenu par les inhibiteurs de la PKC et par l’AICAR(5-amino-4-imidazole carboxamide 1-β-D-ribofuranoside), un activateur de la protéine kinase activée par l’AMP; 4) L’incubation des HAECs en présence de PA résulte enfin en une diminution de la production basale endothéliale de NO, un effet abrogé par la préincubation de ces cellules avec un anticorps anti-CRP. Dans l’ensemble, ces données démontrent un effet stimulant du PA sur l’expression de la CRP endothéliale via l’activation de kinases et de facteurs de transcription sensibles au stress oxydatif. Ils suggèrent en outre un rôle de la CRP dans la dysfonction endothéliale induite par les AGL.

Effets de plantes réputées antidiabétiques sur un modèle cellulaire hépatique de résistance à l’insuline induite par le palmitate

La pharmacopée Cris est riche en plantes médicinales et plusieurs d’entre elles sont étudiées par notre laboratoire pour leur potentiel antidiabétique. Certaines espèces ont démontré leur capacité à stimuler la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme qui favorise la translocation de transporteurs de glucose à la membrane (effet hypoglycémiant). L’AMPK stimule également d’autres fonctions, telle l’oxydation des graisses, dans le but de rétablir l’énergie cellulaire. Ce projet a comme objectifs d’évaluer, premièrement, le stress métabolique induit par huit des extraits dans des cellules musculaires et des hépatocytes, effet qui serait responsable de l’activation de l’AMPK. Ce stress peut être déterminé en mesurant l’acidification du milieu extracellulaire ainsi que la déplétion du contenu en ATP des cellules suite aux traitements. Le deuxième objectif est de mesurer l’efficacité des extraits à réduire le contenu en gras (oxydation des graisses) et à ainsi normaliser la résistance à l’insuline dans des hépatocytes rendus insulino-résistants. Les hépatocytes sont rendus résistants à l’insuline (condition fortement lié à l’obésité) via traitement avec un acide gras saturé, le palmitate. Les résultats montrent que la majorité des extraits semble induire un stress métabolique de courte durée dans les cellules. Parmi les extraits, seul un a réussi à faire diminuer significativement le taux de triglycérides intracellulaire suite au traitement au palmitate sans toutefois améliorer la sensibilité à l’insuline. En conclusion, le potentiel hypoglycémiant des extraits serait du à leur capacité à affecter la respiration mitochondriale (stress métabolique). Toutefois, leur capacité à améliorer la sensibilité à l’insuline n’a pu être établie.